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【发明授权】平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法_哈尔滨莱博通药业有限公司_201310251987.X 

申请/专利权人:哈尔滨莱博通药业有限公司

申请日:2013-06-21

公开(公告)日:2017-06-20

公开(公告)号:CN104231057B

主分类号:C07K9/00(2006.01)I

分类号:C07K9/00(2006.01)I;C07K1/18(2006.01)I;C07K1/16(2006.01)I

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2017.06.20#授权;2017.06.16#专利申请权的转移;2016.12.21#专利申请权的转移;2015.09.30#著录事项变更;2015.01.14#实质审查的生效;2014.12.24#公开

摘要:本发明公开了一种平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法,将单分散聚苯乙烯二乙烯基苯层析介质单独使用或者与单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质组合使用,作为填料进行层析。本发明克服了原工艺周期长效率低、产品纯度低的不足,得到高纯度的平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物,纯度用HPLC方法测定,按面积百分比计,达到97%以上。将所述铜螯合物进一步经脱铜后,即得到高纯度的平阳霉素及其同族化合物,提高了临床用药的安全性。

主权项:一种平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法,其特征在于,选用单分散聚苯乙烯二乙烯基苯层析介质作为填料进行层析,粒径20~60μm,粒径波动范围5μm,孔径取平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物粗品用超纯水溶解加到用超纯水或流动相平衡的层析柱上,柱高与柱径比15~40:1,层析柱载量5~50mgml,用0~20%的甲醇、乙醇、丙酮水溶液等度洗脱或梯度洗脱,洗脱流速0.5~2mlmin·cm2,单次层析时间2~6小时;单次层析后,回收,同上法再经2~3次层析,即得高纯度的平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物,纯度在97%~100%。

全文数据:平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法技术领域[0001]本发明属药物化学及分离纯化技术领域,具体涉及一种平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法。背景技术[0002]平阳霉素(Pingyangmycin及其同族化合物博安霉素(Boanmycin、博宁霉素Boningmycin是由我国学者自主研制开发的抗肿瘤抗生素,其中平阳霉素和博安霉素已投入临床应用,它们都属博来霉素家族。进口的博来霉素bleomycin主要成分为博莱霉素A2和B2,平阳霉素与博来霉素A5的结构相同,博安霉素与博来霉素A6的结构相同,博宁霉素是博安霉素末端氨体游离氨基的乙酰化物。平阳霉素现被收载于中华人民共和国药典二部2010版),是我国临床较常用的抗癌药物。[0003]临床前研究表明,平阳霉素及其同族化合物博安霉素、博宁霉素对一系列的移植性肿瘤以及裸鼠移植的人体癌瘤均有显著疗效,同时对小鼠的急性毒性和肺毒性明显低于博莱霉素。[0004]临床研究表明,平阳霉素对头颈部癌瘤、淋巴瘤等有较好的疗效,尤其对于口腔科癌瘤有显著疗效。平阳霉素很少抑制脊髓造血系统及免疫功能,可与其他化疗药物联合,可用于因前期治疗造血功能已经受损的患者。目前平阳霉素临床应用已得到进一步扩展,尤其在用于治疗血管瘤、淋巴管瘤以及尖锐湿疣及眼科的翼状胬肉效果显著。近年来单克隆抗体与平阳霉素的偶联物在动物实验显示具有高度疗效作用,提示其在研制抗体靶向药物中的潜在价值【甄永苏等,抗肿瘤抗生素平阳霉素研究与临床应用40年,抗生素杂质,2009,V〇13410,577〜580】。博安霉素对头颈部肿瘤有显著的疗效,对脊髓造血系统及免疫功能影响小,且肺毒性低,并且对肝癌细胞也有较强的抑制作用。博宁霉素除抗肿瘤作用外,对银肩病、溢脂性皮炎和乳头瘤病毒引起的尖锐湿疣、扁平疣等有良好的作用。[0005]平阳霉素目前的生产工艺是先经微生物发酵产生平阳霉素等十余种组分组成的复合物,然后加入铜盐形成平阳霉素铜螯合物,再经反复离子交换柱层析分离纯化得到较高纯度的平阳霉素铜螯合物,再经脱铜处理,得到平阳霉素【许鸿章等,平阳霉素的分离和鉴别,药学学报,1980,voll510,609〜614】。博安霉素和博宁霉素的生产工艺与平阳霉素类似,都是由微生物发酵,然后形成铜螯合物,经过纯化后再脱铜得到博安霉素和博宁霉素【许鸿章等,争光霉素A6和它在争光霉素复合物的地位,药学学报,1988,V〇1239,667〜671】。博宁霉素也可以由博安霉素含铜品通过化学合成的方法乙酰化而得到博宁霉素含铜品,再脱铜得到博宁霉素。[0006]平阳霉素铜螯合物具有鲜艳的蓝色,较原化合物稳定,是平阳霉素及其同族化合物生产工艺中的重要中间体。由于平阳霉素及其同族化合物和铜螯合物为极性很大的水溶性成分,分离纯化有相当的难度,因此铜螯合物的纯度成为制约平阳霉素及其同族化合物最终产品质量的瓶颈。目前它们铜螯合物的分离纯化一直使用离子交换凝胶填料,主要为葡聚糖骨架的CM—sephadex—C一25填料。该填料溶胀率高,在不同的盐溶液中体积变化很大,为非刚性填料,不能加压,为达到较高的分离度,柱径比一股在30以上,使得每个循环的周期很长,无法实现快速分离,整体效率低下。同时由于CM—sephadex一C一25本身的分离度不是很高,造成有些杂质无法去除,使得最终产品的纯度不高,质量较低。中华人民共和国药典二部(2010版盐酸平阳霉素项下规定本品按干燥品计,含盐酸平阳霉素不得少于85.0%,明显低于一股化药的要求。目前在市场流通的盐酸平阳霉素冻干粉针剂,用药典的液相条件检测,按照面积百分比计,纯度在92%左右(如下表1及图1。博安霉素情况相似,这和当前的平阳霉素及其同族化合物和铜螯合物分离纯化的工艺水平密切相关。[0007]表1[0008]PDAChl254nm4nm[0009][0010]2012年药品不良反应监测年度报告表明,56.7%的药物不良反应源于注射剂。注射剂原料药的纯度影响到产品质量,直接关系到临床用药的安全性。因此,革新平阳霉素及其同族化合物和铜螯合物的分离纯化工艺,得到高纯度的平阳霉素及其同族化合物和铜螯合物,从而提高最终产品的质量,减少临床用药的不良反应,成为当前十分迫切的需要。发明内容[0011]本发明所要解决的技术问题在于提供一种平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法,通过制备高纯度的平阳霉素及其同族化合物包括博安霉素、博宁霉素)的铜螯合物,从而提升平阳霉素及其同族化合物的产品质量,提高临床用药的安全性。[0012]本发明以平阳霉素及其同族化合物原生产工艺中经微生物发酵,并加铜盐螯合得到的相应铜螯合物粗品为原料,经特定的分离纯化工艺制得高纯度的平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物。进一步经脱铜、干燥等后处理,即可得到高纯度的平阳霉素及其同族化合物产品。[0013]所述的平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法,可用以下两种方式进行:[0014]方法一:选用单分散聚苯乙烯二乙烯基苯层析介质作为填料进行层析,粒径20〜60μπι,粒径波动范围75%,单次层析时间2〜6小时。再经2〜3次层析,纯度可达到97%以上,不考虑循环层析,回收率25%,考虑循环层析,累积回收率可达到80%以上。如果用CM-sephadex-C-25填料,要达到类似的纯化效果,单次层析时间至少60〜100小时。使用单分散聚苯乙烯二乙烯基苯层析填料,相比CM-sephadex-C-25填料,效率可提高10〜16倍。[0016]方法二:将方法一所用的介质(单分散聚苯乙烯二乙烯基苯层析介质)与单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质组合,作为填料进行层析。[0017]所述的单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质,粒径30〜70μπι,粒径波动范围75%,单次层析时间7〜15小时。脱盐后用方法一中的介质再次层析。就单次层析而言比CM-sephadex-C-25填料,效率至少提高7〜10倍。用于纯度90%左右的样品纯化,纯度可提高5%以上,回收率50%。回收含铜品螯合物粗品,经以上组合循环层析1〜3次,可得到纯度97%以上的平阳霉素或其同族化合物的铜螯合物。[0020]两种填料组合使用,可以减少有机溶剂的用量,利于环保。而且组合使用,可以使单个杂质的含量更低。比如以下的组合使用方式,在实际应用中可以灵活地组合。[0021]将平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物粗品(纯度20%〜60%先用单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质纯化1〜3次后,再用分散聚苯乙烯二乙烯基苯层析介质纯化,直至纯度达到97%以上。[0022]或者将平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物粗品(纯度20%〜60%先用分散聚苯乙烯二乙烯基苯层析介质纯化1〜3次,再用单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质纯化,直至纯度达到97%以上。[0023]采用本发明上述纯化方法得到的平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物,用HPLC法检测,按照面积百分比计,其纯度为97%〜100%。[0024]将上述方法得到的高纯度的(纯度97%〜100%平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物经脱铜,及干燥等后处理,即可得到纯度97%以上的平阳霉素及其同族化合物产品。[0025]本发明中平阳霉素及其同族化合物的纯度以及它们相应铜螯合物的纯度,指用HPLC法测定,按面积归一法计算的纯度。[0026]需要说明的是,本发明的纯化方法也适用于,本发明中未提及具体名称的其它具有和平阳霉素结构类似的博莱霉素家族的化合物。[0027]有益效果:[0028]应用本发明的纯化方法,能够得到高纯度的平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物纯度97%〜100%,再经脱铜、干燥等后处理,即可得到高纯度的平阳霉素及其同族化合物广品,能大幅度提尚终广品质量,从而提尚临床用药的安全性。[0029]本发明的纯化方法效率高,不仅填料对主成分和杂质有更高的分离度,可以得到更高纯度的产品;同时由于填料的刚性强度好,膨胀系数低,耐压,分离中每个循环的周期大大缩短,生产效率提高7〜16倍。附图说明[0030]图1为2011年市售盐酸平阳霉素样品的HPLC图谱。[0031]图2为实施例3制得的平阳霉素铜螯合物的HPLC图谱。具体实施方式[0032]以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域的普通技术人员应当理解,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或等同替换,但这些修改或替换均落入本发明保护范围内。[0033]实施例1[0034]取3.0克平阳霉素铜螯合物粗品(含量55%,用超纯水溶解,上至事先用超纯水平衡的装有1]11丨?5*-30100人)系列填料的层析柱,填料直径2.5〇11,高40〇11。层析流速0.81111min·cm2。用乙醇-水体系按0%-15%直线梯度洗脱4个柱体积这里指的是填料的体积,下同),再用15%乙醇洗1个柱体积,最后用30%乙醇将柱上所有的色带全部下来。单次层析时间约为4.5小时,收集纯度85%以上的流份,减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度87.6%,回收率82%。将样品再次上至用超纯水平衡的装有UniPS™-30IOOA系列填料的层析柱,同以上操作,得到样品,纯度94.5%,回收率76%。再重复一次,收集纯度97%以上的流份,合并后减压浓缩蒸干,得到样品,纯度99.2%,回收率60%。将未达到纯度要求的样品合并,同前法反复过装有1]1^?5«-30100人)系列填料的层析柱,得到纯度99.3%的平阳霉素铜螯合物,累计回收率84%。[0035]实施例2[0036]取10克平阳霉素铜螯合物粗品(含量48%,用超纯水溶解,上至事先用超纯水平衡的装有UniPSTM-4010QA系列填料的层析柱,填料直径2.5cm,高40cm。层析流速0.8mlmin·cm2。用甲醇-水体系按0%-15%直线梯度洗脱4个柱体积,再用15%甲醇洗1个柱体积,最后用50%甲醇将柱上所有的色带全部下来。单次层析时间约为4.5小时,收集纯度85%以上的流份,减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度86.1%,回收率76%。将样品再次上至用超纯水平衡的装有UniPS™-40IOOA系列填料的层析柱,同以上操作,得到样品,纯度94.8%,回收率,75%。再重复一次,收集纯度97%以上的流份,合并后减压浓缩蒸干,得到样品,纯度98.7%,回收率61%。将未达到纯度要求的样品合并,同前法反复过装有UniPS™-40丨00A系列填料的层析柱,得到纯度99.0%的平阳霉素铜螯合物,累计回收率85%。[0037]实施例3[0038]取40克平阳霉素铜螯合物粗品(含量56%,用超纯水溶解,上至事先用10%甲醇平衡的装有UniPS™-40300A系列填料的层析柱,填料直径5.0cm,高150cm。层析流速1.8mlmin·cm2。用10%甲醇水溶液等度洗脱,共洗4个柱体积,最后用50%甲醇洗柱。单次层析时间为6小时,收集纯度85%以上的流份,减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度89.3%,回收率84%。将样品再次上至用10%甲醇平衡后的装有UniPS™-40300人系列填料的层析柱,同以上操作,收集纯度97%以上的流份,合并后减压浓缩蒸干,得到样品,纯度98.7%参看图2,回收率56%。将未达到纯度要求的样品合并,同前法反复过装有UniPS™-403©〇A系列填料的层析柱,得到纯度99.1%的平阳霉素铜螯合物,累计回收率89%。[0039]实施例4[0040]取3.0克平阳霉素铜螯合物粗品(含量43%,用超纯水溶解,上至事先用超纯水平衡的装有UniPS™-50500A系列填料的层析柱,填料直径2.5cm,高40cm。层析流速0.8mlmin·cm2。用丙酮-水体系按0%-15%直线梯度洗脱3个柱体积,再用15%丙酮洗1个柱体积,最后用30%丙酮洗柱。单次层析时间为4小时,收集纯度85%以上的流份,减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度86.5%,回收率83%。将样品再次上至用超纯水平衡的装有UniPS™-50500A系列填料的层析柱,同以上操作,得到样品,纯度95.3%,回收率78%。再重复一次,得到样品,纯度98.8%,回收率68%。将未达到纯度要求的样品合并,同前法反复过装有UniPS™-50500A系列填料的层析柱,得到纯度98.4%的平阳霉素铜螯合物,累计回收率87%。[0041]实施例5[0042]取3.0克平阳霉素铜螯合物粗品(含量45%,用超纯水溶解,上至事先用10%甲醇平衡的装有UniPS™-20800A系列填料的层析柱,填料直径2.5cm,高40cm。层析流速0.5mlmin·cm2。用10%甲醇水溶液等度洗脱,共洗4个柱体积,最后用50%甲醇洗柱。单次层析时间约为6小时,收集纯度85%以上的流份,减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度87.6%,回收率86%。将样品再次上至用10%甲醇平衡的装有UniPS™-20800A系列填料的层析柱,同以上操作,得到样品,纯度94.9%,回收率80%。再重复一次,得到样品,纯度97.6%,回收率56%。将未达到纯度要求的样品合并,同前法反复过装有UniPS™-20800A系列填料的层析柱,得到纯度98.2%的平阳霉素铜螯合物,累计回收率82%。[0043]实施例6[0044]取3.0克平阳霉素铜螯合物粗品(含量50%,用超纯水溶解,上至事先用超纯水平衡的装有UniMSP-50500A系列填料的层析柱,填料直径2.4cm,高50cm。层析流速0.8mlmin·cm2。先用0.05MNH4Cl洗脱,洗1个柱体积,然后依次用0.1MNH4Cl洗脱2个柱体积,0.2MNH4Cl洗脱4个柱体积,0.3MNH4Cl洗脱2个柱体积,0.4MNH4Cl洗脱2个柱体积,用0.5M的NH4Cl洗至柱上所有的色带全部下来。单次层析时间为12小时,收集纯度85%以上的流份,上至用超纯水平衡的装有UniPS™-4030〇A系列填料的层析柱直径2.5cm高40cm,上样完毕后用纯化水冲洗层析柱,待硝酸银检测无CF后,用20%甲醇洗脱,收集蓝色带。减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度86%,回收率83%。将样品用超纯水溶解,上至用超纯水平衡的装有UniMSP-50500A系列填料的层析柱同上法操作,同法脱盐后减压浓缩至干,得到纯度95.2%的样品,回收率84%。将样品用超纯水溶解,上至用10%甲醇平衡的装有UniPS™-40300A系列填料的层析柱,填料直径2.5cm,高40cm。层析流速0.8mlmin·cm2。用10%甲醇水溶液等度洗脱,共洗4个柱体积,最后用50%甲醇洗柱。收集纯度97%以上的流份,减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度99.1%,回收率65%。将未达到纯度要求的样品合并,同前法再过装有UniMSP-50500A系列填料的层析柱及装有UniPS™-40300A系列填料的层析柱,得到纯度99.2%的平阳霉素铜螯合物,累计回收率86%。[0045]实施例7[0046]取3.0克平阳霉素铜螯合物粗品(含量50%,用超纯水溶解,上至事先用10%甲醇平衡的装有UniPS™-4030〇A系列填料的层析柱,填料直径2.5cm,高40cm。层析流速0.8mlmin·cm2。用10%甲醇水溶液等度洗脱,共洗4个柱体积,最后用50%甲醇洗柱。单次层析时间为3.5小时,收集纯度85%以上的流份,减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度88%,回收率85%。将样品用超纯水溶解后上至用10%甲醇平衡的装有UniPS™-40300A系列填料的层析柱,同上法操作,得到纯度94.7%的样品,回收率78%。将样品用超纯水溶解,上至用超纯水平衡的装有1]1^1^?-50500人)系列填料的层析柱,填料直径2.4^,高503111。层析流速0.77mVmin·cm2。先用0.05MNH4Cl洗脱,洗1个柱体积,然后依次用0.1MNH4Cl洗脱2个柱体积,0.2MNH4Cl洗脱4个柱体积,0.3MNH4Cl洗脱2个柱体积,0.4MNH4Cl洗脱2个柱体积,用0.5M的NH4Cl洗至柱上所有的色带全部下来。收集纯度97%以上的流份,上至用超纯水平衡的装有UniPS™-40300A系列填料的层析柱2.5X40cm,上样完毕后用超纯水冲洗层析柱,待硝酸银检测无CF后,用20%甲醇洗脱,收集蓝色带。减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度99.3%,回收率61%。将未达到纯度要求的样品合并,同前法再过装有UniPS™-40300A系列填料的层析柱及装有UniMSP-505〇αΑ系列填料的层析柱,得到纯度99.1%的平阳霉素铜螯合物,累计回收率87%。[0047]实施例8[0048]取1.0克博安霉素铜螯合物粗品(含量42%,用超纯水溶解,上至事先用10%甲醇平衡的装有UniPS™-403α〇Α系列填料的层析柱,填料直径2.5cm,高40cm。层析流速0.8mlmin·cm2。用10%甲醇等度洗脱,共洗4个柱体积,最后用50%甲醇将柱上所有的色带全部下来。单次层析时间约为3.5小时,收集纯度85%以上的流份,减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度88.7%,回收率88%。将样品再次上至用超纯水平衡后的装有1]1^3*-40300人)系列填料的层析柱,同以上操作,得到样品,纯度96.4%,回收率,82%。再重复一次,收集纯度97%以上的流份,合并后减压浓缩至干,得到样品,纯度99.3%,回收率65%。将未达到纯度要求的样品合并,同前法反复过装有UniPS™-40丨OOA系列填料的层析柱,得到纯度99.4%的博安霉素铜螯合物,累计回收率82%。[0049]实施例9[0050]取3.0克博宁霉素铜螯合物粗品(含量30%,用超纯水溶解,上至事先用超纯水平衡的装有UniPS™-40300A系列填料的层析柱,填料直径2.5cm,高40cm。层析流速0.8mlmin·cm2。用甲醇-水体系按0%-15%直线梯度洗脱4个柱体积,再用15%甲醇洗脱1个柱体积,最后用50%甲醇洗柱。单次层析时间为4.5小时,收集纯度85%以上的流份,减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度85.5%,回收率84%。将样品再次上至用超纯水平衡后的装有UniPS™-40300A系列填料的层析柱,同以上操作,得到样品,纯度95.4%,回收率77%。再重复一次,收集纯度97%以上的流份,合并后减压浓缩至干,得到样品,纯度98.7%,回收率63%。将未达到纯度要求的样品合并,同前法反复过装有UniPS™-40300A系列填料的层析柱,得到纯度99.2%的博宁霉素铜螯合物,累计回收率85%。[0051]实施例10[0052]取3.0克博安霉素铜螯合物粗品(含量51%,用超纯水溶解,上至事先用10%甲醇平衡的装有UniPS™-40300A系列填料的层析柱,填料直径2.5cm,高40cm。层析流速0.8mlmin·cm2。用10%甲醇水溶液等度洗脱,共洗4个柱体积,最后用50%甲醇洗柱。单次层析时间为3.5小时,收集纯度85%以上的流份,减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度87%,回收率84%。将样品用超纯水溶解后上至用10%甲醇平衡的装有UniPSTM-403:〇〇A系列填料的层析柱,同上法操作,得到纯度93.8%的样品,回收率75%。将样品用超纯水溶解,上至用0.05M甲酸铵平衡的装有UniMSP-50500A系列填料的层析柱,填料直径2.4cm,高50cm。层析流速0.8mlmin·cm2。先用0.IM甲酸铵洗脱,洗1个柱体积,然后依次用0.2M甲酸铵洗脱1个柱体积,0.4M甲酸铵洗脱1个柱体积,0.5M甲酸铵洗脱3个柱体积,0.6M甲酸铵洗脱1个柱体积,0.8M甲酸铵洗脱2个柱体积,0.9M甲酸铵洗脱2个柱体积,用I.OM的甲酸铵洗至柱上所有的色带全部下来。收集纯度97%以上的流份,上至用超纯水平衡的装有UniPS™-4030〇A系列填料的层析柱(2.5X40cm,上样完毕后用超纯水冲洗层析柱,脱盐后,用20%甲醇洗脱,收集蓝色带。减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度98.7%,回收率60%。将未达到纯度要求的样品合并,同前法再过装有UniPS™-4030〇A系列填料的层析柱及装有UniMSP-50500A系列填料的层析柱,得到纯度98.7%的博安霉素铜螯合物,累计回收率86%。[0053]实施例11[0054]取3.0克博宁霉素铜螯合物粗品(含量30%,用超纯水溶解,上至事先用0.IMNH4Cl平衡的装有UniMSP-50500A系列填料的层析柱,填料直径2.4cm,高50cm。层析流速0.8mVmin·cm2。先用0.1MNH4Cl洗脱,洗1个柱体积,然后依次用0.2MNH4Cl洗脱2个柱体积,0.4MNH4Cl洗脱2个柱体积,0.6MNH4Cl洗脱3个柱体积,0.8MNH4Cl洗脱2个柱体积,0.9MNH4Cl洗脱2个柱体积,用I.OM的NH4Cl洗至柱上所有的色带全部下来。单次层析时间为12小时,收集纯度80%以上的流份,上至用超纯水平衡的装有UniPS™-40300A系列填料的层析柱(2.5X40cm,上样完毕后用纯化水冲洗层析柱,待硝酸银检测无Cr后,用20%甲醇洗脱,收集蓝色带。减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度83%,回收率82%。将样品用超纯水溶解,上至用10%甲醇平衡的装有UniPS™-40300A系列填料的层析柱,填料直径2.5cm,高40cm。层析流速0.8mlmin·cm2。用10%甲醇水溶液等度洗脱,共洗4个柱体积,最后用50%甲醇洗柱。收集纯度90%以上的流份,合并后减压浓缩至干,测定纯度和回收率。纯度94.7%,回收率79%。将样品用超纯水溶解,上至用超纯水平衡的装有UniMSP-50500A系列填料的层析柱同前法操作,同法脱盐后减压浓缩至干,得到纯度98.6%的样品,回收率62%。将未达到纯度要求的样品合并,同前法再过装有UniMSP-50500A系列填料的层析柱及装有UniPS™-40300A系列填料的层析柱,得到纯度99.1%的博宁霉素铜螯合物,累计回收率83%。[0055]实施例12由高纯度铜螯合物制备高纯度盐酸平阳霉素[0056]将按照本发明方法制备得到的高纯度的平阳霉素铜螯合物Ig纯度99.1%,加入25ml甲醇溶解,滴加甲醇酸调pH值为2.5,通入H2S气体(约0.5Lmin,20min,静置0.5h,过滤,甲醇洗涤滤饼,合并滤液,加3倍体积的丙酮沉淀,放置2小时,过滤,抽干,滤饼用甲醇溶解,加2%活性碳脱色,过滤,滤液加3倍体积的丙酮沉淀,放置,过滤,干燥即得。HPLC测定,纯度为99.2%。[0057]实施例13由高纯度铜螯合物制备高纯度盐酸博安霉素[0058]将按照本发明方法制备得到的高纯度的博安霉素铜螯合物Ig纯度98.7%,加入25ml甲醇溶解,滴加甲醇酸调pH值为2.5,通入H2S气体(约0.5Lmin,20min,静置0.5h,过滤,甲醇洗涤滤饼,合并滤液,加3倍体积的丙酮沉淀,放置1小时,过滤,抽干,滤饼用甲醇溶解,加2%活性碳脱色,过滤,滤液加3倍体积的丙酮沉淀,放置,过滤,干燥即得。HPLC测定,纯度为98.5%。[0059]实施例14由高纯度铜螯合物制备高纯度盐酸博宁霉素[0060]将按照本发明方法制备得到的高纯度的博宁霉素铜螯合物Ig纯度99.1%,加入25ml甲醇溶解,滴加甲醇酸调pH值为2.5,通入H2S气体(约0.5Lmin,20min,静置0.5h,过滤,甲醇洗涤滤饼,合并滤液,加3倍体积的丙酮沉淀,放置1.5小时,过滤,抽干,滤饼用甲醇溶解,加2%活性碳脱色,过滤,滤液加3倍体积的丙酮沉淀,放置,过滤,干燥即得。HPLC测定,纯度为98.9%。

权利要求:1.一种平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法,其特征在于,选用单分散聚苯乙烯二乙烯基苯层析介质作为填料进行层析,粒径20〜60μπι,粒径波动范围〈5μηι,孔径100〜4000A:取平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物粗品用超纯水溶解加到用超纯水或流动相平衡的层析柱上,柱高与柱径比15〜40:1,层析柱载量5〜50mgml,用0〜20%的甲醇、乙醇、丙酮水溶液等度洗脱或梯度洗脱,洗脱流速0.5〜2mVmin·cm2,单次层析时间2〜6小时;单次层析后,回收,同上法再经2〜3次层析,即得高纯度的平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物,纯度在97%〜100%。2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,孔径为I〇A、300A、500A、80\,IOKA,或4000A,3.根据权利要求1所述方法,其特征在于,用10%的甲醇等度洗脱。4.一种平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法,其特征在于,将单分散聚苯乙烯二乙烯基苯层析介质与单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质组合,作为填料进行层析;所述的单分散聚苯乙稀二乙稀基苯层析介质,粒径20〜60μηι,粒径波动范围5μπι,孔径10:0〜4000Α;所述的单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质,粒径30〜70μm,粒径波动范围5μπι,孔径1加〜1200兔。5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的单分散聚苯乙烯二乙烯基苯层析介质的孔径为100,4、300Α、5004、800\、1000Α,或4000Α,所述的单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质的孔径优选为500A、750A或IOOOAa6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,取平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物粗品或用单分散聚苯乙烯二乙烯基苯层析介质初步纯化后的样品,用超纯水溶解加到用超纯水平衡的层析柱上,柱高与柱径比15〜40:1,以单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质为填料进行层析,层析柱载量5〜50mgml,用不同浓度的氯化铵或甲酸铵的水溶液梯度洗脱,洗脱流速0.5〜2mVmin·cm2,单次层析、脱盐后,再用单分散聚苯乙烯二乙烯基苯层析介质再次层析;回收含铜螯合物粗品,经以上组合同法再循环层析1〜3次,即得高纯度的平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物。7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,将平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物粗品先用单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质纯化1〜3次后,再用分散聚苯乙稀二乙稀基苯层析介质纯化,直至纯度达到97%以上。8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,将平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物粗品先用单分散聚苯乙烯二乙烯基苯层析介质纯化1〜3次,再用单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质纯化,直至纯度达到97%以上。

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