申请/专利权人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

申请日：2018-10-22

公开（公告）日：2019-02-01

公开（公告）号：CN109293755A

主分类号：C07K14/31(2006.01)I

分类号：C07K14/31(2006.01)I;C12N15/31(2006.01)I;A61K38/16(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.02.26#授权;2019.03.01#实质审查的生效;2019.02.01#公开

摘要：本发明公开了SEC2V101W及其在抗肿瘤中的应用。本发明公开的SEC2V101W为如下A1、A2、A3或A4：A1氨基酸序列是序列1的第22‑260位的蛋白质；A2氨基酸序列是序列1的蛋白质；A3将序列表中序列1或序列1的第22‑260位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有相同功能的蛋白质；A4在A1或A2或A3的N端或和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的SEC2V101W可以促进PBMC细胞的增殖，具有抑制肿瘤细胞和肿瘤生长的功能，且效果优于SEC2，可以用来治疗肿瘤。

主权项：1.蛋白质，为如下A1、A2、A3或A4：A1氨基酸序列是序列1的第22‑260位的蛋白质；A2氨基酸序列是序列1的蛋白质；A3将序列表中序列1或序列1的第22‑260位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有相同功能的蛋白质；A4在A1或A2或A3的N端或和C端连接标签得到的融合蛋白质。

全文数据：SEC2V101W及其在抗肿瘤中的应用技术领域本发明涉及生物医学领域中，SEC2V101W及其在抗肿瘤中的应用。背景技术肿瘤Tumor是指机体在某些因素的作用下，局部组织中的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生，从而形成的新生物。根据肿瘤的生物学特性及其对机体危害性的不同，肿瘤可分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。恶性肿瘤是威胁人类生命的恶疾之一，是困扰现代人健康的一大顽症，发病率逐年上升，死亡率仅次于心血管疾病，居各类疾病死亡率的第二位，且容易复发、很难治愈。肿瘤生长的根本原因之一是机体的免疫系统不能对其生长进行有效的控制，通过提高自身免疫系统的水平来对肿瘤细胞进行有效的杀伤己成为极具潜力的抗肿瘤手段。目前已经认识到机体抗肿瘤免疫中起主要作用的是杀伤性T细胞CytotoxicTLymphocyte,CTL介导的细胞免疫。生物反应调节剂治疗是通过调动机体内在的防御机制，重建或提高机体的免疫功能，从而清除肿瘤细胞。超抗原是一组由细菌编码的蛋白质分子,它们不需要抗原递呈细胞AntigenPresentingCell,APC的加工和处理，可以一端直接与APC膜上的MHCII类分子抗原结合槽外侧非限制性结合，另一端与T细胞受体TCellRecepter,TCR的Vβ片段相连接，在APC外形成MHCII-SAg-TCRVβ复合物，促使T细胞大量增殖，释放多种细胞因子，如IL、IFN和TNF，进而引发超抗原依赖性细胞介导细胞毒作用Superantigen-dependentcell-mediatedcytotoxicity，SDCC，对肿瘤产生极强的杀伤作用。葡萄球菌肠毒素CStaphylococcalEnterotoxinC,SEC是由金黄色葡萄球菌分泌的一种外毒素，SEC作为超抗原家族的一员，在体外和体内实验中，都表现出了良好的抗肿瘤活性和较低的毒性，现已被用于肿瘤免疫治疗。但SEC2本身是一种肠毒素，它的一些特性限制了其在抗肿瘤免疫治疗中的临床应用，如SEC2可以促进淋巴细胞增殖，对表达MHCII类分子正常细胞的生长也有一定的杀伤作用，因此，对自身免疫系统具有一定的抑制作用；一些研究学者还发现高剂量的SEC2可能会导致T细胞凋亡，降低抗肿瘤的活性。因此，增强SEC2抗肿瘤活性，降低SEC2毒性降低，是一个急需解决的问题。发明内容本发明所要解决的技术问题是如何治疗肿瘤。为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质，其名称为SEC2V101W，所述蛋白质为如下A1、A2、A3或A4：A1氨基酸序列是序列1的第22-260位的蛋白质；A2氨基酸序列是序列1的蛋白质；A3将序列表中序列1或序列1的第22-260位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有相同功能的蛋白质；A4在A1或A2或A3的N端或和C端连接标签得到的融合蛋白质。为了使A1中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1或序列1的第22-260位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。表、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6通常为5个RRRRRPoly-His2-10通常为6个HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述A3中的SEC2V101W蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加。上述A3中的SEC2V101W蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A3中的SEC2V101W蛋白质的编码基因可通过将序列3或序列3的第64-780位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和或进行一个或几个碱基对的错义突变，和或在其5′端和或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。序列3所示的DNA编码序列1所示的SEC2V101W蛋白质。本发明还提供了与SEC2V101W相关的生物材料，所述生物材料为下述B1至B7中的任一种：B1编码SEC2V101W的核酸分子；B2含有B1所述核酸分子的表达盒；B3含有B1所述核酸分子的重组载体、或含有B2所述表达盒的重组载体；B4含有B1所述核酸分子的重组微生物、或含有B2所述表达盒的重组微生物、或含有B3所述重组载体的重组微生物；B5含有B1所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2所述表达盒的转基因细胞系；B6含有B1所述核酸分子的转基因动物组织、或含有B2所述表达盒的转基因动物组织；B7含有B1所述核酸分子的转基因动物器官、或含有B2所述表达盒的转基因动物器官。上述生物材料中，B1所述核酸分子可为如下b1-b6中的任一种：b1编码序列是序列表中序列3的第64-780位的cDNA分子或DNA分子；b2序列表中序列3的第64-780位所示的cDNA分子或DNA分子；b3编码序列是序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子；b4序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子；b5与b1或b2或b3或b4限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码SEC2V101W的cDNA分子或DNA分子；b6在严格条件下与b1或b2或b3或b4或b5限定的核苷酸序列杂交，且编码SEC2V101W的cDNA分子或DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码SEC2V101W的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的SEC2V101W的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码SEC2V101W且具有SEC2V101W功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1或序列1的第22-260位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比％表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE或0.1×SSC、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述应用中，B2所述的含有编码SEC2V101W的核酸分子的表达盒SEC2V101W基因表达盒，是指能够在宿主细胞中表达SEC2V101W蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动SEC2V101W基因转录的启动子，还可包括终止SEC2V101W基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用现有的表达载体构建含有所述SEC2V101W基因表达盒的重组载体。上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pET-28a+。B3所述重组载体可含有序列3的第64-780位的DNA序列。进一步B3所述重组载体具体可为V-SEC2V101W。所述V-SEC2V101W为将pET-28a+的NdeI和XhoI识别序列间的DNA序列替换为序列3的第64-780位所示的DNA片段得到的表达序列1所示的蛋白质的重组载体。上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21DE3。上述应用中，所述转基因细胞系、转基因动物组织和转基因动物器官均不包括繁殖材料。本发明还提供了具有如下C1-C5中任一功能的产品，所述产品含有所述蛋白质或所述生物材料；C1抑制肿瘤细胞的生长；C2抑制肿瘤的生长；C3预防和或治疗肿瘤；C4促进外周血单个核细胞增殖；C5促进淋巴细胞增殖。所述产品可以所述蛋白质或所述生物材料作为其活性成分，还可将其他具有相同功能的物质一起作为其活性成分。上述产品中，所述肿瘤细胞可为实体肿瘤细胞；所述肿瘤为实体肿瘤可。所述实体肿瘤细胞可为消化道肿瘤细胞、肺癌细胞或宫颈癌细胞；所述实体肿瘤为可消化道肿瘤、肺癌或宫颈癌。本发明还提供了所述蛋白质或所述生物材料在制备具有如下C1-C5中任一功能产品中的应用：C1抑制肿瘤细胞的生长；C2抑制肿瘤的生长；C3预防和或治疗肿瘤；C4促进外周血单个核细胞增殖；C5促进淋巴细胞增殖。上述应用中，所述肿瘤细胞可为实体肿瘤细胞；所述肿瘤可为实体肿瘤。上述应用中，所述实体肿瘤细胞可为消化道肿瘤细胞、肺癌细胞或宫颈癌细胞；所述实体肿瘤可为消化道肿瘤、肺癌或宫颈癌。所述产品可为药物或疫苗。本发明还提供了所述蛋白质或所述生物材料的如下C1-C5中任一应用：C1抑制肿瘤细胞的生长；C2抑制肿瘤的生长；C3预防和或治疗肿瘤；C4促进外周血单个核细胞增殖；C5促进淋巴细胞增殖。上述应用中，所述肿瘤细胞可为实体肿瘤细胞；所述肿瘤可为实体肿瘤。上述应用中，所述实体肿瘤细胞可为消化道肿瘤细胞、肺癌细胞或宫颈癌细胞；所述实体肿瘤可为消化道肿瘤、肺癌或宫颈癌。本发明中，所述消化道肿瘤细胞可为肝癌细胞、胃癌细胞、口腔鳞状癌细胞或喉癌细胞。所述肝癌细胞具体可为SMMC-7721、HepG-2、BEL-7402或BEL-7405肿瘤细胞。所述肺癌细胞具体可为A549或GLC-82或Lewis肺癌细胞。所述胃癌细胞具体可为BGC-823。所述宫颈癌细胞具体可为Hela。所述口腔鳞状癌细胞具体可为KB或动物鳞状癌细胞VX-2所述喉癌细胞具体可为Hep2。所述消化道肿瘤可为肝癌、胃癌、口腔鳞状癌或喉癌。所述动物肺癌具体可为lewis肺癌细胞引发的肺癌。所述动物鳞状癌可由VX-2肿瘤细胞引发。所述产品可为药物或疫苗。实验证明，本发明的SEC2V101W可以促进PBMC细胞的增殖，具有抑制肿瘤细胞和肿瘤生长的功能，且效果优于SEC2，表明，本发明的SEC2V101W可以用来治疗肿瘤。附图说明图1为IPTG诱导后蛋白的SDS-PAGE的检测结果。M：蛋白质分子量标准；1：未加IPTG诱导的BL21-V-SEC2；2：IPTG诱导后的BL21-V-SEC2；3：未加IPTG诱导的BL21-V-mSEC2；4：IPTG诱导后的BL21-V-mSEC2。图2为纯化后的蛋白的SDS-PAGE检测结果。M：蛋白质分子量标准；1：BL21-V-SEC2得到的纯化后的蛋白质；2:BL21-V-mSEC2得到的纯化后的蛋白质。图3为纯化后的蛋白的Western-Blot检测结果。1：阳性对照；2：阴性对照；3:BL21-V-mSEC2得到的纯化后的蛋白质。图4为SEC2及其突变体蛋白mSEC2对人肝癌细胞SMMC-7721的体外生长抑制作用。图5为SEC2及其突变体蛋白mSEC2对人肝癌细胞HepG2的体外生长抑制作用。图6为SEC2及其突变体蛋白mSEC2对人肝癌细胞BEL-7402的体外生长抑制作用。图7为SEC2及其突变体蛋白mSEC2对人肝癌细胞BEL-7405的体外生长抑制作用。图8为SEC2及其突变体蛋白mSEC2对人肺癌细胞A549的体外生长抑制作用。图9为SEC2及其突变体蛋白mSEC2对人肺癌细胞GLC-82的体外生长抑制作用。图10为SEC2及其突变体蛋白mSEC2对人胃癌细胞BGC-823的体外生长抑制作用。图11为SEC2及其突变体蛋白mSEC2对人宫颈癌细胞Hela的体外生长抑制作用。图12为SEC2及其突变体蛋白mSEC2对人喉癌细胞Hep2的体外生长抑制作用。图13为SEC2及其突变体蛋白mSEC2对人口腔癌细胞KB的体外生长抑制作用。图14为SEC2及其突变体蛋白mSEC2对人肝细胞HL-7702的体外生长抑制作用。图15为SEC2V101W刺激人外周淋巴细胞PBMC增殖实验结果。Control表示本底对照。图4-图15中，*，P0.05；**，P0.01。图16为小鼠接瘤后体重变化图。图17为给药期间新西兰兔的体重变化情况。图18为给药期间每组新西兰兔的瘤体积变化情况。图19为致热毒性实验结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。细胞培养液RPMI1640为美国Hyclone公司产品。新生牛血清NCS为德国Biochrom公司产品。C57BL6小鼠和新西兰兔均为军事医学科学院实验动物中心产品。人肝癌细胞系SMMC-7721、HepG-2、BEL-7402，人肺癌细胞系A549、GLC-82，人胃癌BGC-823，人宫颈癌细胞系Hela，人口腔鳞状癌细胞系KB均记载Wangetal.，InvivoandInVitroAntitumorEffectsofaStaphylococcalEnterotoxinAMutantSEA-H61D，CancerInvestigation,28:788–796,2010一文中。人肝癌细胞系BEL-7405和人脑微血管内皮细胞HBMEC均记载在Guetal.，EvaluationofaRecombinantDoubleMutantofStaphylococcalEnterotoxinBSEB-H32QK173EwithEnhancedAntitumorActivityEffectsandDecreasedPyrexia一文中。实施例1、SEC2突变体蛋白SEC2V101W的制备本实施例提供一种SEC2记为wt-SEC2的突变体蛋白，该突变蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1的第22-260位，该突变蛋白的氨基酸序列和wt-SEC2其氨基酸序列为序列表中序列2的第22-260位区别仅在于第101位氨基酸残基的不同，将该突变蛋白命名为SEC2V101W。两种蛋白质的制备方法如下：一、重组载体与重组菌的构建合成序列表中序列3的第64-783位所示的DNA分子，序列3的第64-780位所示的DNA分子编码序列1的第22-260位所示的SEC2V101W，序列3编码序列1所示的蛋白质；合成序列表中序列4的第64-783位所示的DNA分子，序列4的第64-780位所示的DNA分子编码序列2的第22-260位所示的wt-SEC2，序列2编码序列2所示的蛋白质。将出发载体pET-28a+Novagen公司的NdeI和XhoI间的DNA片段替换为序列表中序列3的第64-783位所示的DNA分子，得到重组载体，将该重组载体命名为V-SEC2V101W。V-SEC2V101W能表达序列表中序列1所示的SEC2V101W与His-tag的融合蛋白质。将出发载体pET-28a+的NdeI和XhoI间的DNA片段替换为序列表中序列4的第64-783位所示的DNA分子，得到重组载体，将该重组载体命名为V-wt-SEC2。V-wt-SEC2能表达序列表中序列2所示的wt-SEC2与His-tag的融合蛋白质。将V-SEC2V101W、V-wt-SEC2以及出发载体pET-28a+分别导入大肠杆菌BL21DE3invitrogen公司中，将得到的重组菌分别命名为BL21-V-SEC2V101W、BL21-V-wt-SEC2和BL21-V。二、SEC2V101W与wt-SEC2的表达与纯化1、蛋白质的表达按照如下方法对BL21-V-SEC2V101W、BL21-V-wt-SEC2和BL21-V分别进行蛋白质的表达：将重组菌按1:100接种于5mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm在恒温振荡培养箱中过夜培养。次日将过夜培养的菌液按1：100转接到500mLLB液体培养基中，再加入适量卡那霉素，37℃、180rpm在旋转式恒温水浴摇床中培养至OD600＝0.5～0.6后，加入IPTG至其在培养液中的浓度为1mmolL，然后于30℃、180rpm下继续振荡培养4h诱导蛋白表达，得到培养液。并均利用不添加IPTG的培养体系作为对照。培养结束后将培养液于4℃8000rpm离心15min，收集菌体。将菌体用缓冲液A5mmolLPB，PB的溶剂为水，溶质及其在PB中的浓度分别为4.5mMNaH2PO4和0.5mMNa2HPO4，pH5.8重悬后，用超声破碎仪低温破碎至液体澄清，得到超声产物。之后将超声产物于4℃8000rpm离心15min，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤上清液，收集滤液，将滤液用缓冲液A稀释得到稀释后的上清液，待用。将得到的上清液进行SDS电泳，结果显示，经IPTG诱导后，BL21-V-SEC2V101W与BL21-V-wt-SEC2在相对分子质量约31×103Da处的蛋白表达条带均明显增粗，与预计的SEC2V101W和wt-SEC2的大小相符图1。2、蛋白质的纯化将CM弱阳离子层析柱美国Amersham公司安装到AKTAFPLC蛋白纯化分析仪美国Amersham公司，用蒸馏水洗泵和柱子同时紫外进行监测，至紫外吸收值达到基线后，将步骤1得到的稀释后的上清液以5mLmin的流速上样,上样完成后再用缓冲液A平衡至紫外检测线至基线。最后用缓冲液A和缓冲液B缓冲液B由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在缓冲液B中的浓度分别为500mMNaCl、32mMNa2HPO4和8mMNaH2PO4，pH7.4以5mLmin的流速进行线性洗脱60min，B％＝100，以3ml管收集洗脱峰，得到目的蛋白的洗脱液。具体洗脱方法为：洗脱时间为1小时，在整个洗脱时间内缓冲液A的体积百分比从100％线性降到0％，缓冲液B的体积百分比从0％线性升到100％。3、蛋白质的鉴定3.1SDS-PAGE鉴定配制15％的SDS-PAGE凝胶2块，从各洗脱峰样品管中吸出16μl放入EP管中，再加入4μl的上样缓冲液，混合均匀后放入沸水中煮约5min，短暂离心取上清，进行SDS-PAGE电泳。电泳完成后，进行考马斯亮蓝染色，观察结果。通过CM弱阳离子层析柱的纯化，将纯化得到的蛋白质进行SDS-PAGE电泳，结果显示每个目的蛋白的洗脱峰在相对分子质量约31kDa处均可见蛋白条带，而且蛋白纯度均超过90％，无明显杂带图2。3.2Western-Blot鉴定将纯化后的蛋白利用Western-Blot进行检测，所用一抗为小鼠抗SEC2抗体，二抗为HRP标记的羊抗小鼠抗体美国SantaCruz公司，最后用ECL显影。小鼠抗SEC2抗体为利用序列2所示的wt-SEC2与His-tag的融合蛋白质作为抗原，免疫小鼠北京维通利华实验动物技术有限公司得到的单克隆抗体，其制备方法见“雷祚荣，葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病，中国科学技术出版社”中肠毒素单克隆抗体制备。检测得到的单克隆抗体，结果显示，该单克隆抗体可以识别序列2所示的wt-SEC2与His-tag的融合蛋白质，并且具有高亲和力。以BL21-V-wt-SEC2得到的纯化的蛋白作为阳性对照，同时设有阴性对照无抗原。结果显示，BL21-V-SEC2V101W得到的纯化后的蛋白的检测结果呈现出阳性反应图3，说明，BL21-V-SEC2V101W得到了目的蛋白SEC2V101W，且SEC2V101W中的突变位点对其抗原性没有太大的影响，可供后续实验使用。实施例2、SEC2V101W的体外抗肿瘤实验利用MTS法检测SEC2V101W的体外抗肿瘤活性，所用受试细胞为如下12种：人肝癌细胞系SMMC-7721、HepG-2、BEL-7402、BEL-7405，人肺癌细胞系A549、GLC-82，人胃癌细胞系BGC-823，人宫颈癌细胞系Hela，人口腔鳞状癌细胞系KB，人喉癌细胞系Hep2，人正常肝细胞HL-7702，人脑微血管内皮细胞HBMEC。具体方法如下：1、取生长状态良好的上述各受试细胞，加入96孔细胞培养板A中，5×103个细胞孔，每孔一种细胞，所用培养液为含10％NCS新生牛血清的RPMI1640。2、将来源于志愿者经志愿者知情同意的外周血以GE公司的Ficoll-PaqueTMPLUS淋巴细胞分离液分离梯度离心得到PBMC，对新鲜分离出的PBMC计数，用含有10％vvNCS的细胞培养液RPMI1640调整细胞浓度，然后加入96孔细胞培养板B中，1×106个细胞孔。将实施例1得到的SEC2V101W和wt-SEC2分别从10μgml的工作浓度开始，利用含10％NCS新生牛血清的RPMI1640进行10倍梯度稀释后加入细胞培养板B的各孔中，每个浓度设三个复孔，SEC2V101W和wt-SEC2在细胞培养板B中的浓度均为如下六种：0.01、0.1、1、10、100和1000ngmL。3、步骤1完成后的细胞培养板A和步骤2完成后的细胞培养板B均在37℃5％CO2下孵育24h，然后将细胞培养板B中每孔的液体全部转移至细胞培养板A的孔中，细胞培养板A的每种细胞与细胞培养板B中的每种蛋白质及其每种浓度的体系混合，得到混合体系，因此，混合体系共有12×2×6种。4、将步骤3得到的混合体系均在37℃5％CO2下培养72h，弃上清液，然后向每孔中加入100μl无血清RPMI1640和20μlMTS染色剂，继续培养2h后检测490nm的OD值。上述实验设对照孔步骤1得到的细胞培养板A的各肿瘤细胞孔、步骤2得到的细胞培养板B的各PBMC细胞孔以及不添加SEC2V101W和wt-SEC2的PBMC细胞孔与受试细胞进行混合的混合细胞孔在相同条件下进行培养。细胞生长抑制率TGI按如下公式1计算，同时求IC50细胞生长抑制率达50％时的药物浓度。Am为PBMC与受试细胞混合孔不含SEC2V101W和wt-SEC2在实验结束时的OD值，Alym为步骤2得到的细胞培养板B的PBMC细胞孔在实验结束时的OD值，Atest为各实验孔即含有SEC2V101W或wt-SEC2的PBMC与受试细胞混合孔在实验结束时的OD值。实验结果表明wt-SEC2及SEC2V101W均可以不同程度的抑制肿瘤细胞的生长，并且呈现出一定的剂量依赖关系。突变体SEC2V101W对所有受试肿瘤细胞生长的抑制作用均强于wt-SEC2，其中对肝癌细胞SMMC-7721、HepG2、BEL-7402及BEL-7405，肺癌细胞A549、GLC-82，胃癌细胞BGC-823，喉癌细胞Hep2比较敏感，IC50值明显低于wt-SEC2；对宫颈癌细胞Hela、口腔癌细胞KB的抑制作用不明显，IC50值略低于wt-SEC2。对于正常肝细胞HL-7702，wt-SEC2对其生长抑制作用强于肿瘤细胞，IC50值到达7.79E-04ngml，而突变体SEC2V101W对其的生长抑制作用明显低于wt-SEC2，IC50值为5.65E-02ngml，对于人微血管内皮细胞HBMEC，wt-SEC2及突变体SEC2V101W对其的生长抑制作用明显低于肿瘤细胞，IC50值依次为47.8ngml、72.2ngml图4-14及表1。通过以上实验结果可以看出，突变体SEC2V101W对肿瘤细胞的杀伤作用高于wt-SEC2，而对于正常细胞，SEC2V101W的抑制作用低于wt-SEC2。同时可以看出，消化道肿瘤细胞对SEC2V101W敏感性要高于wt-SEC2，而消化道正常细胞HL-7702对SEC2V101W敏感性要低于wt-SEC2，因此可以看出SEC2101位点的突变提高了其对消化道肿瘤细胞的生长抑制作用。表1SEC2及其突变体蛋白mSEC2对各细胞系的IC50值实施例3、SEC2V101W刺激人外周血单个核细胞PBMC增殖实验超抗原可以刺激表达特定Vβ受体的T细胞大量增殖和活化，进而产生杀伤肿瘤细胞的作用。为了研究超抗原SEC2的101位结氨酸Val101突变为色氨酸Trp后对人外周血单个核细胞PBMC诱导增殖的影响，以wt-SEC2为对照，以不添加SEC2V101W为本底对照，进行了SEC2V101W刺激PBMC增殖实验。具体方法如下：将来源于志愿者经志愿者知情同意的外周血以GE公司的Ficoll-PaqueTMPLUS淋巴细胞分离液分离梯度离心得到PBMC，以含有10％vvNCS的细胞培养液RPMI1640混悬成单细胞悬液计数后以106个细胞孔加入96孔板中，然后每孔再加入100μl不同浓度的SEC2V101W溶液或wt-SEC2溶液，得到初始混合体系，不同浓度的SEC2V101W溶液或wt-SEC2溶液均利用10％vvNCS的RPMI1640进行稀释，SEC2V101W和wt-SEC2在初始混合体系中的浓度均分别为10-2ngml、10-1ngml、1ngml、10ngml、102ngml和103ngml。将不同初始混合体系分别在37℃、5％CO2培养箱培养72h。用荧光检测试剂检测PBMC增殖情况所用检测试剂为CellLuminescentATPCellViabilityAssaypromega公司。结果显示，实验结果显示，与本底对照相比wt-SEC2及SEC2V101W在10-2ngml到103ngml浓度范围内都能够显著诱导PBMC增殖P0.05。与wt-SEC2相比较，SEC2V101W在10-2ngml到1ngm浓度范围内浓度下PBMC的增殖有显著差异图15。由结果可知SEC2定点突变后得到的SEC2V101W的有丝分裂原性没有降低，不影响其超抗原活性，该结果与体外抗肿瘤实验一致。实施例4、体内抗肿瘤实验一、抑制鼠Lewis肺癌实验为了研究突变体SEC2V101W在体内激起T细胞的抗肿瘤免疫应答的能力是否强于wt-SEC2，采用了C57BL6小鼠的Lewis肺癌皮下移植瘤模型进行实验。具体方法如下：将C57BL6小鼠在SPF动物实验室中饲养两天，使其适应实验环境。取接种于C57BL6小鼠第8天的lewis肺癌瘤节lewis肺癌瘤节通过将lewis肺癌细胞LewislungcarcinomacellLLC,由中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所提供，记载在Wangetal.，InvivoandInVitroAntitumorEffectsofaStaphylococcalEnterotoxinAMutantSEA-H61D，CancerInvestigation,28:788–796,2010一文中接种于C57BL6小鼠得到，在接种第8天后取出，用PBS按照1：10稀释，配制成瘤细胞悬液，悬液中的细胞浓度为2-3×106个ml，接种于C57BL6小鼠前肢腋下，每只小鼠注射0.2mL，此为实验第0天。实验第1天，给动物称重、随机分组，每组10只小鼠，组别包括：阴性对照组即PBS组、阳性对照组wt-SEC2，250μgkg体重，SEC2V101W500、250、125μgkg体重剂量组分别记为SEC2V101W-H、SEC2V101W-M、SEC2V101W-L，并于第1，4，7天给药，给药前称重，给药方式为腹腔注射，所用药液均在给药前配制，并过滤除菌。阳性对照组和SEC2V101W各组中所用蛋白质wt-SEC2和SECV101W均利用PBS进行溶解，阴性对照组注射PBS，每只小鼠注射的体积均相等。实验的第11天，称重，处死小鼠，解剖、剥取瘤块并称重，观察肿瘤有无转移。最后统计各组动物的抑瘤率。抑瘤率＝1-实验组瘤重阴性对照组瘤重×100％。所得数据采用SPSS统计软件中ANOVA比较各组之间的差异，P0.05认为有显著性差异。实验结果显示小鼠在腋下接种肿瘤之后，体重先短暂下降后再上升，这符合小鼠接种肿瘤后的体重变化趋势图16。腹腔给予500、250、125μgkg体重剂量的SEC2V101W以及250μgkg剂量的wt-SEC2，均能明显抑制小鼠Lewis肺癌的生长，突变体SEC2V101W对肿瘤的抑制作用是呈剂量依赖性的，与PBS对照组相比均具有统计学意义，P值均小于0.05。突变体SEC2V101W三个剂量组对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用都强于wt-SEC2，且250μgkg体重剂量的SEC2V101W组与wt-SEC2组相比，具有统计学意义，P值均小于0.05。PBS组肿瘤在实验结束时达到2.33g，表明肿瘤生长良好。表2。表2SEC2及其突变体蛋白抑制小鼠Lewis肺癌体内实验n＝10注：与PBS组相比，a，P0.05；与wt-SEC2相比，b，P0.05。二、抑制兔VX-2肿瘤实验新西兰兔，雌性，2.5Kg左右，耳缘静脉取血0.5ml，过夜静置，取血清进行Elisa检测每只兔子的抗体，排除抗体过高的兔子，筛选出合格的兔子在动物房中饲养2天，使其适应实验环境。将VX-2上海素尔生物科技有限公司接种于新西兰兔腿部，接种一段时间后得到VX-2肿瘤。取接种于新西兰兔腿部肌肉的VX-2肿瘤，将肿瘤组织剪成约0.05g的小瘤块，置于含有浓度庆大霉素的RPMI1640中保存，备用。用戊巴比妥钠将新西兰兔麻醉，在其后腿外侧肌肉中包埋入之前制备好的瘤块，每只兔子一块。观察并测量兔子腿部外侧瘤径，当瘤块直径长至1-1.2cm时，根据瘤径和体重随机分组，每组4只兔子，组别依次为：阴性对照组相应溶剂,即PBS组、阳性对照组wt-SEC2，2.5μgkg体重，SECV101W5μgkg体重、2.5μgkg体重、1.25μgkg体重剂量组分别记为SEC2V101W-H、SEC2V101W-M、SEC2V101W-L，连续9天给药，并于给药前称重，给药方式为肌肉注射，所用药液均在给药前配制，将给药第一天记为治疗第1天。阳性对照组和SEC2V101W各组中所用蛋白质wt-SEC2和SECV101W均利用PBS进行溶解，阴性对照组注射PBS，每只新西兰兔注射的体积均相等。每2日测量1次瘤径，通过瘤径计算瘤体积，观察肿瘤的生长情况。在治疗第21天，称重后处死兔子，解剖，剥取瘤块并称重，计算抑瘤率。瘤体积＝长瘤径×短瘤径22。抑瘤率＝1-实验组瘤重PBS组瘤重×100％。所得数据采用SPSS统计软件中ANOVA模块比较各组之间的差异，P0.05认为有显著性差异。实验结果显示，整个给药期间，兔子体重并无明显的变化图17，精神状态良好,但是在开始给药后的第3天，SEC2V101W5μgkg剂量组死了一只兔子。从兔子瘤体积的变化趋势可以看出，PBS组的肿瘤生长非常快，几乎是成倍增长，而wt-SEC2组和SEC2V101W三个剂量组的肿瘤生长相对缓慢，尤其是在SEC2V101W三个剂量组中，各有一只兔子的肿瘤在给药后的第8天至第12天之间出现消退。肌肉注射5、2.5、1.25μgkg体重剂量的SEC2V101W以及2.5μgkg体重剂量的wt-SEC2，均能明显抑制兔VX-2肿瘤的生长，SEC2V101W3个剂量组的肿瘤体积与PBS对照组相比均具有统计学意义，P值均小于0.05。SEC2V101W3个剂量组对兔VX-2肿瘤的抑制作用是呈剂量依赖关系的，并且抑瘤率在90.38％-83.32％之间，均明显强于wt-SEC2对兔VX-2的抑瘤效果，说明突变体SEC2V101W的抗肿瘤活性得到了提高。图18。PBS组肿瘤在实验结束时达到46.72g，表明肿瘤生长良好表4。表4SEC2及其突变体蛋白抑制兔VX-2肿瘤体内实验n＝4注：与PBS组相比，*，P0.05。实施例5、致热毒性实验葡萄球菌肠毒素SE具有一定的毒性，如引发发热，恶心、呕吐、腹泻等，SEC2作为肠毒素家族的一员，一样会有这些毒副作用。上述实验证明突变体SEC2V101W的抗肿瘤活性强于wt-SEC2，为了验证该位点的突变是否会对它的毒性产生影响，选用了兔子模型来考察其致热毒性。由于体温本身会有一定的变化，因此在给药后4小时之内，兔子的体温升高超过0.5℃以上，被认为是发热。方法如下：新西兰兔，雌性，2.5Kg左右，在动物房中饲养2天，使其适应实验环境。选择一周内体温处于38.6-39.5℃之间且比较稳定的兔子作为实验对象。根据体重随机分为3组，每组4只，组别依次为：PBS阴性对照组、wt-SEC2阳性对照组10μgkg体重，SEC2V101W实验组10μgkg体重。给药方式为耳缘静脉注射，所用药液均在给药前配制，将给药时记为给药0h。wt-SEC2阳性对照组和SEC2V101W实验组中所用蛋白质wt-SEC2和SECV101W均利用PBS进行溶解，阴性对照组注射PBS，每只新西兰兔注射的体积均相等。给药前测量兔子的体温，作为零点温度，再测量给药1h、2h、3h、4h的体温，与零点温度对比。实验结果表明，耳缘静脉注射10μgKg的蛋白后，wt-SEC2组和突变体SEC2V101W组兔子的体温在第1h时，无明显变化，在第2h时，体温明显升高，在第4h时，体温升到最高，而PBS对照组兔子的体温基本保持不变。wt-SEC2组平均体温最高时上升了1.53℃，而SEC2V101W组平均体温最高时上升了1.67℃，但两组无显著性差异图19。这说明突变体SEC2V101W的致热毒性同wt-SEC2相比，有增强，但不显著。110中国人民解放军军事科学院军事医学研究院120SEC2V101W及其在抗肿瘤中的应用1604170PatentInversion3.52101211260212PRT213人工序列4001MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro151015ArgGlySerHisMetGluSerGlnProAspProThrProAspGluLeu202530HisLysSerSerGluPheThrGlyThrMetGlyAsnMetLysTyrLeu354045TyrAspAspHisTyrValSerAlaThrLysValMetSerValAspLys505560PheLeuAlaHisAspLeuIleTyrAsnIleSerAspLysLysLeuLys65707580AsnTyrAspLysValLysThrGluLeuLeuAsnGluAspLeuAlaLys859095LysTyrLysAspGluValValAspValTyrGlySerAsnTyrTyrVal100105110AsnCysTyrPheSerSerLysAspAsnTrpGlyLysValThrGlyGly115120125LysThrCysMetTyrGlyGlyIleThrLysHisGluGlyAsnHisPhe130135140AspAsnGlyAsnLeuGlnAsnValLeuIleArgValTyrGluAsnLys145150155160ArgAsnThrIleSerPheGluValGlnThrAspLysLysSerValThr165170175AlaGlnGluLeuAspIleLysAlaArgAsnPheLeuIleAsnLysLys180185190AsnLeuTyrGluPheAsnSerSerProTyrGluThrGlyTyrIleLys195200205PheIleGluAsnAsnGlyAsnThrPheTrpTyrAspMetMetProAla210215220ProGlyAspLysPheAspGlnSerLysTyrLeuMetMetTyrAsnAsp225230235240AsnLysThrValAspSerLysSerValLysIleGluValHisLeuThr245250255ThrLysAsnGly2602102211260212PRT213人工序列4002MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro151015ArgGlySerHisMetGluSerGlnProAspProThrProAspGluLeu202530HisLysSerSerGluPheThrGlyThrMetGlyAsnMetLysTyrLeu354045TyrAspAspHisTyrValSerAlaThrLysValMetSerValAspLys505560PheLeuAlaHisAspLeuIleTyrAsnIleSerAspLysLysLeuLys65707580AsnTyrAspLysValLysThrGluLeuLeuAsnGluAspLeuAlaLys859095LysTyrLysAspGluValValAspValTyrGlySerAsnTyrTyrVal100105110AsnCysTyrPheSerSerLysAspAsnValGlyLysValThrGlyGly115120125LysThrCysMetTyrGlyGlyIleThrLysHisGluGlyAsnHisPhe130135140AspAsnGlyAsnLeuGlnAsnValLeuIleArgValTyrGluAsnLys145150155160ArgAsnThrIleSerPheGluValGlnThrAspLysLysSerValThr165170175AlaGlnGluLeuAspIleLysAlaArgAsnPheLeuIleAsnLysLys180185190AsnLeuTyrGluPheAsnSerSerProTyrGluThrGlyTyrIleLys195200205PheIleGluAsnAsnGlyAsnThrPheTrpTyrAspMetMetProAla210215220ProGlyAspLysPheAspGlnSerLysTyrLeuMetMetTyrAsnAsp225230235240AsnLysThrValAspSerLysSerValLysIleGluValHisLeuThr245250255ThrLysAsnGly2602103211783212DNA213人工序列4003atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccat60atggagagtcaaccagaccctacgccagatgagttgcacaaatcaagtgagtttactggt120acgatgggtaatatgaaatatttatatgatgatcattatgtatcagcaactaaagttatg180tctgtagataaatttttggcacatgatttaatttataacattagtgataaaaaactaaaa240aattatgacaaagtgaaaacagagttattaaatgaagatttagcaaagaagtacaaagat300gaagtagttgatgtgtatggatcaaattactatgtaaactgctatttttcatccaaagat360aattggggtaaagttacaggtggtaaaacttgtatgtatggaggaataacaaaacatgaa420ggaaaccactttgataatgggaacttacaaaatgtacttataagagtttatgaaaataaa480agaaacacaatttcttttgaagtgcaaactgataagaaaagtgtaacagctcaagaacta540gacataaaagctaggaattttttaattaataaaaaaaatttgtatgagtttaacagttca600ccatatgaaacaggatatataaaatttattgaaaataacggcaatactttttggtatgat660atgatgcctgcaccaggcgataagtttgaccaatctaaatatttaatgatgtacaacgac720aataaaacggttgattctaaaagtgtgaagatagaagtccaccttacaacaaagaatgga780taa7832104211783212DNA213人工序列4004atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccat60atggagagtcaaccagaccctacgccagatgagttgcacaaatcaagtgagtttactggt120acgatgggtaatatgaaatatttatatgatgatcattatgtatcagcaactaaagttatg180tctgtagataaatttttggcacatgatttaatttataacattagtgataaaaaactaaaa240aattatgacaaagtgaaaacagagttattaaatgaagatttagcaaagaagtacaaagat300gaagtagttgatgtgtatggatcaaattactatgtaaactgctatttttcatccaaagat360aatgtaggtaaagttacaggtggtaaaacttgtatgtatggaggaataacaaaacatgaa420ggaaaccactttgataatgggaacttacaaaatgtacttataagagtttatgaaaataaa480agaaacacaatttcttttgaagtgcaaactgataagaaaagtgtaacagctcaagaacta540gacataaaagctaggaattttttaattaataaaaaaaatttgtatgagtttaacagttca600ccatatgaaacaggatatataaaatttattgaaaataacggcaatactttttggtatgat660atgatgcctgcaccaggcgataagtttgaccaatctaaatatttaatgatgtacaacgac720aataaaacggttgattctaaaagtgtgaagatagaagtccaccttacaacaaagaatgga780taa783

权利要求：1.蛋白质，为如下A1、A2、A3或A4：A1氨基酸序列是序列1的第22-260位的蛋白质；A2氨基酸序列是序列1的蛋白质；A3将序列表中序列1或序列1的第22-260位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有相同功能的蛋白质；A4在A1或A2或A3的N端或和C端连接标签得到的融合蛋白质。2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1至B7中的任一种：B1编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；B2含有B1所述核酸分子的表达盒；B3含有B1所述核酸分子的重组载体、或含有B2所述表达盒的重组载体；B4含有B1所述核酸分子的重组微生物、或含有B2所述表达盒的重组微生物、或含有B3所述重组载体的重组微生物；B5含有B1所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2所述表达盒的转基因细胞系；B6含有B1所述核酸分子的转基因动物组织、或含有B2所述表达盒的转基因动物组织；B7含有B1所述核酸分子的转基因动物器官、或含有B2所述表达盒的转基因动物器官。3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1所述核酸分子为如下b1-b6中的任一种：b1编码序列是序列表中序列3的第64-780位的cDNA分子或DNA分子；b2序列表中序列3的第64-780位所示的cDNA分子或DNA分子；b3编码序列是序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子；b4序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子；b5与b1或b2或b3或b4限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；b6在严格条件下与b1或b2或b3或b4或b5限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。4.具有如下C1-C5中任一功能的产品，含有权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料；C1抑制肿瘤细胞的生长；C2抑制肿瘤的生长；C3预防和或治疗肿瘤；C4促进外周血单个核细胞增殖；C5促进淋巴细胞增殖。5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述肿瘤细胞为实体肿瘤细胞；所述肿瘤为实体肿瘤。6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述实体肿瘤细胞为消化道肿瘤细胞、肺癌细胞或宫颈癌细胞；所述实体肿瘤为消化道肿瘤、肺癌或宫颈癌。7.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在制备具有如下C1-C5中任一功能产品中的应用：C1抑制肿瘤细胞的生长；C2抑制肿瘤的生长；C3预防和或治疗肿瘤；C4促进外周血单个核细胞增殖；C5促进淋巴细胞增殖。8.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料的如下C1-C5中任一应用：C1抑制肿瘤细胞的生长；C2抑制肿瘤的生长；C3预防和或治疗肿瘤；C4促进外周血单个核细胞增殖；C5促进淋巴细胞增殖。9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为实体肿瘤细胞；所述肿瘤为实体肿瘤。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述实体肿瘤细胞为消化道肿瘤细胞、肺癌细胞或宫颈癌细胞；所述实体肿瘤为消化道肿瘤、肺癌或宫颈癌。

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