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【发明公布】cGAS-STING通路激活剂及其用途_北京大学_201610347815.6 

申请/专利权人:北京大学

申请日:2016-05-23

公开(公告)日:2017-12-01

公开(公告)号:CN107412260A

主分类号:A61K33/32(2006.01)I

分类号:A61K33/32(2006.01)I;A61K39/39(2006.01)I;A61K45/06(2006.01)I;A61P37/04(2006.01)I;A61P43/00(2006.01)I;A61P31/04(2006.01)I;A61P31/14(2006.01)I;A61P31/20(2006.01)I;A61P31/18(2006.01)I;A61P31/22(2006.01)I;A61P3/10(2006.01)I;A61P17/06(2006.01)I;A61P19/02(2006.01)I;A61P37/02(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I;A61P33/02(2006.01)I;A61P33/12(2006.01)I;A61P33/06(2006.01)I

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2022.07.19#授权;2018.12.04#实质审查的生效;2017.12.01#公开

摘要:本发明提供了一类新的cGAS‑STING通路的激活剂以及所述激活剂用于激活cGAS‑STING通路的用途。本发明还提供了所述激活剂用于改善固有免疫和或适应性免疫的用途。

主权项:二价锰在制备用于改善固有免疫和或适应性免疫的药物中的用途。

全文数据:cGAS-STING通路激活剂及其用途技术领域[0001]本发明提供了一类新的CGAS-STING通路的激活剂以及所述激活剂用于激活CGAS-STING通路的用途。本发明还提供了所述激活剂用于改善固有免疫和或适应性免疫的用途。背景技术[0002]天然免疫系统在抵抗感染、抑制肿瘤生长以及自身免疫病的发病过程中起着至关重要的作用,主要通过模式识别受体识别病原微生物和癌细胞的组分,启动下游信号通路,最终通过诱导细胞因子表达,一方面杀灭病原微生物及被感染的或发生癌变的细胞,另一方面活化获得性免疫系统促进抗体和特异性T淋巴细胞的生成,从而保护机体免于病原微生物和肿瘤的侵害。[0003]具体地,固有免疫系统运用一系列称为模式识别受体(patternrecognitionreceptors,PRR的病原识别受体监视胞外危险信号、内涵体endosome及胞质的非已成分和自我成分,如LPS、细菌的鞭毛蛋白、环化二核苷酸、CpGDNA、富含AT的DNA、dsDNA、ssDNA等。PRR可针对病原体或自身的组织损伤产生适度的免疫应答,而进入细胞胞质的DNA被机体认为是一种病原体感染的危险信号,若胞质DNA不能被合理清除则会积累在胞质,将引发病理性炎症和自身免疫病,如系统性红斑狼疮systemiclupuserythematosus,SLE。[0004]细胞胞质中存在的游离DNA会被宿主的固有免疫系统当做潜在的危险信号,但免疫系统识别和清除这些危险信号的机制目前尚不明确。DNA感受器DNAsensor是宿主感受DNA和免疫防御的桥梁,目前已经有超过10种DNA感受器被发现,而干扰素刺激基因stimulatorofinterferongenes,STING作为一种DNA感受通路下游关键的接头分子,在感受胞质DNA和免疫防御方面起着重要的信号传递作用。特别地,最近在哺乳动物细胞中发现了一种新型DNA感受器,即cGAScGMP-AMPsynthase,是一种核酸转移酶,它能产生内源性的〇^:2-3环崖卩-6103〇6纟1^,进而激活31'1如。该通路被称为^纟3-31'1如通路,其在机体免疫反应的启动中起到重要的作用。发明内容[0005]本发明人出人意料地发现了一类新型cGAS-STING激活剂,其能够有效地激活cCAS-STING通路,从而改善固有免疫和或适应性免疫。特别地,所述cGAS-STING激活剂选自二价锰、二价锰元素、二价锰源、锰其在对象中以二价锰的形式存在和锰元素其在对象中以二价锰的形式存在)。[0006]在一个方面,本发明提供了二价锰在制备用于改善固有免疫和或适应性免疫的药物中的用途。在一些实施方案中,所述二价锰通过激活cGAS-STING通路改善固有免疫和或适应性免疫。在另一些实施方案中,所述二价锰通过增强胞浆DNA感受改善固有免疫和或适应性免疫。在又一些实施方案中,所述二价锰通过提高cGAS对DNA的敏感性改善固有免疫和或适应性免疫。[0007]在另一个方面,本发明提供了二价锰源在制备用于在对象中改善固有免疫和或适应性免疫的药物中的用途。优选地,所述药物中的所述二价锰源在所述对象中以二价锰的形式存在。在一些实施方案中,所述二价锰通过激活CGAS-STING通路改善固有免疫和或适应性免疫。在另一些实施方案中,所述二价锰通过增强胞浆DNA感受改善固有免疫和或适应性免疫。在又一些实施方案中,所述二价锰通过提高cGAS对DNA的敏感性改善固有免疫和或适应性免疫。[0008]在另一个方面,本发明提供了锰元素在制备用于在对象中改善固有免疫和或适应性免疫的药物中的用途,其中所述药物中的所述锰元素在所述对象中以二价锰的形式存在。在一些实施方案中,所述锰元素通过激活cGAS-STING通路改善固有免疫和或适应性免疫。在另一些实施方案中,所述锰元素通过增强胞浆DNA感受改善固有免疫和或适应性免疫。在又一些实施方案中,所述锰元素通过提高cGAS对DNA的敏感性改善固有免疫和或适应性免疫。[0009]在一个方面,本发明提供了在对象中改善固有免疫和或适应性免疫的方法,其包括向所述对象施用二价锰或其前药。[0010]在另一个方面,本发明提供了在对象中改善固有免疫和或适应性免疫的方法,其包括向所述对象施用二价锰源。优选地,所述二价锰源在所述对象中以二价锰的形式存在或者转变为二价锰的形式。[0011]在另一个方面,本发明提供了在对象中改善固有免疫和或适应性免疫的方法,其包括向所述对象施用锰元素,其中所述锰元素在所述对象中以二价锰的形式存在或者转变为二价锰的形式。[0012]在一个方面,本发明提供了二价锰或其前药,其在对象中改善固有免疫和或适应性免疫。[0013]在另一个方面,本发明提供了二价锰源,其在对象中改善固有免疫和或适应性免疫。优选地,所述二价锰源在所述对象中以二价锰的形式存在或者转变为二价锰的形式。[0014]在另一个方面,本发明提供了锰元素,其在对象中改善固有免疫和或适应性免疫,其中所述锰元素在所述对象中以二价锰的形式存在或者转变为二价锰的形式。[0015]在一些实施方案中,所述二价锰是二价锰盐的形式,优选地所述二价锰盐选自:氯化锰、溴化锰、碘化锰、硫酸锰、硝酸锰、高氯酸锰、醋酸锰、碳酸锰、硼酸锰、磷酸锰、氢溴酸锰、酒石酸锰、富马酸锰、马来酸锰、乳酸锰、苯磺酸锰、泛酸锰、抗坏血酸锰及其任意组合。[0016]在另一些实施方案中,所述二价锰是游离的二价锰离子的形式。[0017]在又一个方面,本发明提供了二价锰、二价锰源或者锰元素在制备用于激活cGAS-STING通路的药物中的用途。[0018]在又一个方面,本发明提供了二价锰、二价锰源或者锰元素在制备用于增强胞浆DNA感受的药物中的用途。优选地,与二价锰不存在时相比,二价锰使得胞浆DNA感受增强至少10、50、100、500、1000、5000、或104倍。[0019]在又一个方面,本发明提供了二价锰、二价锰源或者锰元素在制备用于提高cGAS对DNA敏感性的药物中的用途。特别地,cGAS对DNA的敏感性提高意为,与二价锰不存在时相比,在更低水平的DNA如胞浆DNA存在下,cGAS被激活。优选地,与二价锰不存在时相比,cGAS对DNA的敏感性提高至少10、50、100、500、1000、5000、或104倍,或者。643在低至10一7、IΟ—6、IΟ—5或者10—4mgm1的dsDNA浓度下被激活。[0020]在又一个方面,本发明提供了二价锰、二价锰源或者锰元素在制备用于治疗选自细菌感染、病毒感染、寄生虫、自身免疫性疾病和癌症之疾病的药物中的用途。[0021]在一些实施方案中,所述病毒选自:DNA病毒和RNA病毒,优选地所述病毒选自:疱瘆病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、冠状病毒科、小RNA病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、乳头瘤病毒科、痘病毒科、和逆转录病毒科,更优选地所述病毒选自:单纯疱瘆病毒、水疱性口炎病毒、牛痘病毒、HIV和HBV。[0022]在一些实施方案中,所述细菌选自革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌,优选地所述细菌选自肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae、流感嗜血杆菌(HaemophiIusinfluenzae、沙门氏菌(SalmoneIla、脑膜炎双球菌(Meningococcus、表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidis、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus、大肠杆菌Escherichiacoli、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae、产酸克雷伯氏菌Klebsiellaoxytoca、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae、弗氏朽1檬酸杆菌Citrobacterfreundii、绿胺假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa和波美不动杆菌Acinetobacterbaumanni〇[0023]在一些实施方案中,所述自身免疫性疾病选自I型糖尿病、银肩病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化。[0024]在一些实施方案中,所述癌症选自卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、胎盘绒毛膜癌、子宫颈癌、睾丸癌、子宫癌和白血病。[0025]在一些实施方案中,所述寄生虫是细胞内寄生虫,优选地选自疟原虫、弓形虫、锥虫、血吸虫、丝虫和利什曼原虫。[0026]在又一个方面,本发明提供了二价锰、二价锰源或者锰元素在制备免疫佐剂中的用途。在一些实施方案中,所述免疫佐剂激活T细胞活化和或抗体生产。优选地,所述免疫佐剂用于治疗选自细菌感染、病毒感染、寄生虫、自身免疫性疾病和癌症之疾病的疫苗组合物中。[0027]在又一个方面,本发明提供了二价锰、二价锰源或者锰元素在制备疫苗组合物中的用途,其中所述疫苗组合物还包含一种或更多种抗原。在一些实施方案中,所述疫苗组合物中的二价猛、二价猛源或者猛元素激活T细胞活化和或抗体生产。优选地,所述疫苗组合物用于治疗选自细菌感染、病毒感染、寄生虫、自身免疫性疾病和癌症的疾病。[0028]在又一个方面,本发明提供了二价锰、二价锰源或者锰元素在制备用于诱导趋化因子CCL3生产的药物中的用途。在一些实施方案中,所述趋化因子CCL3的生产进而抑制HIV感染。[0029]在又一个方面,本发明提供了一种疫苗组合物,其包含:一种或更多种抗原,和二价锰。优选地,本发明的疫苗组合物还包含药学上可接受的载体。[0030]在又一个方面,本发明提供了一种用于免疫接种的试剂盒,其包含:第一容器,其中容纳一种或更多种抗原;和第二容器,其中容纳二价锰。优选地,所述第一容器和或第二容器还包含药学上可接受的载体。特别地,所述试剂盒用于本发明的一种或更多种目的。[0031]在一些实施方案中,本发明中所使用的抗原选自:病毒或细菌或寄生物抗原,例如,甲型、乙型、丙型、丁型和戊3型肝炎病毒、HIV、疱瘆病毒1、2、6和7型、巨细胞病毒、水痘带状疱瘆病毒、乳头状瘤病毒、EB病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、布尼亚病毒汉坦病毒)、柯萨奇病毒、小RNA病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、痘病毒、鼻病毒、风瘆病毒、乳多泡病毒、腮腺炎病毒和麻瘆病毒、导致结核和麻风病的分枝杆菌、肺炎球菌、需氧革兰氏阴性杆菌、支原体、葡萄球菌感染、链球菌感染、沙门氏菌和衣原体、幽门螺杆菌、疟疾、利什曼病、锥虫病、弓形虫病、血吸虫病和丝虫病。[0032]在一些实施方案中,本发明中的二价锰、二价锰源、锰元素和或抗原是有效量的。[0033]优选地,所述二价锰源和或所述锰元素在所述对象中以二价锰的形式存在或者转变为二价锰的形式。[0034]在又一个方面,本发明提供了用于在对象中激活cGAS-STING通路的方法,其包括向所述对象施用二价锰、二价锰源和或锰元素。此外,本发明还提供了用于体外激活细胞中cGAS-STING通路的方法,其包括向所述细胞施加二价锰,优选地,所述方法是非治疗目的的。[0035]在又一个方面,本发明提供了用于在对象中增强胞浆DNA感受的方法,其包括向所述对象施用二价锰、二价锰源和或锰元素。此外,本发明还提供了用于体外增强细胞中胞浆DNA感受的方法,其包括向所述细胞施加二价锰,优选地,所述方法是非治疗目的的。[0036]在又一个方面,本发明提供了用于在对象中提高cGAS对DNA敏感性的方法,其包括向所述对象施用二价锰、二价锰源和或锰元素。此外,本发明还提供了用于体外提高cGAS对DNA敏感性的方法,其包括向所述细胞施加二价锰,优选地,所述方法是非治疗目的的。[0037]在又一个方面,本发明提供了用于在对象中治疗选自细菌感染、病毒感染、寄生虫、自身免疫性疾病和癌症之疾病的方法,其包括向所述对象施用二价锰、二价锰源或者锰元素。[0038]在又一个方面,本发明提供了用于在对象中激活T细胞活化和或抗体生产的方法,其包括向所述对象施用二价锰、二价锰源或者锰元素。[0039]在又一个方面,本发明提供了用于在对象中诱导趋化因子CCL3生产的方法,其包括向所述对象施用二价锰、二价锰源或者锰元素。[0040]在又一个方面,本发明提供了二价锰、二价锰源和或锰元素,其用于在对象中激活cGAS-STING通路、增强胞浆DNA感受、提高cGAS对DNA敏感性、治疗选自细菌感染、病毒感染、寄生虫、自身免疫性疾病和癌症之疾病、激活T细胞活化和或抗体生产、和或诱导趋化因子CCL3生产。附图说明[0041]下面通过对本发明的详细描述以及附图来清楚地说明本发明前面叙述的方面以及其他方面。为了举例说明本发明,在附图中的实施方案是目前优选的,然而,可以理解,本发明并不限于所公开的特定实施方案。[0042]图1显示Mn2+预处理赋予了宿主细胞对病毒感染的抗性。其中用ΙΟΟμΜ的MnCl2对THPl细胞预处理12小时,然后用HSV-1-GFP,VSV-GFPorNDVGFP感染细胞。24小时后,对细胞拍照左并使用流式细胞术进行测量右)。[0043]图2显示Mn2+预处理抗病毒活性的剂量依赖性。其中用所示浓度的MnCl2或DMXAADMX处理THPl细胞24小时,然后用所示GFP-病毒感染细胞24小时,之后通过Western印迹测量GFP的表达。[0044]图3显示Mn2+预处理抗病毒活性的剂量依赖性。其中用所示浓度的MnCl2或DMXAADMX处理THPl细胞24小时,然后用所示GFP-病毒感染细胞24小时,之后通过流式细胞术测量病毒-GFP的中位焚光强度MedianFluorescenceIntensity,MFI分布,其中将未使用MnCl2处理的THPl细胞的MFI归一化为1。[0045]图4显示静脉内注射Mn2+赋予小鼠以病毒抗性。其中用2mgkg的MnCl2静脉内注射小鼠,24小时后,用VSV、VACV或HSV-I攻击小鼠,监测小鼠的存活。[0046]图5显示静脉内注射Mn2+赋予小鼠以病毒抗性。其中用2mgkg的MnCl2静脉内注射小鼠,24小时后,用VSV、VACV或HSV-I攻击小鼠,感染四天后取肺和脾脏,勾浆,然后通过空斑试验plaqueassay测量病毒滴度,其中数据表示为平均值土SEM,在至少3个独立实验中获得了类似的结果。[0047]图6显示Mn2+处理对基因表达的影响。其中,A图显示用MnCl2、VACV、IFN0或者培养基(对照)处理THP1细胞12小时,提取RNA并测序。通过计算1〇g2经处理RPKM八对照RPKM得到基因表达的热图;B图显示Mn2+处理诱导I-IFN生产,其中用200μΜMnCl2处理THPl细胞,在2、12、24小时之后弃去含有MnCl2的培养基并更换成新鲜培养基,NW表示不弃去含MnCl2培养基;C图显示使用不同锰盐处理诱导I-IFN生产,其中用所示浓度的MnCl2,ΜηOAc2或者MnOAc3处理THPl细胞24小时,然后使用I-IFN生物测定来分析上清;D图显示在小鼠中静脉内注射MnCl2诱导I-IFN生产,其中使用PBS中0,2或5mgkg的MnCl2溶液静脉内注射小鼠,分离血清并使用I-IFN生物测定进行分析;E图显示在小鼠中静脉内注射MnCl2后ISG的器官分布,其中使用PBS中0,2或5mgkg的MnCl2溶液静脉内注射小鼠,取器官,通过Western印迹测定ISG;F图显示用不同浓度MnCl2处理36小时后健康成年供体中PBMC的I-IFN生产和ISG表达,使用I-IFN生物测定分析I-IFN生产,通过Western印迹测定ISG表达;G图显示用200μΜMnCl2处理不同时间后健康成年供体中PBMC的I-IFN生产和ISG表达,使用I-IFN生物测定分析I-IFN生产,通过Western印迹测定ISG表达。数据表示为平均值土SD。[0048]图7显示Mn2+处理诱导细胞因子产生依赖于cGAS-STING通路。A图显示,用不同浓度MnCl2溶液处理HeLa细胞和THPl细胞24小时后的IRF3磷酸化和蝰蛇毒素Viperin生产;B图显示用500μΜMnCl2溶液处理所示基因敲除的HeLa细胞24小时后的IRF3磷酸化和蝰蛇毒素生产;C图显示用500μΜMnCl2溶液、VACV或SeV处理所示基因缺乏和挽救的HeLa细胞24小时后的IRF3磷酸化通过Western印迹测定);D图显示用500μΜMnCl2溶液、VACV或SeV处理WT或所示基因敲除小鼠24小时后,从中取得的腹膜巨噬细胞中蝰蛇毒素和ISG生产(通过Western印迹测定);Ε图显示D中处理后的IFN生产使用I-IFN生物测定)。数据表示为平均值土SD,在至少3个独立实验中获得了类似的结果。[0049]图8显示Mn2+直接激活CGAS13A图显示纯化的全长(1-522人cGAS与MnCl2、图中所示核酸一起孵育,该反应使用毛地黄皂苷透化的THPl,裂解细胞,将裂解物用于测定cGAMP诱导的IRF3磷酸化;B图显示全长或突变的人cGAS与MnCl2MgCl2、多种不同量的dsDNA—起孵育;C图显示人cGAS蛋白与0.5mM的MnCl2或5mM的MgCl2,以及10_2mgmldsDNA—起孵育,使用MonoQ离子交换柱分析cGAMP生产,用cGAMP,ATP和GTP作为对照。在至少3个独立实验中获得了类似的结果。[0050]图9显示了Mn2+的强佐剂活性。A图显示在第0天和第10天用OVAIOyg、0VA+10ygMnCl2或者0VA+30ygDMXAA肌内免疫小鼠,在第17天取血清和脾细胞,使用血清测定OVA特异性IgGl通过ELISA,AU:㈤450的吸光度单位,数据表示为平均值土SD,来自三个独立的实验,用OVA肽H-2Kb或I-Ab刺激A中的脾脏白细胞,取上清通过ELISA测定IFNγB图)和IL-2C图)分泌,数据表示为平均值土SD。[0051]图10显示Mn2+通过CCL3生产抑制HIV感染。(Α和B图)如图中所示处理THPl细胞,测定I-IFNA图)和CCL3B图)分泌。(C图)使用来自经Mn2+处理的THPl细胞的上清引发MAGIC5细胞4小时,然后使用CCR5-嗜性(CCR5-tropic、CXCR4-嗜性或者VSV-G-假型pseudotypedHIV-Luc病毒感染细胞。3天后,测定萤光素酶,显示病毒感染。将对照上清引发的MAGIC5细胞的萤光素酶活性值归一化为UD和E图)如A和B图)中所示进行实验,不同仅在于使用来自健康成体的PBMC,用Mn2+处理PBMC细胞18或36小时,然后测定I-IFN和CCL3。F图与C图类似,不同仅在于使用来自经Mn2+处理PBMC细胞的上清引发MAGIC5细胞。(G图)如图中所示处理来自WT或基因敲除小鼠的腹膜巨噬细胞,通过ELISA测定CCL3分泌。数据表示为平均值土SD。[0052]图11显示Mn2+和DMXAA活化小鼠腹膜巨噬细胞。(A图)用所示量的Mn2+和DMXAA处理小鼠腹膜巨噬细胞36、48小时,然后测定蝰蛇毒素。[0053]图12显示Mn2+直接激活CGAS13A图显示用所示量的MnCWMgCl2处理THPl细胞24小时,收集上清,测定I-IFN13B图显示考马斯亮蓝染色的纯化全长(1-522、突变体E225AD227A和截短突变(161-522人cGASX图显示,使用截短(161-522人cGAS与MnCl2MgCl2、多种不同量的dsDNA—起孵育,与图8B类似。D图显示在ImM的MnCl2或ImM的MgCl2存在下,通过等温滴定量热法(ITC测定全长人cGAS与dsDNA的结合。[0054]图13显示Mn2+诱导的cGAS活化不涉及线粒体损伤。(A图)用20μΜΑΒΤ-263,20μΜ八81'-737或血:1250,100,20^]\〇处理1'冊1细胞24小时,通过4111161丨11¥冲11':?1双染色FCM、DNA凝胶和Western印迹测定凋亡。(Β图和C图)如图所示处理野生型(WTMPBax--Bak--MEF,然后测定Casp3切割和蝰蛇毒素诱导。(D图)用500μΜMnC12处理来自C57BL6J小鼠的BMDM,通过TEM显示线粒体,使用上清来测定I-IFN生产。(E和F图)用lygmlLPS引发来自WT或所示基因敲除小鼠的腹膜巨噬细胞5小时,然后如所示处理6小时。使用上清Sup和全细胞裂解物WCL测定炎症小体infIammasome活化。数据表示为平均值土SD。具体实施方式[0055]定义[0056]本文中所使用的术语“固有免疫”是指机体在种系发育和进化过程中形成的天然免疫防御功能,即出生后就已具备的非特异性防御功能,也称为非特异性免疫(nonspecificimmunity。固有免疫涉及多种细胞和分子,例如巨噬细胞、自然杀伤细胞、补体、细胞因子(11^工3?、1?1了册、了6?-0、趋化因子(包括〇:趋化因子,例如〇^1工^2、〇^3、0^4、:^5、0^6、0^7、0^8、0^9、0^10、0^11、0^12等,〇父:趋化因子,例如〇父^1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9等,C趋化因子,CX3C趋化因子)、溶菌酶等等。[0057]本文中所使用的术语“适应性免疫”又称获得性免疫或特异性免疫,是指机体在抗原分子刺激之后形成的针对该抗原的特异性免疫,其涉及细胞免疫和体液免疫。[0058]本文中所使用的术语“佐剂”是指并不构成特异性抗原,但是增强对共同给药的抗原的免疫应答的强度和持续时间的试剂。[0059]本文中所使用的术语“二价锰盐”,可以是盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、苯磺酸盐、泛酸盐、抗坏血酸盐等,或者其任意组合。优选地,所述盐是药学上可接受的盐。[0060]本文使用的术语例如“包含”、“含”、“含有”和“包括”不意在限制。此外,除非另有说明,“或”、“或者”意指“和或”。[0061]另外应注意,如本说明书中所使用的,单数形式包括其所指对象的复数形式,除非清楚且明确的限于一个所指对象。而且如果提到一个特定的数值,至少会包括该数值,除非文章清楚的表明了其另有所指。[0062]当数值表示近似值,应理解为特定的数值形成了另一个实施方案。就如所使用的,“约X”(其中X是一个数值是指±10%包含所列出值。如果存在,所有范围都是包括和可以组合的。[0063]本文使用的术语“药学上可接受的载体”可选自:水、缓冲水溶液、、等渗盐溶液如PBS磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3%甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于经口、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质、矫味物质和或芳香物质等作为添加剂。[0064]根据本发明的药物组合物可通过任何适宜的途径施用,例如可经口、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。[0065]本文使用的术语“施用”意指以在药理学上可用的方式向对象提供物质。[0066]本文使用的“药物有效量”、“有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量,以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方例如对剂量的决定等最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定,通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。[0067]本文所使用的术语“对象”意指动物,包括温血哺乳动物,例如人和灵长类动物;鸟类;驯养的家养或农场动物,例如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马和猪;实验室动物,例如小鼠、大鼠和豚鼠;鱼;爬行动物;动物园动物和野生动物等。[0068]除非另有定义,本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。[0069]除非另有说明,任何关于本方法和产品一种实施方案公开的组分、元素、属性或者步骤可以应用于任何其他在此公开的方法和产品。[0070]本公开的每项专利、专利申请、引用的出版物或者本文件中的描述以参考的方式整体并入文本中。[0071]本发明在下面的实施例中进一步的定义。应了解这些实施例仅仅以举例的方式来说明,并不旨在限制本发明的范围。从上面的讨论以及这些例子中,本领域技术人员可以确定本发明的本质特征,而且在不脱离其本质和范围的情况下,能够对本发明做出各方面的改变和修改来使之适应各种各样的用法和条件。[0072]材料和方法[0073]抗体和试剂[0074]抗体来源如下:抗GFPSungeneBiotech,KM8009,抗GAPDHSantaCruz,sc-25778,抗cGASSantaCruz,sc-245858,抗p-IRF3Epitomics,2562-1,抗pIKKa0Cellsignaling,#2078S,抗ΙκΒαCellsignaling,#4814,抗TBKlSantaCruz,sc-52957,Cellsignaling,#3504,抗STINGProteintech,19851-l-AP;Abgent,AP9747bJjtRIG-ICellsignaling,#3743S,抗MAVSSantaCruz,sc_166583,抗Caspase_3SantaCruz,sc-271759。其他抗体均为通过现有技术中所述方法制得和使用(7,34,35,蝰蛇毒素Viperin人75-361aa,小鼠243-360aa,ISG54人6-285aa,小鼠3-289aa,IRF3人全长),LaminA人全长),CaspIp20小鼠121-296aa,ILΙβp17小鼠118-269aaandASC小鼠全长)的cDNA插入到pET_21b载体Novagen并表达于大肠杆菌E.coliBL21DE3。通过Ni-NTA亲和柱纯化重组蛋白,然后将其注射进小鼠或兔子以产生抗血清。[0075]所有化学品购自Sigma-AldrichSt.Louis,MO,另有说明除外。小鼠CCL3ELISAKiteBioscience,#88-56013-22,人CCL3ELISAKitLiankebio,EK1612,DMXAASelleek,S1537,ABT-737Selleek,S1002,ABT-263Selleek,SlOOl,LPSSigma,L4130,DigitoninSigma,D141,OvalbuminInvivoGen,#vac-pova,polyI:CAmersham,#27-4723-01,dsDNAssDNASangonBiotech,有义序列:5-tacagatctactagtgatctatgactgatctgtacatgatctaca-3,dsRNAssRNADharmacon,^SLfff:5-uacagaucuacuagugaucuaugacugaucuguacaugaucuaca-3之间等摩尔量,将dsDNA和dsRNA退火。[0076]质粒[0077]带有Flag标签的人cGAS表达载体由Dr.ZhijianChenUTSouthwesternMedicalCenter惠赠。pET_21b_hcGAS由XiaodongSuPekingUniversity惠赠。pU6_sgRNA和pcDNA3.1_CAS9由JianzhongJeffXiPekingUniversity惠赠。pLVXsi3LTRLuc,pHIVJRFLenv和pREllNL43env由TakaomiIshidaInstituteofMicrobiology,CAS惠赠。psPAX2和pMD2.G获得自Addgenec3PGI^-Basic载体和pRL_SV4〇-Renilia获得自Promega。编码人11^3,51'1糾,了811以及1?16-1之~端的〇0财扩增自1'即1细胞,克隆进口〇0财3.1Invitrogen。通过测序对所有构建体进行确认。[0078]HH[0079]HEK293T,L929-ISRE,2fTGH及其衍生突变株(U3A,U4A,U5A和2A,2fTGH-ISRE,HeLa及其衍生敲除株,丨810^,8册21,]\^6105细胞培养于添加有10%?836丨1^〇,5以81111青霉素和lOwgml链霉素的DMEMGibco中。THPl培养于添加有10%FBSGibco的RPMI-1640Gibco培养基中。人外周血单个核细胞(PBMC分离自健康人成年志愿者外周血,使用Histopaque-1077Sigma,10771通过连续离心进行分离,然后培养于添加有5%FBS的RPMI-1640培养基。野生型和敲除的MEF由第15天胚胎制备,培养于添加有10%FBS的DMEM中。腹膜巨细胞收获自疏基乙醇酸盐BD,Sparks,MD注射诱导后5天的小鼠,培养于添加有5%FBS的DMEM中。骨髓来源巨噬细胞BMDM收集自股骨和胫骨,培养于添加有20%FBS和30%L929的DMEM调整培养基中5-7天。[0080]C57BL6小鼠来源的野生型iBMDM细胞(KatherineFitzgerald,UniversityofMassachusettsMedicalSchool,Tlr4-_iBMDM细胞(AihaoDing,WeillCornellMedicalCollege,TbkI--MEFsWen-ChenYeh,Amgen,MAGIC5TakaomiIshida,InstituteofMicrobiology,CAS,2fTGH及其衍生突变株(GeorgeStark,ClevelandClinic和Bax--Bak--细胞(KevinMRyan,BeatsonInstituteforCancerResearch,UK来源如所示。[0081]Jx^[0082]cGas--,Sting-_和cGas--Sting-_小鼠获得自cGAS和STING建立小鼠亡〇1111161'111;!^的杂交,所述建立小鼠通过将〇3891111?熟(10〇1^^1和81?熟5〇1^^1胞质注射到C57BL6J受精卵而获得。通过mMESSAGEmMACHINET7UltraAmbion,aml345体外转录Cas9mRNA和单引导(singleguideRNAgRNA〇Sodl--#002972;^nSod2--#002973小鼠购自JacksonLaboratory〇Nlrp3__,Asc--和Aim2-_由VishvaDixitGenentechInc,USA惠赠。Mavs--小鼠得自ZhijianChenUTSouthwesternMedicalCenter,Irf3--和Irf3-_Irf7--小鼠得自TadatsuguTaniguchiTheUniversityofTokyo〇[0083]所有小鼠均按照NIH实验动物管理使用指南(NationalInstituteofHealthGuideforCareandUseofLaboratoryAnimals在无菌条件下喂养于北京大学实验动物中心。[0084]I型IFNTypeI-IFN生物测定[0085]如前人所述测定I型IFN的浓度(36简言之,通过将IFN-刺激应答元件(1?^stimulatedresponseelement,ISRE克隆进pGL3_Basic载体Promega来构建IFN敏感萤光素酶载体,然后将其稳定转染进2fTGH或L929细胞。将2fTGH-ISRE或L929-ISRE细胞接种到96孔板,分别与人或小鼠细胞培养上清一起孵育。使用重组人和小鼠IFNKRDSystems作为标准品。4小时后,裂解细胞,通过LuciferaseReporterAssaySystemPromega进行狈Ij定。_]萤光素酶报告物测定[0087]萤光素酶报告物测定如前人所述实施7。简言之,将人CCL3启动子区域的-1076至-1,-800至-1,-700至-1以及-601至-1,和小鼠IFNP启动子区域的-155至-1克隆进pGL3-Basic载体Promega。将HEK293T细胞以IxlO5孔的密度接种到24孔板,用所述表达载体进行转染,使用pGL3-Basic衍生萤光素酶报告载体和pRL-SV40-RenillaPr〇mega作为内部对照J4小时后,使用双萤光素酶测定系统Dual-LuciferaseReporterAssaySystem测定报告基因的活性。[0088]病毒感染[0089]单纯痕疫病毒I-GFPHSV-1-GFP,Kos株,来自ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing、水疱性口炎病毒-GFPVSV-GFP,来自RongbinZhou,UniversityofScienceandTechnologyofChina、新城疫病毒-GFPNDV-GFP,来自ChenWang,InstituteofBiochemistryandCellBiology,SIBS,CAS,仙台病毒(SeV,来自CongyiInstituteofMicrobiology,CAS;或者WesternReserve_Vvt7株,来自MeilinJin,HuazhongAgriculturalUniversity,单纯疱疼病毒1HSV_1,野生型F株,来自HongbingShu,WuhanUniversity;F株,来自BernardRoizman,TheUniversityofChicago和水疱性口炎病毒VSV,Indianastrain由上述同仁惠赠。使用BHK21通过空斑法测定病毒滴度。[0090]病毒抗性测定:使用MnC12处理细胞或者使用上清引发,用HSV-1-GFP,VSV-GFP和NDV-GFP以0.5的MOI感染细胞。24小时后,通过FACSCalibur设备(BDBiosciences进行流式细胞术从而测定不同病毒感染细胞的病毒-GFP。使用Flowjo软件分析FACS数据。[0091]细胞刺激:用SeVM0I为0·I,VACVWesternReserve_Vvt7株,MOI为0·I,HSV_1F株,MOI为0.1和NDV_GFPM0Iof1感染细胞1小时,淋洗并培养于新鲜培养基中。[0092]小鼠存活实验:用HSV-1野生型F株,1.4xl07pfu只小鼠)和VSV8xl08pfu只小鼠)静脉内感染8-12周小鼠,或者用VACVWesternReserve株,IxlO7Pfu只小鼠)鼻内感染8_12周小鼠。[0093]空斑测定:将BHK21细胞与来自被感染小鼠器官的匀浆在无血清DMEM中的一系列稀释液一起孵育2小时。然后,用无血清DMEM中0.5%甲基纤维素替换培养基。60小时后,用0.5%voIvo1戊二醛固定,用1%wtvo1结晶紫溶解于70%乙醇染色。对空斑进行计数,从而计算以空斑形成单位计的病毒滴度。[0094]蛋白质表达和纯化[0095]将全长(1-522和截短的(161-522人cGAShcGAS亚克隆进pET-21b载体。在E·coliBL21DE3中表达His6-hcGAS,使用0·3mM异丙基β-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG在18摄氏度诱导过夜。在裂解缓冲液25mMTris-HCl,500mMNaCl,pH7.5中裂解细胞,通过离心20,OOOrpm,Ih除去细胞碎片。用0·2μηι低蛋白结合膜PalICorporation过滤上清。将澄清的上清加样到HisTrapHP柱GEHealthcare,用裂解缓冲液中0至300mM咪唑梯度洗脱。[0096]使用lUμΙBenzonaseSigma处理蛋白质过夜以除去DNA和RNA。添加2mMEDTA以除去二价阳离子。之后,使用裂解缓冲液平衡后的Superdex200柱GEHealthcare对蛋白质进行凝胶过滤。最后,使用AmiconUltra-410K离心滤器MerckMilipore将纯化的蛋白浓缩至l〇mgml。[0097]cGAS活性测定[0098]将纯化的重组全长、截短或者突变hcGAS与含有下列成分的40μ1反应液在37摄氏度下一起孵育90分钟:1μΜhcGAS,lmMATP,lmMGTP,100mMNaCl,40mMTris-HClρΗ7·5,10-2-10-6mgmldsDNA和0.05-lmMMnC12或者0.5-10mMMgCl2。在99摄氏度下加热反应液,使得蛋白质变性,在16,00^下离心10分钟。将上清与1^81111毛地黄阜苷118;[1:011;[11通透化的6χ105ΤΗΡ1细胞在37摄氏度下孵育30分钟,然后将细胞裂解,进行Western印迹,从而测定cGAMP诱导的IRF3磷酸化。此外,使用经工作缓冲液50mMTris-HCl,pH8.5平衡的MonoQ离子交换柱GEHealthcare分析所述上清,用0至500mM的NaCl梯度洗脱。[0099]等温滴定量热法(ITC[0100]通过在25摄氏度下使用iTC200设备GEHealthcare进行ITC来测定解离成分。通过凝胶过滤色谱来纯化蛋白质和ISD,其中在含有或不含ImMMnCl2或MgCl2的裂解缓冲液25mMTris-HCl,500mMNaCl,pH7.5中洗脱。ISD注射器中50μΜ,18χ2μ1注射)和hcGAS反应孔中5μΜ使用以下参数运行:参考偏置referenceoffset10ycals,注射器转速500rpm,注射前延迟180s,以及5s记录间隔。使用Origin7Microcal分析数据。[0101]RT-PCR和实时PCR分析[0102]使用TRIzol试剂(Invitrogen根据说明分离总RNA。将1微克总RNA转化为cDNA,使用随机引物和SuperscriptIII逆转录酶(Invitrogen。使用基因特异性引物进行PCR。在1.5%琼脂糖凝胶上对RT-PCR产物进行凝胶电泳,通过EB染色进行显示。[0103]在LightCycler96系统Roche中使用Sybrgreen进行定量实时PCR,数据表示为mRNA积累指数2AAet。[0104]凋亡分析[0105]通过膜联蛋白V-荧光素异硫氰酸酯(FITC和碘化丙啶(PI凋亡测定试剂盒Solarbio,CA1020根据说明进行凋亡分析。简言之,将细胞重悬于500μ1结合缓冲液其含有额外的5μ1AnnexinV-FITC和5yL碘化丙啶),在室温孵育15分钟,无直接光照。弃去上清,用PBS洗细胞。然后,将细胞重悬于400μ1PBS中。通过流式细胞术分析样品,使用Flowjo分析数据。膜联蛋白V阳性而PI阴性的群体表示早期凋亡细胞,而膜联蛋白V和PI阳性群体表示凋亡细胞。[0106]DNA片段化测定:将IO5THPl细胞重悬于500μ1缓冲液D100mMTris-HClpH8.0,5mMEDTA,0.2M他:1,0.4%303,0.211^1111蛋白酶1〇并在37摄氏度下孵育过夜。使用苯酚和酚氯仿(I:I去除DNA中的蛋白,用2倍体积乙醇沉淀。将DNA沉淀重悬于含lygμΐRNase的15μ1TEpH8.0。在37摄氏度孵育2小时后,将DNA加样于1%琼脂糖凝胶,进行电泳,用EB染色和短波紫外光照射进行显现。[0则使用卵清蛋白免疫[0108]如前所述免疫小鼠,进行测定3,37,38。简言之,在第0天和第10天使用IOygOVA单独或者与I3BS中的IOygMnCl2或30ygDMXAA—起肌内免疫小鼠。在第17天取血清和脾细胞,以分别测定OVA特异性IgGl和T细胞应答。[0109]OVA特异性IgGl检测:将来自免疫小鼠的稀释血清孵育在涂覆了lOOygmlOVA的ELISA板上。清洗后,使用HRP-缀合的抗体小鼠IgGleBioscience,#18-4015-82检测结合的IgGl。然后,将板与底物TMBkBioscience—起孵育,用IMH3PO4停止反应,然后测定吸光度。使用OVA特异性IgGlabeam,ab17293作为标准品。[0110]OVA特异性T细胞应答:将脾细胞接种于24孔板,IxlO6孔,用10ygml合成的OVA肽进行刺激,I-AbISQAVHAAHAEINEAGR、H-2KbSIINFEKL或者对照肽FAPGNYPAL。24小时后,收集细胞培养上清,通过ELISA测定IFN-γLiankebio,EK2801或IL-2eBioscience,#88-7024-22浓度。[0111]假型HIV-IHIV-Luc生产、感染和检测[0112]如前所述进行实验(33,39-41。简言之,用Lipofectamine2000Invitrogen,采取IOyg传递载体pLVXsi3LTRLuc,7.5yg包装载体psPAX2和5yg包膜载体VSV-G-假型HIV为pMD2.G、CCR5-嗜性HIV为pHIVJRFLenv、CXCR4-嗜性HIV为pREllNL43env转染汇合度〜70%的IOcm培养皿中HEK293T细胞。6小时后,将培养基更换为IOmL含20%FBS的DMEM。48-72小时后,收获含有假型病毒的经转染细胞上清,用0.45注射器滤器进行过滤。立刻使用假型病毒感染MAGIC5细胞,或者将假型病毒冷冻于-80摄氏度。通过被感染MAGIC5细胞的萤光素酶测定来测量病毒滴度。为了感染MAGIC5,在感染前一天将细胞以〜30%汇合度接种于12孔板。使用来自THPl或PBMC的上清引发细胞,然后与CCR5-嗜性、CXCR4-嗜性或者VSV-G-假型HIV—起孵育6h。然后,将培养基更换为含10%FBS的DMEM,培养3天。除去培养基,用50μ1lxPassiveLysisBufferPromega孔将细胞裂解30分钟,用FireflyLuciferaseAssaySystemPromega进行测量。[0113]透射电子显微镜TEM[0114]使用0.IM磷酸盐缓冲液pH7.4洗细胞两次,然后用相同缓冲液中2%多聚甲醛2.5%戊二醛固定2小时,用I%0s04在室温后固定postfixH小时。用磷酸盐缓冲液和蒸馏水淋洗数遍后,将细胞在〇.1%单宁酸(磷酸盐缓冲液中)中孵育30分钟。用蒸馏水淋洗细胞,在2%乙酸铀酰中染色1小时。再次在蒸馏水中洗,在乙醇中脱水,包埋于SPI-Pon812树脂(SPI3卯?1以8,?4,1^4。用乙酸铀酰和柠檬酸铅对超薄(7511111厚)切片进行染色,在TecnaiG220TWIN透射电镜下观察,120kV加速电压。用Eagle4kX4k数码相机FEI,Oregon,USA处理图像。[0115]统计分析[0116]使用t检验分析数据。使用Mantel-Cox检验比较存活曲线。[0117]实施例[0118]实施例I.Mn2+处理赋予了宿主细胞对病毒感染的抗性[0119]实验a[0120]用ΙΟΟμΜ的MnCl2对培养于添加了10%FBS的RPMI-1640培养基Gibco中的THPl细胞预处理12小时,然后用MOI为0.5的HSV-1-GFP获得自中国医学科学院),VSV-GFP获得自中国科技大学Rongbinzhou或者NDV-GFP获得自中国科学院生物化学和细胞生物学研究所ChenWang感染细胞。24小时后,对细胞拍照并使用流式细胞术FACSCalibur进行测量并使用Flowjo进行分析如图1所示)。图1中清楚地显示使用Mn2+预处理赋予了宿主细胞对病毒感染的抗性。[0121]如上所述,用图2或图3所示浓度的MnCl2或DMXAADMX处理THPl细胞24小时,然后用所示GFP-病毒感染细胞24小时,之后通过Western印迹测量GFP的表达以及通过流式细胞术测量病毒-GFP的中位焚光强度MedianFluorescenceIntensity,MFI分布,其中将未使用MnCl2处理的THPl细胞的MFI归一化为1,显示了Mn2+预处理抗病毒活性的剂量依赖性。[0122]实验b[0123]取对数生长期的培养于添加了10%FBS的DMEM培养基Gibco中的人类宫颈癌细胞系如1^,将厶液和8液(4液成分:?83缓冲液(如:1137111111〇1几,1:12.7111111〇1几,Na2HP〇4lOmmolL,KH2P〇42mmolL或生理盐水,PH值为7.4。財夜成分:]«11:1210〇111111〇11按照表中的比例混合并加入到培养体系中。24小时后,加入绿色荧光蛋白标记GFP的病毒进行侵染,分别是:I型单纯疱瘆病毒HSV-I,新泽西型水疱性口炎病毒VSV和新城疫病毒NDV。病毒侵染24小时后,使用流式细胞术分析病毒感染率GFP阳性率),如下表1所示。[0124]表I.Mn2+处理显著降低病毒感染率[0126]~实验c''''[0127]用图11中所示量的Mn2+和DMXAA处理小鼠腹膜巨噬细胞36、48小时,然后测定蝰蛇毒素,结果表明显示Mn2+和DMXAA活化小鼠腹膜巨噬细胞如图IIA所示)。[0128]实施例2.静脉内注射Mn2+赋予小鼠以病毒抗性[0129]实验a[0130]取八周龄SPF级实验用C57BL6购买自北京维通利华公司),将A液和B液如上所述)按照表中的比例混合,并通过尾静脉注射。16-24小时后,分别注射I型单纯疱瘆病毒HSV-I,新泽西型水疱性口炎病毒VSV和牛痘病毒VacV1^S小时后使用空斑法检测小鼠中病毒滴度,并监测病毒致死率。[0131]表2.静脉内注射Mn2+后小鼠中病毒滴度[0133]表3.静脉内注射Mn2+后小鼠致死率[0135]实验b[0136]取八周龄SPF级实验用C57BL6购买自北京维通利华公司),用2mgkg的MnCl2静脉内注射小鼠,24小时后,用VSV8xl08pfu只小鼠)、VACVWesternReserve毒株,IxlO7Pfu只小鼠)或HSV-1野生型F毒株,1.4xl07pfu只小鼠)攻击小鼠,监测小鼠的存活如图4所示)。[0137]实验c[0138]如上所述用2mgkg的MnCl2静脉内注射小鼠,24小时后,用VSV、VACV或HSV-I攻击小鼠,感染四天后取肺和脾脏,匀浆,然后通过空斑试验plaqueassay测量病毒滴度,结果如图5所示。[0139]实施例3.Mn2+处理对下游基因表达的影响[0140]实验a[0141]用ΙΟΟμΜ的血:12、¥4^、1?卵或者培养基(对照)处理1'冊1细胞12小时,提取1?嫩并测序。通过计算l〇g2经处理RPKM对照RPKM得到基因表达的热图(如图6Α所示)。[0142]实验b[0143]用200μΜMnCl2处理THPl细胞,在2、12、24小时之后弃去含有MnCl2的培养基并更换成新鲜培养基,NW表示不弃去含MnCl2培养基,图6Β显示I-IFN的生产。[0144]实验(c[0145]用所示浓度的MnCl2,MnOAc2或者MnOAc3处理THPl细胞24小时,然后使用I-IFN生物测定来分析上清,图6C显示使用不同锰盐处理诱导I-IFN生产,表明二价锰盐均能够诱导I-IFN生产,而三价锰盐效果弱得多。[0146]实验d[0147]使用PBS中0,2或5mgkg的MnCl2溶液静脉内注射小鼠,分离血清并使用I-IFN生物测定进行分析,另外进行相同实验,但处死小鼠,取器官,通过Western印迹测定ISG。图6D显示在小鼠中静脉内注射MnCl2诱导I-IFN生产,图6E图显示在小鼠中静脉内注射MnCl2后ISG的器官分布,其中在多个器官中都诱导了蝰蛇毒素和ISG54。[0148]实验e[0149]图6F显示了用不同浓度MnCl2对来自健康成年供体的PBMC使用来自Sigma的Histopaque-1077通过连续离心得到,培养于含5%?83的1^]\〇-1640培养基中)处理36小时后的I-IFN生产和ISG表达,使用I-IFN生物测定分析I-IFN生产,通过Western印迹测定ISG表达。图6G显示用200μΜMnCl2对来自健康成年供体的PBMC处理不同时间后的I-IFN生产和ISG表达。这些数据显示Mn2+处理所导致的I-IFN生产和ISG表达的剂量依赖性和时间依赖性,从而证明Mn2+处理不论在体外还是在体内均引发了下游基因表达。[0150]实验f[0151]取对数生长期的THPl细胞或者人原代外周血单个核细胞(来自健康的成人捐献者)。将A液和B液如上所述按照表中的比例混合并加入到培养体系中。16-24小时后,取细胞培养上清,使用酶联免疫吸附法检测其中I型干扰素含量,结果如下表4中所示。[0152]表4.Mn2+体外处理诱导干扰素生产[0153][0154]实验(g[0155]取八周龄SPF级实验用C57BL6购买自北京维通利华公司),将A液和B液如上所述按照表中的比例混合,并通过尾静脉注射。16-24小时后,取小鼠外周血血清,使用酶联免疫吸附法检测其中I型干扰素含量。[0156]表5.Mn2+注射在体内诱导干扰素生产[0158]实施例4.Mn2+直接抑制人类免疫缺陷病毒HIV对人细胞的侵染[0159]为了制备HIV假病毒,将HEK293T细胞培养于IOcm培养皿中,至〜70%汇合度,然后用IOyg传递载体pLVXsi3LTRLuc,获得自中国科学院微生物研究所TakaomiIshida、7.5yg包装载体psPAX2,获得自Addgene以及5yg包膜载体VSV-G-假型HIV:pMD2.G,获得自Addgene;CCR5-嗜性HIV:pHIVJRFLenv,获得自中国科学院微生物研究所TakaomiIshida;以及CXCR4-嗜性HIV:pRElINL43env,获得自中国科学院微生物研究所TakaomiIshida,使用Lipofectamine2000Invitrogen转染HEK293T细胞。6小时后,将培养基更换为IOmLDMEM含有20%FBS。48-7211后,收获含有假病毒的转染细胞上清,用0.45μπι滤器过滤。[0160]所制备的假病毒用于立刻感染MAGIC5细胞或者保存于_80°C。通过萤光素酶测定来确定病毒滴度。[0161]为感染MAGIC5细胞,感染前一天,以30%左右汇合度将细胞接种于12孔板。使用来自THPl或者PBMC的上清引发prime细胞4h,然后将其与CCR5-嗜性,CXCR4-嗜性或VSV-G-假型HIV—起孵育6h。然后,将培养基更换为DMEM含有10%FBS,培养3天。去除培养基,用50μ1IXPassiveLysisBufferPromega孔裂解细胞30分钟,使用FireflyLuciferaseAssaySystemPromega进行测定。[0162]取对数生长期的培养于添加了10%FBS的DMEM培养基中的人类宫颈癌细胞系Magic5,将A液和B液如上所述按照表中的比例混合并加入到培养体系中。24小时后,加入表达萤火虫萤光素酶fireflyluciferase的HIV假病毒侵染MAGIC5细胞,所用的HIV假病毒分别是:JRFLCCR5型HIV和NL43CXCR4型HIVJ4小时后,监测被侵染细胞中荧光素酶活性,进而判断病毒侵染的抑制率如下表6所示)。[0163]表6.Mn2+处理后HIV病毒侵染的抑制率[0165]~实施例5.Mn2+可用于治疗肿瘤[0166]取八周龄SPF级实验用C57BL6购买自北京维通利华公司),肋下注射5xl06只小鼠的小鼠淋巴瘤细胞EL4Dr.MinghuiZhang,清华大学)。分别在接种肿瘤细胞之后的2、4、6天。A液和B液(如上所述按照表中的比例混合,进行瘤内注射。并在成瘤之后的10、15、20天测量肿瘤的大小,结果见下表7。[0167]表7.Mn2+处理后HBV的滴度[0168][0169]实施例6.1112+处理诱导细胞因子产生依赖于〇643-311如通路[0170]首先,用图7A所示不同浓度MnCl2溶液处理HeLa细胞和THPl细胞24小时后,测定IRF3磷酸化和蜂蛇毒素Viperin生产。具体地,将细胞裂解,通过Western印迹测定IRF3磷酸化和蝰蛇毒素的生产。[0171]为了研究Mn2+处理所导致的细胞因子产生通过哪种途径起作用,发明人使用CRISPRCas9系统得到了一系列基因敲除的HeLa细胞,然后用500μΜMnCl2溶液处理所示基因敲除的HeLa细胞,图7Β显示了24小时后的IRF3磷酸化和蝰蛇毒素生产,结果显示MnCl2诱导的IRF3磷酸化和蝰蛇毒素的生产依赖于cGAS、STING、TBKl和IRF3,而不依赖于RIG-I或MAVS。图7C显示用500μΜMnCl2溶液、VACV或SeV处理所示基因缺乏和挽救的HeLa细胞24小时后的IRF3磷酸化(通过Western印迹测定),其中挽救的HeLa细胞为用分别含有表达人IRF3,STING,TBK1以及RIG-I之N端的cDNA序列(扩增自THPl细胞)的pcDNA3·IInvitrogen载体转染的HeLa细胞,结果显示在敲除细胞中重建cGAS、STING和IRF3能够挽救MnCl2诱导的IRF3磷酸化和蝰蛇毒素的生产。[0172]为了进一步研究Mn2+处理的体内作用,发明人使用CRISPRCas9系统得到了一系列基因敲除的小鼠(基于C57BL6J小鼠)。图7D显示用500μΜMnCl2溶液、VACV或SeV处理WT或所示基因敲除小鼠24小时后,从中取得的腹膜巨噬细胞中蝰蛇毒素和ISG生产(通过Western印迹测定),结果同样显不MnCh诱导的IRF3磷酸化和蜂蛇毒素的生产依赖于cGAS、STING、TBK1和IRF3,而不依赖于RIG-I或MAVS。图7E显示用500μΜMnCl2溶液、VACV或SeV处理WT或所示基因敲除小鼠24小时后的IFN生产使用I-IFN生物测定),结果与上面类似。[0173]以上结果充分证明Mn2+通过cGAS-STING通路发挥作用。[0174]实施例7.Mn2+处理直接激活cGAS[0175]为了进一步研究Mn2+的作用机理,将纯化的全长(1-522人cGAS与MnCl2、图中所示的核酸一起孵育。将反应产物与使用毛地黄皂苷Sigma,D141透化的ΤΗΡΓ混合30分钟,然后裂解细胞,将裂解物用于测定cGAMP诱导的IRF3磷酸化,结果显示仅有dsDNA存在时,Mn2+激活cGAS如图8A所示)。图8B图显示全长或突变的人cGAS与MnCl2MgCl2、多种不同量的dsDNA—起孵育,结果显示与Mg2+相比,Mn2+存在下cGAS对dsDNA的敏感性提高至少IO4倍(10一2相比于10_6,其中mut为催化阳离子结合残基发生突变的人cGAS:E225AD227A。图8C显示人cGAS蛋白与0.5mM的MnCl2或5mM的MgCl2,以及10_2mgmldsDNA—起孵育,使用MonoQ离子交换柱分析cGAMP生产,用cGAMP,ATP和GTP作为对照。这些数据表明,Mn2+显著地提高了cGAS对DNA的敏感性,并因此使得能够在非常低的胞浆DNA浓度下引发cGAS的酶活性。[0176]另一方面,发明人比较了Mn2+和Mg2+在刺激I-IFN生产中的作用,图12A显示Mn2+刺激I-IFN生产,但是Mg2+几乎没有作用。[0177]发明人研究了Mn2+在cGAS上的作用位点,图12B显示考马斯亮蓝染色的纯化全长1-522、突变体E225AD227A和截短突变(161-522人cGAS,图12C显示,使用截短(161-522人cGAS与全长cGAS得到相似的结果。[0178]图12D显示在ImM的MnCl2或ImM的MgCl2存在下,通过等温滴定量热法(ITC测定的全长人cGAS与dsDNA的结合。[0179]实施例8.Mn2+显示强佐剂活性[0180]实验a[0181]取八周龄SPF级实验用C57BL6购买自北京维通利华公司),将鸡卵清蛋白抗原OVA结果显示,使用Mn2+作为免疫佐剂对OVA产生了特异性的CD4+细胞及CD8+细胞的抗原特异性免疫激活,产生大量的γ干扰素及白细胞介素2。[0182]具体地,在第0天和第10天用OVAIOyg、0VA+10ygMnCl2或者0VA+30ygDMXAASelleck,S1537肌内免疫小鼠,在第17天取血清和脾细胞,使用血清测定OVA特异性IgGl通过ELISA产生,结果如图9A所示。数据表明Mn2+作为免疫佐剂极大地提高了抗体的产生,而且强于已知的STING激活剂DMXAA。[0183]将上述脾细胞以IxlO6孔接种于24孔板,用10ygml合成的OVA肽H-2KbSIINFEKL或I-AbISQAVHAAHAEINEAGR或者对照肽FAPGNYPAL刺激脾细胞,24小时后取上清通过ELISA测定IFNγLiankebio,EK2801和IL-2eBioscience,#88-7024-22分泌,结果如图9B和9C所示。数据表明Mn2+作为免疫佐剂极大地提高特异性的CD4+细胞及CD8+细胞的抗原特异性免疫激活。[0184]实验b[0185]取八周龄SPF级实验用C57BL6购买自北京维通利华公司),将IOyg鸡卵清蛋白抗原(OVA和A液和B液(如上所述)按照表中的比例混合,通过肌肉注射;第一次注射后7-14天,进行第二次注射,注射方法和计量同第一次注射相同。第一次注射后28天,处死小鼠,取外周血并分离血浆,使用酶联免疫吸附法检测小鼠血浆中抗OVA抗体的含量,结果如下表8所示。[0186]表8.Mn2+处理增强抗体的产生[0188]实施例9.Mn2+通过CCL3生产抑制HIV感染[0189]使用Mn2+处理THPl细胞如图10中所示),图IOA和B显示I-IFNA图)和CCL3B图)分泌。结果出人意料地显示,与其他刺激相比,在刺激I-IFN生产的量相同时,Mn2+处理能够导致更多的CCL3分泌(约高2-8倍)。这一结果提示Mn2+处理可能会通过CCL3刺激抑制HIV的感染。[0190]使用来自经Mn2+处理的THPl细胞的上清引发MAGIC5细胞4小时,然后使用CCR5-嗜性CCR5-tropic、CXCR4-嗜性或者VSV-G-假型pseudotypedHIV-Luc病毒假病毒的制备如实施例4中所述感染细胞。3天后,测定萤光素酶,显示病毒感染如图IOC所示)。结果表明,Mn2+处理的确显著地抑制了CCR5-嗜性CCR5-tropic病毒的感染,而对于CXCR4-嗜性或者VSV-G-假型pseudotypedHIV-Luc病毒来说,抑制程度要轻许多。[0191]图IOD和E显示使用Mn2+处理PBMC细胞后I-IFND图)和CCL3E图)分泌,实验如上文THPl细胞的实验(图IOA和B中所述,不同仅在于使用来自健康成体的PBMC,用Mn2+处理PBMC细胞18或36小时,然后测定I-IFN和CCL3。图IOF显示使用来自经Mn2+处理PBMC细胞的上清引发MAGIC5细胞4小时后(其余如图IOC实验所述),使用HIV假病毒的病毒感染。图IOG显示使用Mn2+处理来自WT或基因敲除小鼠的腹膜巨噬细胞,通过ELISA测定CCL3分泌。[0192]以上数据表明,在人原代PBMC细胞中,Mn2+处理显著抑制了CCR5-嗜性(CCR5-tropic病毒的感染,而CXCR4-嗜性或者VSV-G-假型pseudotypedHIV-Luc病毒的抑制程度则较轻。[0193]实施例10.Mn2+处理不导致线粒体损伤[0194]图13显示Mn2+诱导的cGAS活化不涉及线粒体损伤。如图13A中所示,用20μΜABT-263,20μΜΑΒΤ-737或MnCl250,100,200yM处理THPl细胞24小时,通过AnnexinV-FITCPI双染色FCM、DNA凝胶和Western印迹测定凋亡,结果显示在刺激IRF3磷酸化的浓度下Mn2+在THPl细胞中不诱导凋亡,相反,Bcl-2抑制剂ABT-737263却显著地诱导凋亡。如图13B和C中所不,用Mn2+处理野生型(WT和Bax-Bak-_MEF获得自KevinMRyan,BeatsonInstituteforCancerResearch,UK,然后测定Casp3切割和蜂蛇毒素诱导,这些结果显不Mn2+处理所产生的作用不依赖于BakBax,也不依赖于S0D2。用500μΜMnC12处理来自C57BL6J小鼠的BMDM,处理24小时,通过TEM显示线粒体,使用上清来测定I-IFN生产,TEM图如图13D所示,显示线粒体没有明显的延长或者互联,这在TFAM缺陷细胞中是常见的。用lygmlLPS引发来自WT或所示基因敲除小鼠的腹膜巨噬细胞5小时,然后如图13E和F所示处理6小时,使用上清Sup和全细胞裂解物WCL测定炎症小体(inflammasome活化,结果显示Mn2+诱导在来自野生型小鼠的细胞中引发强的炎症小体活化,但是在来自Asc--小鼠的细胞中则不能引发。进一步地,图13F和G显示,Mn2+诱导的炎症小体活化不依赖于A頂2、S0D1或NLRP3。以上结果表明,Mn2+处理不导致线粒体损伤,而且Mn2+诱导的IFN生产也不是由于线粒体损伤所导致的。[0195]以上描述地仅是优选实施方案,其只作为示例而不限制实施本发明所必需特征的组合。所提供的标题并不意指限制本发明的多种实施方案。[0196]本申请中提及的所有公开物和专利通过引用方式并入本文。不脱离本发明的范围和精神,本发明的所描述的方法和组合物的多种修饰和变体对于本领域技术人员是显而易见的。虽然通过具体的优选实施方式描述了本发明,但是应该理解所要求保护的本发明不应该被不适当地局限于这些具体实施方式。事实上,那些对于相关领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的多种变体意在包括在随附的权利要求的范围内。[0197]参考文献[0198]1·L·Sun,J·Wu,F·Du,X·Chen,Z·J·Chen,CyclicGMP-AMPsynthaseisacytosolicDNAsensorthatactivatesthetypeIinterferonpathway.Science339,786-7912013.[0199]2.J.Wuetal·,CyclicGMP-AMPisanendogenoussecondmessengerininnateimmunesignalingbycytosolicDNA.Science339,826_8302013·[0200]3.X.D.Lietal.,PivotalrolesofcGAS-cGAMPsignalinginantiviraldefenseandimmuneadjuvanteffects.Science341,1390-13942013·[0201]4.H.Ishikawa,G.N·Barber,STINGisanendoplasmicreticulumadaptorthatfacilitatesinnateimmunesignalIing.Nature455,674_6782008·[0202]5.B.Zhongetal.?TheadaptorproteinMITAIinksvirus-sensingreceptorstoIRF3transcriptionfactoractivation.Immunity29,538_5502008·[0203]6.H.Ishikawa?Z.Ma?G.N.Barber?STINGregulatesintracellularDNA-mediated,typeIinterferon-dependentinnateimmunity.Nature461?788-7922009.[0204]7.ff.Sunetal·,ERIS,anendoplasmicreticulumIFNstimulator,activatesinnateimmunesignalingthroughdimerization.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica106?8653-86582009.[0205]8.L.Dengetal.?STING-DependentCytosolicDNASensingPromotesRadiation-InducedTypeIInterferon-DependentAntitumorImmunityinImmunogenicTumors.Immunity41,843_8522014·[0206]9·S·R·Wooetal·,STING-dependentcytosolicDNAsensingmediatesinnateimmunerecognitionofimmunogenictumors.Immunity41,830_8422014·[0207]10.K.J.Horning?S.ff.Caito?K.G.Tipps?A.B.Bowman?M.Aschner?ManganeseIsEssentialforNeuronalHealth.Annualreviewofnutrition35,71_1082015·[0208]11·G·F·Kwakye,M.M·PaolielIo,S·Mukhopadhyay,A·B·Bowman,M.Aschner,Manganese-InducedParkinsonismandParkinson7sDisease:SharedandDistinguishableFeatures.Internationaljournalofenvironmentalresearchandpublichealth12,7519-75402015.[0209]I2·J·L·Aschner,M·Aschner,NutritionaIaspectsofmanganesehomeostasis.Molecularaspectsofmedicine26,353_3622005·[0210]13.M.B.Brophy?E.M.Nolan?Manganeseandmicrobialpathogenesis:sequestrationbytheMammalianimmunesystemandutilizationbymicroorganisms.ACSchemicalbiology10,641_6512015·[0211]14.J.Conlonetal·,Mouse,butnothumanSTING,bindsandsignalsinresponsetothevasculardisruptingagent5,6-dimethylxanthenone-4_aceticacid.Journalofimmunology190,5216_52252013·[0212]15.S.Kimetal.?Anticancerflavonoidsaremouse-selectiveSTINGagonists.ACSchemicalbiology8?1396-14012013.[0213]16.P.Gaoetal·,Structure-functionanalysisofSTINGactivationbyc[G2’,5’)pA3’,5’)p]andtargetingbyantiviralDMXAA.Cell154,748-7622013.[0214]17.A.Poltoraketal.,DefectiveLPSsignalinginC3HHeJandC57BLIOScCrmice:mutationsinTlr4gene.Science282?2085-20881998.[0215]18.A.Kumar,M.Commane,T.W.Flickinger,C.M·Horvath,G.R·Stark,DefectiveTNF-alphainducedapoptosisinSTATl—nullcellsduetolowconstitutivelevelsofcaspases.Science278?1630-16321997.[0216]19.M.Jineketal·,Aprogrammabledual—RNA—guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science337,816_8212012·[0217]20.M.JineketaI.?RNA-programmedgenomeeditinginhumancells?eLife2,e004712013.[0218]21.P.Malietal·,RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science339,823-8262013.[0219]22.L.Congetal·,MultiplexgenomeengineeringusingCRISPRCassystems.Science339,819-8232013·[0220]23.P.Gaoetal·,Cyclic[G27,57pA37,57p]isthemetazoansecondmessengerproducedbyDNAactivatedcyclicGMP-AMPsynthase.Cell153?1094-11072013.[0221]24.F.Civriletal·,StructuralmechanismofcytosolicDNAsensingbycGAS.Nature498,332-3372013.[0222]25.E.J.Martinez-Finley?C.E.Gavin?M.Aschner?T.E.Gunter?Manganeseneurotoxicityandtheroleofreactiveoxygenspecies.Freeradicalbiologymedicine62,65-752013.[0223]26.A.Rongvauxetal·,ApoptoticcaspasespreventtheinductionoftypeIinterferonsbymitochondrialDNA.Cell159?1563-15772014.[0224]27.M.J.Whiteetal.?ApoptoticcaspasessuppressmtDNA-inducedSTING-mediatedtypeIIFNproduction.Cell159?1549-15622014.[0225]28.A.P.Westetal·,MitochondrialDNAstressprimestheantiviralinnateimmuneresponse.Nature520,553_5572015·[0226]29Lamkanfi,V.M·Dixit,Mechanismsandfunctionsofinflammasomes.CelI157,1013-10222014.[0227]30.T.S.Xiao?Thenucleicacid-sensinginflammasomes.Immunologicalreviews265,103-1112015.[0228]31·Μ·Haneklaus,L·A.0’Neill,NLRP3attheinterfaceofmetabolismandinflammation.Immunologicalreviews265,53_622015·[0229]32.ff.E.Walkeretal·,IncreasedLevelsofMacrophageInflammatoryProteinsResultinResistancetoR5_TropicHIV-IinaSubsetofEliteControllers.Journalofvirology89,5502_55142015·[0230]33.J.Gohdaetal.,HIV_lreplicatesinhumanosteoclastsandenhancestheirdifferentiationinvitro.Retrovirology12,122015.

权利要求:1.二价锰在制备用于改善固有免疫和或适应性免疫的药物中的用途。2.根据权利要求1的用途,其中所述二价锰通过激活cGAS-STING通路改善固有免疫和或适应性免疫。3.根据前述任一权利要求的用途,其中所述二价锰通过增强胞浆DNA感受改善固有免疫和或适应性免疫。4.根据前述任一权利要求的用途,其中所述二价锰通过提高cGAS对DNA的敏感性改善固有免疫和或适应性免疫。5.根据前述任一权利要求的用途,其中所述二价锰是二价锰盐的形式,优选地所述二价锰盐选自:氯化锰、溴化锰、碘化锰、硫酸锰、硝酸锰、高氯酸锰、醋酸锰、碳酸锰、硼酸锰、磷酸锰、氢溴酸锰、酒石酸锰、富马酸锰、马来酸锰、乳酸锰、苯磺酸锰、泛酸锰、抗坏血酸锰及其任意组合。6.根据前述任一权利要求的用途,其中所述二价锰是游离的二价锰离子的形式。7.二价锰在制备用于激活cGAS-STING通路的药物中的用途。8.二价锰在制备用于增强胞浆DNA感受的药物中的用途。9.二价锰在制备用于提高cGAS对DNA敏感性的药物中的用途。10.二价锰在制备用于治疗选自细菌感染、病毒感染、寄生虫、自身免疫性疾病和癌症之疾病的药物中的用途。11.根据权利要求10的用途,其中所述病毒选自:DNA病毒和RNA病毒,优选地所述病毒选自:疱瘆病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、冠状病毒科、小RNA病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、乳头瘤病毒科、痘病毒科、和逆转录病毒科,更优选地所述病毒选自:单纯疱瘆病毒、水疱性口炎病毒、牛痘病毒、HIV和HBV。12.根据权利要求10的用途,其中所述细菌选自革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌,优选地所述细菌选自肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae、流感嗜血杆菌(HaemophiIusinfluenzae、沙门氏菌(SalmoneIla、脑膜炎双球菌(Meningococcus、表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidis、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus、大肠杆菌Escherichiacoli、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae、产酸克雷伯氏菌Klebsiellaoxytoca、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae、弗氏朽1檬酸杆菌Citrobacterfreundii、绿胺假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa和波美不动杆菌Acinetobacterbaumanni〇13.根据权利要求10的用途,其中所述自身免疫性疾病选自I型糖尿病、银肩病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化。14.根据权利要求10的用途,其中所述癌症选自卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、胎盘绒毛膜癌、子宫颈癌、睾丸癌、子宫癌和白血病。15.根据权利要求10的用途,其中所述寄生虫是细胞内寄生虫,优选地选自疟原虫、弓形虫、锥虫、血吸虫、丝虫和利什曼原虫。16.二价锰在制备免疫佐剂中的用途。17.根据权利要求16的用途,其中所述免疫佐剂激活T细胞活化和或抗体生产。18.二价锰在制备用于诱导趋化因子CCL3生产的药物中的用途。19.根据权利要求18的用途,其中趋化因子CCL3的生产进而抑制HIV感染。20.疫苗组合物,其包含:一种或更多种抗原,和二价锰。21.用于免疫接种的试剂盒,其包含:第一容器,其中容纳一种或更多种抗原;和第二容器,其中容纳二价锰;任选地,所述第一容器和或第二容器还包含药学上可接受的载体。

百度查询: 北京大学 cGAS-STING通路激活剂及其用途

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