申请/专利权人：黄河科技学院

申请日：2015-12-04

公开（公告）日：2019-02-26

公开（公告）号：CN105296566B

主分类号：C12P17/16(2006.01)I

分类号：C12P17/16(2006.01)I;C12R1/645(2006.01)N

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2019.02.26#授权;2016.03.02#实质审查的生效;2016.02.03#公开

摘要：本发明涉及一种制备可皆霉素的方法，将狭旋毛壳菌种活化后制备种子液，将种子液发酵培养，将发酵培养得到的菌体用乙酸乙酯提取，得到乙酸乙酯提取物，再将乙酸乙酯提取物分离后得到可皆霉素。本发明以球壳科毛壳属狭旋毛壳为原料进行可皆霉素的提取分离，方法简单，成本低，具有可持续性，分离得到可皆霉素单体，提取分离过程中用到的溶剂可回收利用，提取量大，可工业化生产。

主权项：1.一种可皆霉素制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种到平板培养基上，25℃恒温培养72小时，获得活化菌种；（2）制备种子液：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到装有无菌培养液A的无菌三角瓶中，转速为150rpm，温度为25℃条件下震荡培养72小时，获得种子液；培养液A的配方为：胰蛋白胨10gL，酵母提取物5gL，氯化钠10gL，pH 6.0±0.1；（3）发酵培养：将步骤（2）制备的种子液与培养液B按照体积比为5：100接入到无菌三角瓶中，转速为150rpm，温度为25℃条件下震荡培养7d，获得发酵液；培养液B的配方为：葡萄糖40 gL，蛋白胨 10 gL，酵母粉 10 gL，pH6.0±0.1；（4）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（3）制备的发酵液用医用纱布过滤，得到狭旋毛壳菌体，将狭旋毛壳菌体用乙酸乙酯提取，得到乙酸乙酯提取液，31~33℃下减压除去乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；（5）可皆霉素的制备：将步骤（4）制备的乙酸乙酯提取物用80～100目硅胶拌样后装柱，固定相为200~300目硅胶，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯甲烷‑甲醇的体积比为100：（2~4）的流份，31~33℃下减压除去二氯甲烷和甲醇，得可皆霉素。

全文数据：一种制备可皆霉素的方法技术领域本发明属于可皆霉素生产技术领域，具体涉及一种制备可皆霉素的方法。背景技术可皆霉素为苯醌类化合物，分子式为C32H30N2O4；分子量：506.22；CAS登录号：11051-88-0，结构式为。到目前为止，可皆霉素仅在毛壳属（Chaetomiumglobosum,C.cochliodes）中分离得到。Brewerr的科研团队发现，在1-10μgml时，可皆霉素抑制多属真菌的生长，并能抑制真菌Botrytisallii和Fusarirmmoniliforme孢子的萌发，可皆霉素相对稳定，成盐后，稳定性上升，其形成三乙胺盐后，水溶性显著增加，且溶解后能显著抑制多种微生物质的生长（BrewerD,JerramWA,MeilerD,etal.Thetoxicityofcochliodinol,anantibioticmetaboliteofChaetomiumspp.[J].CanadianJournalofmicrobiology,1970,16:433-440.）。同时发现可皆霉素在低浓度时，能够抑制多种镰刀菌的生长（BrewerD,TaylorA.Theeffectofcochliodinol,ametaboliteofChaetomiumcochliodes,ontherespirationofmicrosporesofFusarizimoxysporum[J].CanadianJournalofmicrobiology,1971,17:83-86.），而镰刀菌可侵染多种植物粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物，引起植物多种病害，造成作物大量死亡，是生产上防治最具挑战性的的病害之一，由此可见，其在植物病害防治方面的潜在应用价值非常大。Casellada等研究发现可皆霉素具有显著细胞毒性，可以抑制人口腔上皮癌细胞KB和乳腺癌细胞MDA-MB-435的增殖，IC50分别为0.53μM、2.20μM，（CasellaTM,EparvierV,Mandavid,etal.Antimicrobialandcytotoxicsecondarymetabolitesfromtropicalleafendophytes:IsolationofantibacterialagentpyrrocidineCfromLewiainfectoriaSNB-GTC2402[J].Phytochemistry,201396:370-377）。可皆霉素具有以上诸多生物活性，但是由于提取工艺的限制，产品含量低，而且合成成本高，无法进行更深入研究。发明内容本发明的目的是提供一种原料成本较低、工艺简单、纯度高的提取可皆霉素的方法。本实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种制备可皆霉素的方法，包括以下步骤：（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种到平板培养基上，25℃恒温培养72小时，获得活化菌种；（2）制备种子液：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到装有无菌培养液A的无菌三角瓶中，转速为150rpm，温度为25℃条件下震荡培养72小时，获得种子液；培养液A的配方为：胰蛋白胨10gL，酵母提取物5gL，氯化钠10gL，pH6.0±0.1；（3）发酵培养：将步骤（2）制备的种子液与培养液B按照体积比为5：100接入到无菌三角瓶中，转速为150rpm，温度为25℃条件下震荡培养7d，获得发酵液；培养液B的配方为：葡萄糖40gL，蛋白胨10gL，酵母粉10gL，pH6.0±0.1；（4）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（3）制备的发酵液用医用纱布过滤，得到狭旋毛壳菌体，将狭旋毛壳菌体用乙酸乙酯提取，得到乙酸乙酯提取液，31~33℃下减压除去乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；（5）可皆霉素的制备：将步骤（4）制备的乙酸乙酯提取物用80～100目硅胶拌样后装柱，固定相为200~300目硅胶，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100：（2~4）的流份，31~33℃下减压除去二氯甲烷和甲醇，得可皆霉素。所述步骤（1）中平板培养基配方为：酵母膏10gL，葡萄糖40gL，蛋白胨10gL，琼脂粉20gL，pH6.0±0.1。所述步骤（4）中将将狭旋毛壳菌体用乙酸乙酯提取时，用乙酸乙酯提取3次，每次提取时20~25℃冷浸10小时，每次提取时狭旋毛壳菌体与乙酸乙酯的固液比为1g︰30ml。所述步骤（5）中将乙酸乙酯提取物与硅胶拌样时，乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶的重量比为1︰2。本发明产生的有益效果是：本发明以球壳科毛壳属狭旋毛壳为原料进行可皆霉素的提取，提取方法简单，成本低，具有可持续性，提取得到可皆霉素单体，提取过程中用到的溶剂可回收利用，提取量大，可工业化生产。具体实施方式实施例1本实施列的制备可皆霉素的方法包括以下步骤：（1）菌种活化将狭旋毛壳菌种（来自于美国模式培养物集存库，菌种编号：ATCCNO.56725）接种到平板培养基上，25℃恒温培养72小时，获得活化菌种；平板培养基配方为：酵母膏10gL，葡萄糖40gL，蛋白胨10gL，琼脂粉20gL，pH6.0±0.1；（2）制备种子液：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到装有无菌培养液A的无菌三角瓶中，转速为150rpm，温度为25℃条件下震荡培养72小时，获得种子液；培养液A的配方为：胰蛋白胨10gL，酵母提取物5gL，氯化钠10gL，pH6.0±0.1；（3）发酵培养：将步骤（2）制备的种子液与培养液B按照体积比为5：100接入到无菌三角瓶中，转速为150rpm，温度为25℃条件下震荡培养7d，获得发酵液；培养液B的配方为：葡萄糖40gL，蛋白胨10gL，酵母粉10gL，pH6.0±0.1；（4）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤3制备的发酵液用医用纱布过滤，得到狭旋毛壳菌体，将菌体用乙酸乙酯提取3次（每次23℃下冷浸10小时，每次提取时狭旋毛壳菌体与乙酸乙酯的固液比为1g︰30ml），得到乙酸乙酯提取液，通过旋转蒸发仪31~33℃下减压除去乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；（5）可皆霉素的制备：将步骤4制备的乙酸乙酯提取物用80～100目硅胶拌样后装柱，固定相为200~300目硅胶，乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶的重量比为1:2，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱二氯甲烷－甲醇体积比为100:0；100:1；100:2；100:4；100:8，以硅胶薄层层析，紫外254nm检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100：2和100:4的流份，旋转蒸发仪31~33℃下减压除去二氯甲烷和甲醇，得可皆霉素（纯度为98.76%）。采用本实施例的方法所提取到的可皆霉素的结构鉴定如下：【性状】紫色粉末【鉴定】分子式：C32H30N2O4,分子量：506.2206仪器设备：Agilent1100液相色谱仪,1H,13CNMR图谱由Brukeram-400MHz核磁共振仪测定TMS为内标,质谱由Agilent6490型质谱仪测定。利用ESI-MS，1HNMR和13CNMR试验，标准数据如下：ESI-MSmz:505.2124[M-H]+;1HNMRCDCl3,400MHzδ:8.411H,s,2,5-OH,8.131H,s,1-NH,7.601H,s,H-2,7.441H,s,H-4,7.341H,d,J=8.4,H-7,7.081H,d,J=8.4,H-6,5.401H,m,H-11,3.461H,m,H-10,1.753H,s,13-CH3,1.741H,s,14-CH3;13CNMRCDCl3,100MHzδ:134.4C-8,133.9C-5,131.7C-12,127.2C-2,126.3C-9,124.5C-11,123.6C-6,120.9C-4,111.1C-7,110.8C-3,C-6,104.4C-3,34.7C-10,25.8C-14,17.9C-13.【检查】利用TLC，在UV254nm呈强荧光；以硫酸显色剂，110℃下20秒钟，呈现棕色。【含量测定】利用HPLC，色谱条件：SepaxGP-C185μm（250mm×4.6mm）色谱柱。流动相：乙腈︰水︰甲酸为10︰90︰0.1；流速：1.25mLmin，检测波长254nm，保留时间值9.46min。最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明,而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

权利要求：1.一种可皆霉素制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种到平板培养基上，25℃恒温培养72小时，获得活化菌种；（2）制备种子液：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到装有无菌培养液A的无菌三角瓶中，转速为150rpm，温度为25℃条件下震荡培养72小时，获得种子液；培养液A的配方为：胰蛋白胨10gL，酵母提取物5gL，氯化钠10gL，pH6.0±0.1；（3）发酵培养：将步骤（2）制备的种子液与培养液B按照体积比为5：100接入到无菌三角瓶中，转速为150rpm，温度为25℃条件下震荡培养7d，获得发酵液；培养液B的配方为：葡萄糖40gL，蛋白胨10gL，酵母粉10gL，pH6.0±0.1；（4）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（3）制备的发酵液用医用纱布过滤，得到狭旋毛壳菌体，将狭旋毛壳菌体用乙酸乙酯提取，得到乙酸乙酯提取液，31~33℃下减压除去乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；（5）可皆霉素的制备：将步骤（4）制备的乙酸乙酯提取物用80～100目硅胶拌样后装柱，固定相为200~300目硅胶，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100：（2~4）的流份，31~33℃下减压除去二氯甲烷和甲醇，得可皆霉素。2.如权利要求1所述可皆霉素制备方法，其特征在于，步骤（1）中平板培养基配方为：酵母膏10gL，葡萄糖40gL，蛋白胨10gL，琼脂粉20gL，pH6.0±0.1。3.如权利要求1中所述可皆霉素制备方法，其特征在于，步骤（4）中将狭旋毛壳菌体用乙酸乙酯提取时，用乙酸乙酯提取3次，每次提取时于20~25℃冷浸10小时，每次提取时狭旋毛壳菌体与乙酸乙酯的固液比为1g︰30ml。4.如权利要求1中所述可皆霉素制备方法，其特征在于，步骤（5）中将乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶拌样时，乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶的重量比为1︰2。5.如权利要求1中所述可皆霉素制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述狭旋毛壳菌采用美国模式培养物集存库所保藏的编号为ATCCNO.56725的菌株2。

百度查询： 黄河科技学院 一种制备可皆霉素的方法

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD