买专利卖专利找龙图腾,真高效! 查专利查商标用IPTOP,全免费!专利年费监控用IP管家,真方便!
申请/专利权人:山东大学
摘要:本发明涉及一种丙氨酰美登醇及其合成方法和应用。本发明截取了基因astC中编码A‑T结构域的DNA片段和基因contig_44136中编码TE结构域的DNA片段,插入到整合型表达载体pSBT11上形成杂合基因nrps,构建表达载体pSBT11‑nrps,实现了在珍贵橙色束丝放线菌突变株中异源表达非核糖体多肽合酶基因,进而制备丙氨酰美登醇的目的,并且还通过TE结构域替换,使杂合非核糖体多肽合酶可以更高效地识别细菌美登木素作为氨基受体,使得丙氨酰美登醇的产量达到了0.5mgL,有效克服了现有技术中存在的产量低的问题,降低了成本,可以用于并促进美登木素抗体偶联物药物的研究、生产和临床应用。
主权项:1.一种丙氨酰美登醇的合成方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将能够表达非核糖体多肽合酶的基因工程菌HGF052+pJTU824-asm18+pSBT11-nrps在28~30℃下,使用YMG固体培养基发酵培养10~14天,得到固体培养物;(2)将固体培养物切成1cm见方的小块,在20~30℃下用体积比为80:15:5的乙酸乙酯甲醇甲酸浸泡提取三次,合并提取液,减压及35~40℃的温度下浓缩至干,得粗提物;(3)将粗提物溶于水中,使用乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯相减压及35~40℃的温度下浓缩至干,得EA提取物;(4)将EA提取物溶于甲醇中,再经石油醚多次萃取,甲醇相减压及35~40℃的温度下浓缩至干,得甲醇提取物;(5)将甲醇提取物依次经反相硅胶柱层析分离,凝胶柱层析分离,薄层层析和正相硅胶柱层析分离,然后将组分相同的洗脱液进行合并,得到丙氨酰美登醇;其中,步骤(1)中所述基因工程菌HGF052+pJTU824-asm18+pSBT11-nrps的构建方法,包括步骤如下:(a)以非核糖体多肽合酶基因astC为模板进行PCR扩增,扩增得到基因astC中编码A-T结构域的DNA片段,PCR引物序列如下:astC-F:5′-AAAGGAGGCGGACATATGGAGACGAACATGCTGGTGCAGG-3′,astC-R:5′-CGACCCACGGAGGTCGAAGAAGCTGTCGCGCGGACCGACC-3′;所述非核糖体多肽合酶基因astC基因库登记号为KF813023.1,所述基因astC中编码A-T结构域的DNA片段的序列如SEQIDNO.1所示;(b)以人工合成基因contig_44136为模板进行PCR扩增,扩增得到基因contig_44136中编码TE结构域的DNA片段,PCR引物序列如下:44136-F:5′-CGCGACAGCTTCTTCGACCTCCGTGGGTCGGACGTGCTCG-3′,44136-R:5′-GACATGATTACGAATTCAGGGCCGGGTCGGGTCCGTCCCG-3′;所述人工合成基因contig_44136的序列如SEQIDNO.4所示;所述基因contig_44136中编码TE结构域的DNA片段的序列如SEQIDNO.2所示;(c)将步骤(a)中所述编码A-T结构域的DNA片段和步骤(b)中所述编码TE结构域的DNA片段顺序插入到整合型表达载体pSBT11上的NedI和EcoRI限制性酶切位点之间,形成杂合基因nrps,所述杂合基因nrps位于ermE*启动子的下游并受其调控,得到质粒载体pSBT11-nrps;所述杂合基因nrps序列如SEQIDNO.3所示;(d)将质粒载体pSBT11-nrps转化大肠杆菌ET12567pUZ8002,获得大肠杆菌-放线菌接合转移供体菌ET12567pUZ8002pSBT11-nrps;(e)将供体菌ET12567pUZ8002pSBT11-nrps与珍贵橙色束丝放线菌突变株HGF052+pJTU824-asm18的菌丝体进行接合转移,得到基因工程菌HGF052+pJTU824-asm18+pSBT11-nrps;所述丙氨酰美登醇的化学结构如下所示: 。
全文数据:
权利要求:
百度查询: 山东大学 一种丙氨酰美登醇及其合成方法和应用
免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息,力求客观、公正,但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解,仅供参考使用,不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。