申请/专利权人：天津农学院

申请日：2018-07-30

公开（公告）日：2018-11-30

公开（公告）号：CN108913651A

主分类号：C12N5/071(2010.01)I

分类号：C12N5/071(2010.01)I;C12Q1/6851(2018.01)I;A61K33/04(2006.01)I;A61P15/00(2006.01)I;A61K31/722(2006.01)N

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2022.07.29#发明专利申请公布后的视为撤回;2018.12.25#实质审查的生效;2018.11.30#公开

摘要：本发明公开了壳聚糖硒在抑制F‑2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞bax基因表达升高方面的应用。实验结果显示：对于子宫内膜上皮细胞，使用0.8‑3.0μmolL的壳聚糖硒（在培养液中的终浓度，以硒计），在F‑2毒素浓度在10‑30µgmL范围内，可抑制F‑2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞bax基因表达升高，以此达到减弱F‑2毒素对体外培养的猪子宫内膜上皮细胞的毒性作用，为壳聚糖硒在预防和治疗猪F‑2毒素中毒方面的应用提供体外研究模型和理论支持。

主权项：1.壳聚糖硒在抑制F‑2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞bax基因表达升高方面的应用。

全文数据：壳聚糖砸在抑制F-2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞bax基因表达升高方面的应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及壳聚糖硒在抑制F-2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞bax基因表达升高方面的应用。背景技术[0002]F-2毒素，也称玉米赤霉烯酮，是由镰刀菌属产生的真菌毒素，是二羟基苯酸内酯化合物，与雌二醇结构相似，具有雌激素样活性，广泛存在于霉变的农作物和动物饲料中，是粮食与饲料污染的主要真菌毒素之一。国内外大量研究证明，F-2毒素具有生殖毒性、细胞毒性、肝肾毒性、免疫毒性以及遗传毒性。长期饲喂F-2毒素污染的饲料会导致畜禽生长性能下降、免疫功能低下和繁殖机能障碍。[0003]研究表明，F-2毒素对细胞毒性T淋巴细胞、牛淋巴细胞、大鼠睾丸间质细胞、小鼠子宫内膜基质细胞、大鼠卵巢颗粒细胞、大鼠子宫内膜细胞、猪子宫内膜细胞等均具有细胞毒性，可以抑制细胞增殖、抑制DNA和蛋白质的合成，导致细胞的凋亡。细胞凋亡包含多种信号通路途径，其中内在信号通路为线粒体凋亡途径，是由信号分子引起Bax等促凋亡因子活化转移至线粒体外膜形成蛋白性孔道，改变线粒体膜通透性，释放细胞色素C，激活下游caspase-9而诱导凋亡起始。BaxBcl_2associdtedXprotein基因是机体最主要的促细胞凋亡基因之一，属于bcl-2基因家族，编码的Bax蛋白可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2产生阻抑作用，而Bcl-2基因是细胞凋亡抑制基因，因而Bax基因表达升高时细胞凋亡增多，Bax基因表达降低时细胞凋亡减少;而细胞凋亡的程度是霉菌毒素对细胞毒性作用的重要体现形式之一，因此Bax基因表达量的高低在一定程度上可反映毒素对细胞毒性作用的强弱。研究表明，F-2毒素可导致小鼠睾丸组织、大鼠卵巢组织、大鼠卵巢颗粒细胞、小鼠子宫内膜基质细胞以及猪子宫内膜细胞bax基因mRNA表达水平显著提高，并以此来体现其对相应细胞的毒性作用。[0004]硒是动物和人所必需的微量元素。硒的抗氧化、提高机体免疫力和抗病力，调节机体代谢，影响动物和人的繁育机能，抗肿瘤，延缓衰老，拮抗有毒元素等多种生物学功能已为人们所共知。壳聚糖是从低等的生物菌类、藻类的细胞、节支动物虾蟹昆虫的外壳中提取的天然高分子聚合物，具有抗衰老、抗氧化、抗癌、抗风湿、抗病毒、抗肿瘤、增强机体免疫活性、诱导细胞分化等作用。壳聚糖硒是硒与壳聚糖的有机化合物，能同时发挥有机硒和壳聚糖的抵抗氧化，保护细胞膜，抑制过氧化物，提高机体抵抗氧化损伤的作用;在生产实践中，壳聚糖硒还能不同程度提高畜禽的生产性能、免疫力、抗氧化能力，降低重金属对机体的蓄积毒性，也可抵抗肿瘤、诱导细胞凋亡、降血糖和血脂。[0005]目前，国内外未见到壳聚糖硒在缓解F-2毒素对子宫内膜上皮细胞毒性作用方面的专利或报道，更未见到壳聚糖硒抑制F-2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞bax基因表达升高方面的专利或报道。发明内容[0006]本发明公开了壳聚糖硒在抑制F-2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞bax基因表达升高方面的应用。实验结果显示:对于猪子宫内膜上皮细胞，使用0.8-3.0ymolL的壳聚糖硒在培养液中的终浓度，以硒计），在F-2毒素浓度在10-30ngrnL范围内，可抑制F-2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞bax基因表达升高，以此达到减弱F-2毒素对体外培养的猪子宫内膜上皮细胞的毒性作用，为壳聚糖硒在预防和治疗猪F-2毒素中毒方面的应用提供体外研究模型和理论支持。[0007]本发明进一步公开了壳聚糖硒在抑制F-2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞bax基因表达升高的方法，其特征在于按如下的步骤进行：1猪子宫内膜细胞的分离与纯化：常规分离猪子宫内膜细胞，常规纯化猪子宫内膜上皮细胞。[0008]2猪子宫内膜上皮细胞培养与分组处理：将纯化后的子宫内膜上皮细胞稀释至IXIO5个mL，接种于6孔板中。试验可分为对照组、F-2毒素攻毒组和壳聚糖硒组。细胞接种5-7d后，更换培养液:对照组和F-2毒素攻毒组更换普通培养液;壳聚糖硒组更换含有壳聚糖硒的培养液，使其硒浓度为0.8-3.0μπιοίL;继续培养12-36h后取出细胞培养板，壳聚糖硒组和F-2毒素攻毒组均加入F-2毒素使其浓度为10-30ugmL，继续培养3-12h后，培养结束；3利用定量PCR仪进行qPCR反应测定bax基因表达量的改变：提取细胞总RNA，常规反转录RNA为cDNA，常规设计合成猪子宫内膜上皮细胞的内参基因和bax基因的引物、确定反应体系和反应条件，在定量PCR仪上对bax基因表达量进行测定，以此体现减弱F-2毒素对体外培养的猪子宫内膜上皮细胞的毒性作用。[0009]本发明主要解决了如何应用壳聚糖硒抑制F-2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞凋亡基因bax基因表达量改变的方法及应用;重点考察了硒蛋氨酸、硒化卡拉胶、壳聚糖、黄芪多糖、辅酶Q10、壳聚糖硒等能够抑制细胞凋亡或对细胞损伤具有保护作用的物质在减弱F-2毒素对猪子宫内膜上皮细胞毒性作用方面，特别是抑制F-2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞凋亡基因bax基因表达量升高方面的作用效果；主要的难点在于，在上述物质中确定对F-2毒素对猪子宫内膜上皮细胞毒性作用特别是对凋亡基因bax基因表达量改变具有最佳保护效果的物质以及该物质的最佳应用条件;为此先后考察了各种试验物质在减弱F-2毒素对猪子宫内膜上皮细胞毒性作用方面的效果、F-2毒素对猪子宫内膜上皮细胞生长的影响、攻毒的毒素剂量、攻毒时间、壳聚糖硒的应用剂量、应用时间等条件;最后确定的方案是:猪子宫内膜上皮细胞培养5-7d，处于生长对数期时，应用含有壳聚糖硒的培养液在培养液中的终浓度0.8-3.0ymolL，以硒计对细胞进行保护;继续培养12-36h，待壳聚糖硒充分发挥作用后，加入10-30ygmL的F-2毒素进行攻毒，攻毒进行3-12h，在此条件下，壳聚糖硒抑制F-2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞bax基因表达量升高具有最佳的作用效果。附图说明[0010]图1为壳聚糖硒对F-2毒素导致的子宫内膜上皮细胞Bax基因mRNA表达的影响注:标注不同大写或小写字母表示差异显著P0.01或P〈0.05，下同；图2为壳聚糖硒对F-2毒素导致的子宫内膜上皮细胞Bax基因mRNA表达的影响；图3为壳聚糖硒对F-2毒素导致的子宫内膜上皮细胞Bax基因mRNA表达的影响。具体实施方式[0011]下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中所用到的各种试剂均有市售。DMEMF12细胞培养液购买于GIBCO公司，F-2毒素购买于上海源叶生物科技有限公司。壳聚糖硒由天津农学院临床兽医学实验室参照文献孔涛，曲韵笙，朱连勤，等.壳聚糖硒的合成及其理化性质[J].安徽农业科学，2007，351:21的方法进行制备，制备原料买于壳聚糖购买于忆隆生物科技有限公司，亚硒酸钠购自天津市化学试剂究所;制备的壳聚糖硒中硒含量为2.73gkg。[0012]实施例11.1猪子宫内膜细胞的分离与纯化1子宫内膜细胞的分离采用组织块法分离得到子宫内膜上皮细胞）猪屠宰后，立即将子宫两端结扎后，无菌取下整个子宫，剥离脂肪组织，用含有200IU双抗预冷的生理盐水冲洗后置于的含双抗的生理盐水溶液中，尽快送至实验室。用止血钳夹住子宫两端，超净工作台内取出子宫，浸泡于酒精约60s，取出后PBS冲洗;纵向剪开子宫接近子宫角部位），含双抗PBS冲洗3-4次，无血迹，剪取子宫内膜至Imm3左右的粒状，按0.5cm左右间隔均匀置于细胞培养板内，组织块贴附于细胞培养板后，加少量细胞培养液，CO2培养箱培养24h后补加足够的培养液。48h待细胞迀出后，弃掉组织块，收集细胞悬液，低速离心弃上清，重悬，静置10min，移取悬液离心弃上清，收集底部细胞，加培养液制成细胞悬液。[0013]2细胞活性测定利用台盼兰拒染的方法检测分离细胞的活性，取少量细胞悬液与台盼蓝混匀（台盼蓝终浓度0.04%，静置染色3min。显微镜下观察细胞染色状况死亡细胞为蓝色，正常细胞拒染）。计算细胞的活性。[0014]细胞活性=活细胞数活细胞数+死细胞数*100%。[0015]3猪子宫内膜细胞原代培养IXIO5个细胞mL接种于细胞培养板，置于CO2培养箱，24h后换液，以后根据细胞的生长状况更换培养液，定期观察细胞贴壁情况及生长状况。[0016]4猪子宫内膜上皮细胞的纯化上皮细胞较基质细胞的贴壁能力强，利用差速消化法纯化子宫内膜皮细胞。细胞长至单层用胰蛋白酶0.25%消化，当基质细胞开始收缩变圆时，立即加入细胞培养液终止消化，移液枪轻轻吹打使基质细胞脱落，而上皮细胞依然贴壁，弃去培养液，清洗培养板2次，加入适量的细胞培养液继续培养，若仍有基质细胞混合生长，重复上述纯化过程得到纯净子宫内膜上皮细胞。[0017]猪子宫内膜上皮细胞培养与分组处理子宫内膜上皮细胞稀释至IXIO5个mL，接种于6孔板，加样布板前要缓慢多次吹打。试验分为4组，即对照C组、F-2毒素攻毒组F-2毒素20呢11110、壳聚糖硒1组（1.5ymolLSe+F-2毒素20ygmL和壳聚糖硒2组3ymolLSe+F-2毒素20ygmL，每组6个重复。细胞接种5d后，弃掉培养液并清洗2次，更换培养液:对照组和F-2毒素攻毒组更换普通培养液;壳聚糖硒1、2组更换含有1.5ymolL和3ymolL以硒计的壳聚糖硒培养液。继续培养12h后取出细胞培养板，壳聚糖硒1组、壳聚糖硒2组和F-2毒素组均加入F-2毒素，使其浓度为为20ygmL，继续培养4h后，培养结束。[0018]细胞总RNA提取取出培养板，弃培养液并清洗3次，收集子宫内膜上皮细胞置于无RNA酶管，（1加入1mLTrizol试剂，充分吹打低温静置5min，离心12000!111；[11，4°]，1〇111；[11，移取上清置于1.5mL无RNA酶的离心管中。⑵加200yL氯仿，振荡混勾，离心12000rmin，40C，10min，取其上清于另一1.5mL无RNA酶离心管内。（3加入500yL异丙醇，离心12000rmin，4°C，10111；[11，弃清液，（4加40^1^入预冷的75%乙醇，振荡混勾，离心75001'111；[11，4。]，5111；[11，弃上清。重复43次后超净台内干燥5min，加入25yLDEPC水于管内，60°C水浴溶解RNA沉淀，利用核酸浓度测定仪测定RNA浓度。置于-80°C冰箱保存备用。[0019]1.4RNA反转录成cDNA样品反转录见1-1，1-2表1-1样品RNA反转录体系反应条件:65°C10min，取出置于冰上；表1-2样品RNA反转录体系反应条件:37°C60min，85°C反应5min。反转录结束后将上述cDNA置于-20°C冰箱保存。[0020]1.5PCR引物设计猪子宫内膜上皮细胞的DAPDH和bax基因的引物，由Primer3设计，上海捷瑞生物工程公司合成，见表1-3。[0021]表1-3DATOH和bax引物序列1.6qPCR反应反应体系及反应条件见表1-4、1-5.表1-4qPCR反应体系表1-5qPCR扩增程序1.7猪子宫内膜上皮细胞bax基因mRNA表达量的测定猪子宫内膜上皮细胞bax基因mRNA表达量的测定结果见图1;结果表明：20ygmL的F-2毒素可极显著的升高猪子宫内膜上皮细胞中Bax基因的表达量P〈0.01，而1.5ymolL以硒计和3.0ymolL以硒计）的壳聚糖硒都能够极显著的降低F-2毒素所致的猪子宫内膜上皮细胞中Bax基因表达量的升高P〈0.01。[0022]实施例22.1猪子宫内膜细胞的分离与纯化1子宫内膜细胞的分离采用组织块法分离得到子宫内膜上皮细胞）猪屠宰后，立即将子宫两端结扎后，无菌取下整个子宫，剥离脂肪组织，用含有200IU双抗预冷的生理盐水冲洗后置于的含双抗的生理盐水溶液中，尽快送至实验室。用止血钳夹住子宫两端，超净工作台内取出子宫，浸泡于酒精约60s，取出后PBS冲洗;纵向剪开子宫接近子宫角部位），含双抗PBS冲洗3-4次，无血迹，剪取子宫内膜至Imm3左右的粒状，按0.5cm左右间隔均匀置于细胞培养板内，组织块贴附于细胞培养板后，加少量细胞培养液，CO2培养箱培养24h后补加足够的培养液。48h待细胞迀出后，弃掉组织块，收集细胞悬液，低速离心弃上清，重悬，静置10min，移取悬液离心弃上清，收集底部细胞，加培养液制成细胞悬液。[0023]2细胞活性测定利用台盼兰拒染的方法检测分离细胞的活性，取少量细胞悬液与台盼蓝混匀（台盼蓝终浓度0.04%，静置染色3min。显微镜下观察细胞染色状况死亡细胞为蓝色，正常细胞拒染）。计算细胞的活性。[0024]细胞活性=活细胞数活细胞数+死细胞数*100%。[0025]3猪子宫内膜细胞原代培养IXIO5个细胞mL接种于细胞培养板，置于CO2培养箱，24h后换液，以后根据细胞的生长状况更换培养液，定期观察细胞贴壁情况及生长状况。[0026]4猪子宫内膜上皮细胞的纯化上皮细胞较基质细胞的贴壁能力强，利用差速消化法纯化子宫内膜皮细胞。细胞长至单层用胰蛋白酶0.25%消化，当基质细胞开始收缩变圆时，立即加入细胞培养液终止消化，移液枪轻轻吹打使基质细胞脱落，而上皮细胞依然贴壁，弃去培养液，清洗培养板2次，加入适量的细胞培养液继续培养，若仍有基质细胞混合生长，重复上述纯化过程得到纯净子宫内膜上皮细胞。[0027]猪子宫内膜上皮细胞培养与分组处理子宫内膜上皮细胞稀释至IXIO5个mL，接种于6孔板，加样布板前要缓慢多次吹打。试验分为4组，即对照C组、F-2毒素组F-2毒素SOygmL、壳聚糖硒A组（1.25ymolLSe+F-2毒素30ygmL和壳聚糖硒13组2.5ymolLSe+F-2毒素30ygmL，每组4个重复。细胞接种7d后处于生长对数期，弃掉培养液并清洗2次，更换培养液:对照组和F-2毒素组更换普通培养液;壳聚糖硒A组和B组更换含有1.25ymolL和2.5ymolL以硒计）的壳聚糖硒培养液。继续培养24h后取出细胞培养板，壳聚糖硒A组、壳聚糖硒B组和F-2毒素组均加入F-2毒素，使其浓度为30ygmL，继续培养3h后，培养结束。[0028]细胞总RNA提取取出培养板，弃培养液并清洗3次，收集子宫内膜上皮细胞置于无RNA酶管，（1加入1mLTrizol试剂，充分吹打低温静置5min，离心12000!111；[11，4°]，1〇111；[11，移取上清置于1.5mL无RNA酶的离心管中。⑵加200yL氯仿，振荡混勾，离心12000rmin，40C，10min，取其上清于另一1.5mL无RNA酶离心管内。（3加入500yL异丙醇，离心12000rmin，4°C，10111；[11，弃清液，（4加40^1^入预冷的75%乙醇，振荡混勾，离心75001'111；[11，4。]，5111；[11，弃上清。重复43次后超净台内干燥5min，加入25yLDEPC水于管内，60°C水浴溶解RNA沉淀，利用核酸浓度测定仪测定RNA浓度。置于-80°C冰箱保存备用。[0029]反转录成cDNA样品反转录见2-1，2_2表2-1样品RNA反转录体系反应条件:65°C10min，取出置于冰上。[0030]表2-2样品RNA反转录体系反应条件:37°C60min，85°C反应5min。反转录结束后将上述cDNA置于-20°C冰箱保存。[0031]引物设计猪子宫内膜上皮细胞的DAPDH和bax基因的引物，由Primer3设计，上海捷瑞生物工程公司合成，见表2-3。[0032]表2-3DAPDH和bax引物序列2.6qPCR反应反应体系及反应条件见表2-4、2-5.表2-4qPCR反应体系表2-5qPCR扩增程序2.7猪子宫内膜上皮细胞匕1基因1111^^表达量的测定猪子宫内膜上皮细胞bax基因mRNA表达量的测定结果见图2;结果表明：30ygmL的F-2毒素可极显著的升高猪子宫内膜上皮细胞中Bax基因的表达量3〈0.01，而1.25以111〇11以硒计）和2.5以111〇11以硒计）的壳聚糖硒都能够显著或极显著的降低F-2毒素所致的猪子宫内膜上皮细胞中Bax基因表达量的升高P〈0.05或P〈0.01。[0033]实施例33.1猪子宫内膜细胞的分离与纯化1子宫内膜细胞的分离采用组织块法分离得到子宫内膜上皮细胞）猪屠宰后，立即将子宫两端结扎后，无菌取下整个子宫，剥离脂肪组织，用含有200IU双抗预冷的生理盐水冲洗后置于的含双抗的生理盐水溶液中，尽快送至实验室。用止血钳夹住子宫两端，超净工作台内取出子宫，浸泡于酒精约60s，取出后PBS冲洗;纵向剪开子宫接近子宫角部位），含双抗PBS冲洗3-4次，无血迹，剪取子宫内膜至Imm3左右的粒状，按0.5cm左右间隔均匀置于细胞培养板内，组织块贴附于细胞培养板后，加少量细胞培养液，CO2培养箱培养24h后补加足够的培养液。48h待细胞迀出后，弃掉组织块，收集细胞悬液，低速离心弃上清，重悬，静置10min，移取悬液离心弃上清，收集底部细胞，加培养液制成细胞悬液。[0034]2细胞活性测定利用台盼兰拒染的方法检测分离细胞的活性，取少量细胞悬液与台盼蓝混匀（台盼蓝终浓度0.04%，静置染色3min。显微镜下观察细胞染色状况死亡细胞为蓝色，正常细胞拒染）。计算细胞的活性。[0035]细胞活性=活细胞数活细胞数+死细胞数*100%。[0036]3猪子宫内膜细胞原代培养IXIO5个细胞mL接种于细胞培养板，置于CO2培养箱，24h后换液，以后根据细胞的生长状况更换培养液，定期观察细胞贴壁情况及生长状况。[0037]4猪子宫内膜上皮细胞的纯化上皮细胞较基质细胞的贴壁能力强，利用差速消化法纯化子宫内膜皮细胞。细胞长至单层用胰蛋白酶0.25%消化，当基质细胞开始收缩变圆时，立即加入细胞培养液终止消化，移液枪轻轻吹打使基质细胞脱落，而上皮细胞依然贴壁，弃去培养液，清洗培养板2次，加入适量的细胞培养液继续培养，若仍有基质细胞混合生长，重复上述纯化过程得到纯净子宫内膜上皮细胞。[0038]猪子宫内膜上皮细胞培养与分组处理子宫内膜上皮细胞稀释至IXIO5个mL，接种于6孔板，加样布板前要缓慢多次吹打。试验分为4组，即对照C组、F-2毒素组F-2毒素10ygmL、壳聚糖硒I组0.8ymolLSe+F-2毒素lOygmL和壳聚糖硒Π组（1.6ymolLSe+F-2毒素lOygmL，每组4个重复。细胞接种6d后处于生长对数期，弃掉培养液并清洗2次，更换培养液，壳聚糖硒I组和壳聚糖硒Π组更换含有〇.8ymolL和1.6ymolL以硒计的壳聚糖硒培养液。继续培养36h后取出细胞培养板，壳聚糖硒I组、壳聚糖硒Π组和F-2毒素组均加入F-2毒素，使其浓度为为10ygmL，继续培养12h后，培养结束。[0039]细胞总RNA提取取出培养板，弃培养液并清洗3次，收集子宫内膜上皮细胞置于无RNA酶管，（1加入1mLTrizol试剂，充分吹打低温静置5min，离心12000!111；[11，4°]，1〇111；[11，移取上清置于1.5mL无RNA酶的离心管中。⑵加200yL氯仿，振荡混勾，离心12000rmin，40C，10min，取其上清于另一1.5mL无RNA酶离心管内。（3加入500yL异丙醇，离心12000rmin，4°C，10111；[11，弃清液，（4加40^1^入预冷的75%乙醇，振荡混勾，离心75001'111；[11，4。]，5111；[11，弃上清。重复43次后超净台内干燥5min，加入25yLDEPC水于管内，60°C水浴溶解RNA沉淀，利用核酸浓度测定仪测定RNA浓度。置于-80°C冰箱保存备用。[0040]反转录成cDNA样品反转录见3-1，3_2表3-1样品RNA反转录体系反应条件:65°C10min，取出置于冰上。[0041]表3-2样品RNA反转录体系反应条件:37°C60min，85°C反应5min。反转录结束后将上述cDNA置于-20°C冰箱保存。[0042]引物设计猪子宫内膜上皮细胞的DAPDH和bax基因的引物，由Primer3设计，上海捷瑞生物工程公司合成，见表3-3。[0043]表3-3DATOH和bax引物序列3.6qPCR反应反应体系及反应条件见表3-4、3-5.表3-4qPCR反应体系表3-5qPCR扩增程序3.7猪子宫内膜上皮细胞bax基因mRNA表达量的测定猪子宫内膜上皮细胞bax基因mRNA表达量的测定结果见图3.结果表明，10ygmL的F-2毒素可极显著的升高猪子宫内膜上皮细胞中Bax基因的表达量P〈0.01，而0.8ymolL以硒计和1.6ymolL以硒计）的壳聚糖硒都能够极显著的降低F-2毒素所致的猪子宫内膜上皮细胞中Bax基因表达量的升高P〈0.01。

权利要求：1.壳聚糖硒在抑制F-2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞bax基因表达升高方面的应用。2.权利要求1所述壳聚糖硒抑制F-2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞bax基因表达升高的方法，其特征在于按如下的步骤进行：1猪子宫内膜细胞的分离与纯化：常规分离猪子宫内膜细胞，常规纯化猪子宫内膜上皮细胞；2猪子宫内膜上皮细胞培养与分组处理：将纯化后的子宫内膜上皮细胞稀释至IXIO5个mL，接种于6孔板中，试验可分为对照组、F-2毒素攻毒组和壳聚糖硒组，细胞接种5-7d后，更换培养液:对照组和F-2毒素攻毒组更换普通培养液;壳聚糖硒组更换含有壳聚糖硒的培养液，使其硒浓度为0.8-3.0μπιοίL;继续培养12-36h后取出细胞培养板，壳聚糖硒组和F-2毒素攻毒组均加入F-2毒素使其浓度为10-30ugmL，继续培养3-12h后，培养结束；3利用定量PCR仪进行qPCR反应测定bax基因表达量的改变：提取细胞总RNA，常规反转录RNA为cDNA，常规设计合成猪子宫内膜上皮细胞的内参基因和bax基因的引物、确定反应体系和反应条件，在定量PCR仪上对bax基因表达量进行测定。

百度查询： 天津农学院 壳聚糖硒在抑制F-2毒素所致猪子宫内膜上皮细胞bax基因表达升高方面的应用

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