申请/专利权人：杨恩茂

申请日：2016-08-29

公开（公告）日：2018-03-13

公开（公告）号：CN107796943A

主分类号：G01N33/68(2006.01)I

分类号：G01N33/68(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2020.03.17#发明专利申请公布后的视为撤回;2018.03.13#公开

摘要：一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、Bcl的影响，将所分离出的心肌细胞计数，各取1×106个细胞，分别加入4支试管中；40g・L‑１多聚甲醛固定60min，1500rmin离心，PBS清洗2次；将细胞重悬于10mL・L‑１ Tween80中30min,1500rmin离心，PBS清洗3次；每管加入封闭用羊血清100μL,20min，5mLL‑１Tween80清洗1次，PBS清洗2次；每试管中加入100μL1：100的小鼠抗大鼠Bax或Bcl2抗体，室温下孵育30min，加入5mL・L－１ Tween80孵育5～10min，1500rmin离心，PBS清洗2次；各试管中加入PBS 400μL，使用ALTRA流式细胞仪进行Bax和Bcl2蛋白的检测，结果用Bax、Bcl2的表达率和平均荧光强度表示。 

主权项：一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、Bcl的影响，将所分离出的心肌细胞计数，各取1×106个细胞，分别加入4支试管中；40g・L‑１多聚甲醛固定60min，1500rmin离心，PBS清洗2次；将细胞重悬于10mL・L‑１ Tween80中30min,1500rmin离心，PBS清洗3次；每管加入封闭用羊血清100μL,20min，5mLL‑１Tween80清洗1次，PBS清洗2次；每试管中加入100μL1：100的小鼠抗大鼠Bax或Bcl2抗体，室温下孵育30min，加入5mL・L－１ Tween80孵育5～10min，1500rmin离心，PBS清洗2次；各试管中加入PBS 400μL，使用ALTRA流式细胞仪进行Bax和Bcl2蛋白的检测，结果用Bax、Bcl2的表达率和平均荧光强度表示。

全文数据：一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、BeI的影响技术领域[0001]本发明涉及一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、Bcl的影响，具体地说是以一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、Bcl的影响。背景技术[0002]目前公知的压力超负荷时存在着心肌细胞凋亡。B细胞淋巴瘤白血病基因蛋白Bcl2蛋白）及其家族成员Bax蛋白在细胞凋亡的调控过程中起着重要的作用。发明内容[0003]诊断标准：材料与方法;动物及分组，普通级SD大鼠24只，雌性，体重180〜220g，购自广州中医药大学实验动物中心，随机分为8组，即大鼠造模后第1、4、7、10、14、21、30、40d8个时间点，每组各3只。主要器材与试剂，牙用不锈钢丝（上海牙科医械厂，批号：K41701;分析天平LIBRORAEU210，Shimadzu;抽滤器（NALGENE,NalgeCompany;离心机（LD52A，北京医用禹心、机厂）；光学显微镜（BH2，01ympus;流式细胞仪EPICSALTRA，BeckmanCoulter。FicollSigma，华美生物工程公司分装，批号:38H0588;多聚甲醛广州化学试剂厂，批号：99010136;小鼠抗大鼠BaxAb46A7Neomarkers，批号：714P010;小鼠抗大鼠Bcl2aAb410C4Neomarkers，批号：598P111;藻红蛋白（RPE标记的羊抗小鼠Fab，）2IgGSerotec，批号：28〇901;封闭用羊血清北京中山生物技术有限公司，批号:ZLI9021;RPE标记的羊Fab’）2IgGSouthernBiotechnologyAssociateInc，批号：J366W490B。心衰模型的复制，以腹主动脉缩窄法复制大鼠左心室压力超负荷模型。给大鼠腹腔注射l〇〇g_L-1水合氯醛，剂量35mL•kg-1，麻醉后，暴露腹主动脉，并于双侧肾动脉上方钝性分离腹主动脉，用4号缝合线将腹主动脉和与腹主动脉平行放置的外径约〇6〜09mm的牙用不锈钢丝一并结扎，然后轻轻取出不锈钢丝，使腹主动脉截面积缩窄至原来的25%〜30%左右，造成腹主动脉狭窄，关腹。假手术组，钝性分离腹主动脉后，缝合线仅绕于腹主动脉上，并不缩窄，且在术后3d内给予肌肉注射青霉素（ISOOOU’kg-l，以预防感染。取材;大鼠称体重mb〇dy后，麻醉，开胸，迅速取出心脏，分别称取整个心脏质量mheart及左心室的质量mLV，将左心室剪成两块，用针将心肌穿孔;置于含600mL_L—1甘油的DffiMDulbeccosModifiedEagleMedium的冻存管中，程序冷冻，最后保存于液氮中备用。心肌细胞的分离与纯化;从液氮中取出保存的心脏，迅速放入40°C水浴中解冻;用DMEM清洗心脏;将左心室剪碎成lmm3的小块，于KrebsHenseleit液中吹打lOmin以分离心肌细胞，必要时可重复1次;将含心肌细胞的溶液用1〇〇目网筛过滤，800rmin离心5min，01mol.L-1碟酸盐缓冲液PBS清洗2次，800rmin离心5min;将沉淀轻轻加入40g.L-1的Ficoll上，400rmin离心4min，弃上清，沉淀即为高纯度的杆状的心肌细胞。Bax、Bcl2蛋白的检测，将所分离出的心肌细胞计数，各取【X106个细胞，分别加入4支试管中；40g_L-l多聚甲醛固定60min，1500rmin离心，弃上清，PBS清洗2次;将细胞重悬于l〇mL_L-lTween8〇中3〇min，15〇Ormin离心，PBS清洗3次;每管加入封闭用羊血清lOOyL，20min，5mLL-lTween80清洗1次，PBS清洗2次;每试管中加入i〇〇uL1:100的小鼠抗大鼠Bax或Bel2抗体，室温下孵育30min，加入5mLL—1Tween80孵育5〜lOmin，1500rmin离心，PBS清洗2次；每试管中加入5此RPE标记的羊抗小鼠抗体或1〇此RPE标记的羊抗小鼠的同型对照，室温下孵育30min，加入5mL_L—lTween80孵育5〜lOmin，1500rmin离心，PBS清洗2次;各试管中加入PBS400uL，待上机检测。使用ALTRA流式细胞伩进行Bax和Bel2蛋白的检测，结果用Bax、Bcl2的表达率和平均荧光强度表示。结果；造模结果，24只大鼠中死亡8只，死亡大鼠均于3d内死于急性左心衰，解剖发现双肺明显瘀血，部分还伴有胸腔积液，其死亡与急性压力超负荷有关。大鼠在造模后心脏质量mheart、左心室的质量mLV逐渐增加，第30〜40天之间，其增幅有所减少；心脏、左心室质量与体重之比，即心脏质量指数（CMI，ICM=mheartmbody、左心室质量指数（LVMI，ILV=mLVrabody，亦随时间的延长而增加，约于第3〇天达到最高值，可能与后负荷增加引起的代偿性肥厚有关，到第40天时，二者的比值己开始降低。在腹主动脉缩窄后第1天，大鼠左心室心肌细胞Bax蛋白的表达率较高6375%，第4天已下降，在以后的时间中，其表达率变化不大，波动于50%〜60%之间；Bcl2蛋白的表达率于第1天时较低3145%，随后上升，第7天升至最高值7175%，尔后开始下降，第30天时其表达率最低228%;RBaxRBcl2于第1天时较高，第4天时已下降，第7天时降至最低，随后开始逐渐上升，第30天达到峰值24，到第40天时又下降，两者荧光强。[0004]发明目的：心脏的压力超负荷情况下，心脏首先代偿性地向心性肥厚，随后，心肌细胞增长，心室腔的扩大，心室几何形态的变化，心肌细胞外间质发生胶原沉积和纤维化，即心室重塑，最终因失代偿而发生心衰，在此过程中心功能的进行性恶化可能与心肌细胞凋亡有关。细胞凋亡受到程序控制，Bcl2和Bax是Bcl2家族中的重要成员，Bcl2蛋白抑制细胞凋亡，而Bax蛋白则促进细胞凋亡。Bel2、Bax蛋白可形成同源二聚体，也可相互间形成异源二聚体，Bcl2与Bax的比例RBcl2RBax决定细胞是否发生凋亡，尽管细胞内这一比例是固定的，但外界刺激可以改变抑制凋亡的Bcl2Bax与促进凋亡的BaxBax的量发生改变。随着Bcl2表达的增多，BaxBax分开，形成Bcl2Bax异源二聚体，若细胞中50%的Bax与Bcl2形成异源二聚体，若80%的Bax以同源二聚体的形式存在，则细胞容易发生凋亡。对压力超负荷大鼠心室肌细胞Bax、Be12蛋白的表达规律进行了研究。[0005]技术方案:大鼠称体重mbody后，麻醉，开胸，迅速取出心脏，分别称取整个心脏质量mheart及左心室的质量mLV，将左心室剪成两块，用针将心肌穿孔;置于含600mL.L—1甘油的DMEMDulbeccosModiHedEagleMedium的冻存管中，程序冷冻，最后保存于液氮中备用。心肌细胞的分离与纯化;从液氮中取出保存的心脏，迅速放入4TC水浴中解冻；用DMEM清洗心脏;将左心室剪碎成1誦3的小块，于KrebsHenseleit液中吹打10min以分离心肌细胞，必要时可重复1次；将含心肌细胞的溶液用100目网筛过滤，800rmin离心51^11，01111〇1化-1磷酸盐缓冲液？88清洗2次，8001'1^11离心51^11;将沉淀轻轻加入4^化-1的Ficoll上，400rmin离心4min，弃上清，沉淀即为高纯度的杆状的心肌细胞。Bax、Bcl2蛋白的检测，将所分离出的心肌细胞计数，各取IX106个细胞，分别加入4支试管中；40g*L-l多聚甲醛固定6〇min，1500rmin离心，弃上清，PBS清洗2次；将细胞重悬于10mL_L-1TweenSO中3〇min，1500rmin离心，PBS清洗3次;每管加入封闭用羊血清100yL，20min，5mLL-1TweenSO清洗1次，PBS清洗2次;每试管中加入100此1:100的小鼠抗大鼠Bax或Bcl2抗体，室温下孵育3〇min，加入5mL.L—1TweenSO孵育5〜lOmin，l5〇Ormin离心，PBS清洗2次；每试管中加入5yLRro标记的羊抗小鼠抗体或1〇此RpE标记的羊抗小鼠的同型对照，室温下孵育3〇min，加入5mL_L—lTween80孵育SMOminWOOrmin离心，PBS清洗2次；各试管中加入PBS400uL，使用ALTRA流式细胞仪进行Bax和Bc丨2蛋白的检测，结果用3狀、Bc丨2的表达率和平均荧光强度表示。[00^6]发明有益效果：在腹主动脉缩窄之后第丨天，大鼠左心室肌细胞Bax蛋白的表达率较高63•75%，Be12蛋白的表达率则较低3!•45%，BaxBc12较高（202;在以后的观察点中，Bax蛋白的表达率变化不大，波动于50%〜⑼%之间，而Bcl2蛋白的表达则于第7天升至最高值（71.75%，尔后开始下降，第30天时其表达率最低22.8%;BaxBcl2于第4天时下降，第7天时降至最低，随后开始逐渐上升，第30天达到峰值24，到第40天时又下降。[0007]最佳实施方式:运用药物治疗。[0008]创新之处:本项新型发明专利涉及一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、Bcl的影响，研究显示，当RBaxRBcl22时，细胞凋亡，反之则存活。Bcl2和Bax可独立地调节细胞凋亡。对腹主动脉缩窄引起的压力超负荷大鼠心室肌细胞表达Bax和Bcl2蛋白的规律进行了研宄，发现腹主动脉缩窄后第30天时大鼠左心室肌细胞Bel2表达率最低（228%;RBaxRBcl2比值最高24，压力超负荷大鼠心肌细胞凋亡发生的高峰可能在第30天。

权利要求：1.一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、Be1的影响，将所分离出的心肌细胞计数，各取1乂106个细胞，分别加入4支试管中；4^化-1多聚甲醛固定601^11，1500171^11离心，？1«清洗2次;将细胞重悬于lOmL.L-1Tween80中30min，1500rmin离心，PBS清洗3次;每管加入封闭用羊血清100uL，20min，5mLL-lTween80清洗1次，PBS清洗2次;每试管中加入100此1:100的小鼠抗大鼠881或13：12抗体，室温下孵育3〇111丨11，加入51111^化一1了\^61180孵育5〜1〇111；111，150〇rmin离心，PBS清洗2次；各试管中加入PBS400此，使用ALTRA流式细胞仪进行Bax和Bcl2蛋白的检测，结果用Bax、Bcl2的表达率和平均荧光强度表示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：将细胞重悬于lOmL.L-1TWeen80中30min，l5〇Ormin离心，PBS清洗3次；每管加入封闭用羊血清1〇〇此，2〇min，5mLL-lTween80清洗1次，PBS清洗2次；每试管中加入1〇〇此1:100的小鼠抗大鼠Bax或Bcl2抗体，室温下孵育30min，加入5mL.L—1Tween8〇孵育5〜10min，l5〇Ormin离心，PBS清洗2次；各试管中加入PBS400此，使用ALTRA流式细胞仪进行Bax和Bcl2蛋白的检测，结果用Bax、Bcl2的表达率和平均荧光强度表示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征是:每试管中加入lOOyLl:100的小鼠抗大鼠Bax或Bel2抗体，室温下孵育30min，加入5mLL—1Tween80孵育5〜lOmin，1500rmin离心，PBS清洗2次;各试管中加入PBS400uL，使用ALTRA流式细胞仪进行Bax和Be12蛋白的检测，结果用Bax、Bcl2的表达率和平均荧光强度表示。

百度查询： 杨恩茂 一种大鼠压力超负荷对心室肌细胞Bax、Bcl的影响

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