【发明公布】BAX靶向二聚化以调节BAX活性_阿尔伯特爱因斯坦医学院公司_201580041045.6 

申请/专利权人:阿尔伯特爱因斯坦医学院公司

申请日:2015-05-28

公开(公告)日:2017-05-10

公开(公告)号:CN106661582A

主分类号:C12N15/12(2006.01)I

分类号:C12N15/12(2006.01)I;C07K14/82(2006.01)I;C07K14/47(2006.01)I

优先权:["2014.05.30 US 62/005,013"]

专利状态码:失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态:2017.05.10#公开;2018.01.12#发明专利申请公布后的视为撤回

摘要:提供了鉴别试剂的方法,所述试剂通过促进或干扰BCL‑2相关x蛋白BAX的二聚化来直接调节BAX。还提供了通过影响二聚化来直接调节BAX的试剂。

主权项:一种鉴别用作促进或抑制细胞死亡的候选试剂的试剂的方法,所述方法包括:a使试剂与BCL‑2相关X蛋白BAX单体或其部分、和或与BAX二聚体接触,以及b测量试剂是否抑制或促进BAX的二聚化;其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时BAX单体与其它BAX单体或与BAX单体的部分的结合减少表明试剂抑制BAX的二聚化,其中抑制BAX的二聚化的试剂是用于促进细胞死亡的候选试剂;以及其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时BAX单体或其部分与其它BAX单体或其部分的结合增加表明试剂促进BAX的二聚化,其中促进BAX的二聚化的试剂是用于抑制细胞死亡的候选试剂。

全文数据:BAX靶向二聚化以调节BAX活性[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请要求2014年5月30日提交的美国临时专利申请号62005,013的权益,所述美国临时专利申请的内容以全文引用方式并入本文。[0003]政府利益声明[0004]本发明是在由国家心肺和血液研究所(NationalHeart,Lung,andBloodInstitute颁发的基金号5R00HL095929下由政府支持进行的。政府在本发明中具有某些权利。背景技术[0005]发明背景[0006]贯穿本申请,各种出版物由括号中的数字指代。这些参考文献的完整引用可在说明书的结尾处找到。本文提到的这些出版物以及所有专利、专利申请公布和书籍的公开特此以全文引用方式并入本申请,以更充分描述本发明从属的领域。[0007]程序性细胞死亡或细胞凋亡是调控细胞生存和死亡之间关键平衡的基本过程1。细胞凋亡失调导致正常内稳态失衡,促成诸如癌症和神经变性的疾病2,3。细胞凋亡失调是包括癌症、心血管疾病和神经变性疾病的若干高死亡率人类疾病的关键。蛋白质的BCL-2家族包括调控细胞在线粒体途径处定型向凋亡的复杂相互作用网络4,5ACL-2家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白二者。促凋亡BCL-2蛋白一BCL-2相关X蛋白(BAX和BCL-2同源拮抗物杀伤物(BAK-诱导线粒体外膜透化并且代表线粒体凋亡的关键守门因子gatekeeper和效应因子。因此,促凋亡BAX或BAK的抑制损害在包括心肌细胞和神经元的终末分化细胞中引发过早或不需要的细胞死亡的细胞能力。此外,BAX或BAK的激活促进凋亡并且可克服肿瘤细胞对经受细胞死亡的抗性和封闭性。[0008]促凋亡BAX是在非凋亡细胞的细胞溶质中占主导的BCL-2家族4,5的关键效应因子成员(6。在激活后,BAX从细胞溶质移位至线粒体以执行线粒体外膜的透化并且将凋亡因子(apoptogen释放入细胞溶质(7,8,这是线粒体功能障碍和凋亡的"不可返回点""pointofnoreturn")(9,10〇[0009]促凋亡BAX是高度受调控的蛋白,其与触发或抑制其激活的促凋亡和抗凋亡BCL-2蛋白相互作用。诸如BCL-2和BCL-Xl的抗凋亡BCL-2蛋白直接抑制激活的BAX,而诸如BM和BID的促凋亡BCL-2蛋白亚组使用它们的BH3结构域直接触发MX激活。MX的细胞溶质构象具有位于其结构的N末端表面的BH3触发位点。MX与钉合stapledB頂BH3螺旋经过N末端触发位点螺旋α1α6的相互作用导致涉及一系列构象变化的BAX激活。这些构象变化包括α1-α2环从封闭构象置换至开放构象以及α2ΒΗ3结构域和α9螺旋从疏水核心活动化以允许线粒体移位和寡聚化,从而导致线粒体透化。[0010]尽管在理解MX激活上已有显著进展,当前关于MX调控机制的知识是有限的。仅理解了激活的BAX是如何通过MXΒΗ3结构域与抗凋亡BCL-2蛋白的ΒΗ3沟相互作用而抑制的。然而,已经报道了众多抑制细胞溶质BAX的蛋白,并且已研究了稳定BAX的细胞溶质形式的翻译后修饰。出现的数据表明在不需要MX激活的情况下,BAX在细胞溶质与线粒体区室之间具有高度动态的定位。然而,不存在细胞溶质BAX如何保持在控制之下的结构证据或任何机制理解。当前的知识局限于完整BAX的结构,完整BAX的NMR结构表明其α9构象使蛋白保持无活性细胞溶质形式,从而防止蛋白移位至线粒体膜。[0011]最近的研究报道了除全长MX结构的N末端表面处的激活位点以外,在缺少C末端螺旋α9的截短结构中揭示的第二激活位点,所述截短结构可能模拟BAX的线粒体连接形式11-14。虽然BAX激活的早期步骤已确定,但仍缺乏使BAX在细胞溶质中保持在控制之下以及调控MX激活和移位至线粒体外膜的机制的理解。此外,在细胞溶质中和激活过程中BAX采用的构象对于理解MX介导性凋亡和MX可如何被药物靶向是关键的。因此,BAX和调控BAX激活的蛋白,包括其它BCL-2家族成员,是针对开发新颖疗法的集中研究和药物发现活动的革G标15,16。[0012]通过MX调节细胞死亡可在若干疾病中具有治疗益处。与过早或不需要的细胞死亡相关联并且特征为BAX的异常激活、或表达或功能的疾病包括:心血管疾病和病症例如,动脉硬化、心力衰竭、心脏移植、动脉瘤、慢性肺病、缺血性心脏病、高血压、血栓形成、心肌病),神经变性疾病和神经障碍例如,阿尔茨海默Alzheimer氏病、帕金森Parkinson氏病、亨廷顿Huntington氏病、色素性视网膜炎、脊髓性肌萎缩、各种形式的小脑变性、肌萎缩性侧索硬化症),免疫病症(例如,器官移植排斥反应、关节炎、狼疮、炎性肠病、克劳恩Crohn氏病、哮喘、多发性硬化症、糖尿病),缺血例如,中风、心肌梗塞和再灌注损伤),不育症例如,过早绝经、卵巢衰竭或卵泡闭锁),血液病症例如,范可尼Fanconi贫血、再生障碍性贫血、地中海贫血、先天性中性白细胞减少症、脊髓发育不良),肾缺氧,肝炎,哮喘和AIDS。然而,当前不存在通过直接调节BAX活性来阻止或激活细胞死亡的小分子疗法。存在凋亡途径的抑制剂,诸如在各种细胞中阻止细胞死亡的半胱天冬酶抑制剂。然而,半胱天冬酶抑制剂在细胞中可得到的不同半胱天冬酶间缺乏特异性,这是对于其成功临床应用的不利因素。BAX的直接激活剂可具体应用于癌症治疗中,并且可选择性地克服癌症细胞的抗凋亡抗性并使正常细胞免受伤害。同样地,可应用BAX的直接激活剂以在与免疫细胞不受控产生相关联的自身免疫疾病中促进凋亡。BAX抑制剂可具体应用于细胞死亡异常过度的心脏病、CNS障碍疾病以及肝和肾病。[0013]本发明解决对鉴别用于治疗性处理的BAX抑制剂和激活剂的需要。发明内容[0014]本发明公开了用于鉴别干扰或促进MX二聚化、和或结合至先前未鉴别出的BAX二聚体结合位点的试剂的测定方法。本发明还提供促进或干扰二聚化的试剂。[0015]提供了鉴别用作促进或抑制细胞死亡的候选试剂的试剂的方法,所述方法包括:a使试剂与BCL-2相关X蛋白(ΒΑΧ单体或其部分、和或与BAX二聚体接触,以及b测量试剂是否抑制或促进BAX二聚化;其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时BAX单体与其它BAX单体或与BAX单体的部分的结合减少表明试剂抑制BAX二聚化,其中抑制BAX二聚化的试剂是用于促进细胞死亡的候选试剂;并且其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时BAX单体或其部分与其它BAX单体或其部分的结合增加表明试剂促进MX二聚化,其中促进BAX二聚化的试剂是用于抑制细胞死亡的候选试剂。[0016]还提供了用于鉴别调节BAX活性的试剂的方法,所述方法包括:在试剂存在和缺少时,使BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点接触;以及测量BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点之间的结合,其中相比于试剂缺少时的结合,在试剂存在时减少的结合表明试剂是BAX活性的调节剂。[0017]提供了由以下组成的肽:[0018]aTffQTVTIFVAGVLTASLTIffKKMGSEQIDNO:11,[0019]bTffQTVTIFVAGVLTASLTSEQIDNO:12,[0020]cTffQTVTIFVAGVLTASEQIDNO:13,[0021]dTffQTVTIFVAGVLSEQIDNO:14,[0022]e包含序列TXQTXXIFXAGSEQIDNO:15的11-30个氨基酸残基,其中任何位置处的X可独立地为任何氨基酸、或天然或非天然化学修饰氨基酸,[0023]f包含序列TXQTXXIFXAGVXTASEQIDN0:16的15-30个氨基酸残基,其中任何位置处的X可独立地为任何氨基酸、或天然或非天然化学修饰氨基酸,或[0024]g包含序列Y1XY2Y3XXY4Y5XY6Y7SEQIDN0:17的11-30个氨基酸残基,其中Yl为苏氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸,Y2为谷氨酰胺或保守残基或非天然氨基酸,其中Y3为苏氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸,其中Y4为异亮氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸,其中Y5为苯丙氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸,其中Y6为丙氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸,其中Y7为甘氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸,其中任何位置处的X可独立地为任何氨基酸、或天然或非天然化学修饰氨基酸。[0025]提供了调节BAX和治疗与封闭或不需要的细胞死亡相关联并且特征为BAX的异常激活、表达或功能的疾病和病症的方法,所述方法包括使BAX与本文所公开的肽中的任何者接触。附图说明[0026]附图简要说明[0027]图1A-1D、BAX形成无活性二聚体构象。㈧通过Superdex200HR1030凝胶过滤柱分析的重组BAX的代表性尺寸排阻层析SEC迹线,显示出分别在约15.SmL和约14.2mL处的洗脱单体M和二聚体D峰。⑶通过Superdex200HR1030凝胶过滤分析重组BAXrec.BAX、WTMEF和DKOMEF的细胞溶质提取物、和来自用l%TritonX-100处理的来自WTMEF的细胞溶质提取物cyt.BAX+1%Triton。通过抗MX免疫印迹分析对应于指示分子量的成分和洗脱体积。(C通过Superdex75HR1030凝胶过滤层析分析不同剂量下纯化单体重组BAX的二聚化,显示出分别在约11.8mL和约10.4mL处的洗脱单体M和二聚体⑶峰。⑶以不具有和具有指示浓度下基于钉合肽的BAX激活因子BIMSAHBa2的SEC分离的BAX单体和二聚体的动力学格式绘制的脂质体释放测定。A-C中所示的数据代表三个实验并且D中的数据是来自四个独立实验的平均值。[0028]图2A-2B、无活性BAX二聚体的晶体结构。㈧BAX二聚体晶体结构的条带示意图。显示出对于每个BAX原聚体的二聚相互作用界面。在结构上描绘出螺旋⑷和环L。二级结构示意图草图显示出BCL-2同源结构域BH、跨膜区(TM和二聚相互作用界面的位置。⑶与㈧中示意图相关的视图绕垂直轴90度旋转的每个MX原聚体的条带示意图,显示出N末端和C末端二聚化界面。[0029]图3A-3E、BAX二聚机制的结构细节。(A二聚体中每个MX原聚体的C末端和N末端相互作用表面的计算真空静电学calculatedvacuumelectrostatics,显示出互补的疏水、极性和带电残基的位置。⑶BAX二聚体的草图示意图,显示出由其二聚体相互作用界面标记的原聚体。相互作用残基以棍示出并且在二聚体相互作用界面的三个不同区域中突出:(C二聚界面的疏水核心,涉及一个原聚体的α9残基1175和F176以及来自αΐ的残基M20和Α24,来自α6的Μ137和L141以及来自α1-α2环的L47和V50,(D不同MX原聚体的以下残基对之间的氢键:α6的R145与α9的Q171,al的Ε17与α3的Μ74和Ε75,以及αΐ的Κ21与α3的Ε75残基对之间的盐桥,以及E不同BAX原聚体的以下残基对之间的氢键:al-a2环的Α46与α8的Y164,al-a2环的Ε44与α5的W107,al-a2环的D48与α5的Ν106,以及al-a2环的D48与α4_α5环的R109残基对之间的盐桥。[0030]图4A-4D、BAX的自抑制二聚体调控MX激活和凋亡。(A纯化单体重组MXWT和突变体的二聚化由SEC分析并且通过对观测的单体和二聚体峰下方的面积进行积分来量化。⑶与BAXWT和突变体重组的未处理DKOMEF的蛋白裂解物进行细胞溶质与线粒体的分离,接着是使用Superdex200HR1030的SEC。(C用人BAXWT和突变体瞬时转导的DKOMEF的生存力测定通过膜联蛋白-V结合来测量。相比于MXWT,所有突变体P值〈0.05。(DBAXWT和BAXP168G细胞用IyMSTS处理6h;BAXE75K和S184L细胞因更快的细胞死亡而处理3h。分离细胞溶质和线粒体成分并通过SEC来分析。⑶和⑶中所示的数据代表三个独立实验,并且㈧和C中的数据是来自三个独立实验的平均值土SD。[0031]图5、相比于MX,确定与MX相互作用的抗凋亡BCL-2、BCL-Xl和MCL-I蛋白在细胞溶质中处于非常低水平并且主要存在于线粒体。MEF的细胞溶质和线粒体成分中BAX、BCL-2、BCL-Xl和MCL-I的蛋白水平通过免疫检测来测定。MEF的细胞溶质成分与线粒体成分的分离分别利用b-微管蛋白和VDAC抗体来证实。[0032]图6A-6B、如利用特异性识别BAX活性构象的6A7抗体的免疫沉淀测定法所测定的,二聚体构象的细胞溶质BAX是无活性的。(A使用Superdex20010300GL凝胶过滤柱的MEF细胞溶质提取物的尺寸排阻层析分析,表明二聚体尺寸的BAXWT的洗脱图谱⑶MXWT的成分6和8是6A7阴性的,并且不能与6A7抗体免疫共沉淀。作为阳性对照,用激活BAX并暴露BAX上6A7表位的1%辛基葡糖苷去污剂孵育成分。[0033]图7、使用交联方法检测BAX二聚化。在指示的MX浓度下用20XBMH交联剂处理15min之后,聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE中BAX的考马斯染色。[0034]图8、来自指不物种的BAX序列的蛋白质序列比对。BAX序列的蛋白质序列比对显不出呈浅灰色阴影的相同残基;呈白色阴影的保守残基、类似残基和不同残基。星号表示每个BAX原聚体中涉及BAX二聚体结构界面处相互作用的残基的位置。螺旋和环的二级结构标记基于MX二聚体的晶体结构。序列从顶部至底部:SEQIDNO:3人Homosapiens至SEQIDNO:10共有序列)。[0035]图9A-9C、突变体MXG67R二聚体的晶体结构指示与在BAXP168G二聚体的结构中所测定的相同的BAX二聚化机构。㈧BAXG67R二聚体浅灰色和BAXP168G二聚体更深的灰色的晶体结构的结构比对。(BBAXG67R原聚体浅灰色和BAXP168G原聚体更深的灰色)晶体结构以绕螺旋α5为中心的视图的结构比对。(CBAXG67R原聚体(浅灰色)和MXP168G原聚体更深的灰色)晶体结构以绕N末端触发位点为中心的视图的结构比对。[0036]图10A-10C、细胞溶质MX调控机制的结构见解。ABAX原聚体:α9复合体和MX单体:BIMΒΗ3复合体以条带表示的结构比对,显示出α9螺旋和WMΒΗ3螺旋向N末端触发位点的结合取向。α1_α2环在BAX原聚体:α9结构中处于封闭构象,并且在BAX单体:BIMΒΗ3结构中处于开放构象。ΒBAX单体:ΒΠ1ΒΗ3相互作用和CBAX原聚体:α9相互作用的草图示意图,以棍突出了关键相互作用残基。指示了色码。明确来说,在BMΒΗ3结合结构B中,包含αΐ的残基A24、L25、L27和α6的1^141、1139、6138、1137的84乂~末端触发位点的疏水表面形成与B頂ΒΗ3的保守疏水残基F159、I155、L152和Α149的持续疏水相互作用还参见图11Β。另外的稳定相互作用在MX的Q28和Q32与BIMBH3的N160之间发生,并且互补电荷相互作用在BAX的K21、R134和E131、BIMBH3的E158E、D157和R153残基之间发生(图IOB和图11B。在二聚体BAX结构C中,来自αΐ的残基A24、L25、Q28和Q32代替地与同一BAX分子的α1-α2环的残基Q52、V50和D48相互作用,产生形成自αΐ和α1-α2环定位的替代疏水空腔,这促进与相邻BAX分子的α9残基1175和F176的相互作用(还参见图11Α。封闭的α1-α2环构象还定位环的极性和带电残基以进行稳定的分子间相互作用C。这些结构见解提供了细胞溶质BAX形成自抑制二聚体的强力证据,所述自抑制二聚体堵塞BAX激活和线粒体移位所需的关键相互作用。[0037]图11Α-11Β、结合至α9取自BAXP168G二聚体结构)和WMBH3PDBID:2KW7肽的BAX的N末端结合位点的结构差异提供了细胞溶质BAX调控的结构见解。BAX的N末端表面以灰色显示,并且突出了BAX触发位点和α1-α2环的疏水(更浅的灰色)、带正电(K21、R134和R145和带负电D48和E131残基。㈧ΒΑΧα9与其疏水残基的结合使与α1、α6和α1-α2环的疏水残基接触,从而维持BAX的结构处于无活性构象以及α1-α2环处于封闭构象。(BBIMΒΗ3结合和其疏水残基使与αΐ和α6的疏水残基接触,随后发生α1-α2环构象变化为开放构象以及αΐ和α6残基取向变化。此外,在疏水位点的外围处,ΒΗ3具有与αΐ和α6的带电残基的有利静电相互作用。[0038]图12、非对称MX二聚体晶体结构的结构分析,揭示了两个新的MX相互作用表面形成自抑制二聚体构象。BAX单体的C末端螺旋α9与其溶剂不可及的表面-规范的ΒΗ3口袋右侦㈣螺旋结合,和与其溶剂可及的表面-另一个BAX分子的ΒΗ3触发位点(左侧α9螺旋*结合。[0039]图13、调控通过选择仅ΒΗ3的蛋白触发的BAX激活途径的无活性BAX二聚化的模型。无活性和细胞溶质BAX的二聚化提供了BAX激活的关闭途径。BAX的直接激活通过与仅ΒΗ3的蛋白直接相互作用和MX单体的触发位点(指示的螺旋αΐ和α6接合来引发。BAX的构象变化、线粒体移位和自激活继续进行并产生BAX单体以组装线粒体外膜内的活性二聚体,并且同寡聚孔释放诸如细胞色素c的关键致凋亡因子。[0040]图14Α-14Β、在通过高剂量激活因子SHAB激活之前,BAX的自抑制二聚形式解离成BAX单体。A通过高剂量的触发位点结合因子BIMSHAB,无活性ΒΑΧ4ΜΑ二聚体被竞争并解离成单体。在使用20yMDTT来减少内部交联的ΒΑΧ4ΜΑ突变体后,BIMSHAB可激活4ΜΑ单体以诱导BAX寡聚化。样品通过Superdex75HR1030凝胶过滤层析来分析并且通过对观测的单体峰下方面积进行积分来量化。所示数据代表三个独立实验B在用提高剂量的BMSAHBa处理后,纯化的BAXWT二聚体和BAXP168G二聚体的脂质体透化测定。相比于BAXWT,BAXP168G二聚体对通过WMSHAB的激活更有抗性。值得注意地,B頂SHABa激活MXWT二聚体所需的剂量比用来完全激活图1中BAXWT单体的剂量显著更高。条形图表明90min时的最大释放。数据是来自三重进行和重复三次的实验的平均值+SD。[0041]图15、α9螺旋肽的结构,具有与BAX的N末端结合位点相互作用的标记残基。具体实施方式[0042]发明详述[0043]提供了鉴别用作促进或抑制细胞死亡的候选试剂的试剂的方法,所述方法包括:[0044]a使试剂与BCL-2相关X蛋白(ΒΑΧ单体或其部分、和或与BAX二聚体接触,以及[0045]b测量试剂是否抑制或促进BAX二聚化;[0046]其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时MX单体与其它MX单体或与BAX单体的部分的结合减少表明试剂抑制BAX二聚化,其中抑制BAX二聚化的试剂是用于促进细胞死亡的候选试剂;以及[0047]其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时BAX单体或其部分与其它BAX单体或其部分的结合增加表明试剂促进BAX二聚化,其中促进BAX二聚化的试剂是用于抑制细胞死亡的候选试剂。[0048]试剂可结合至BAX的N末端结合位点和或C末端结合位点的氨基酸残基。例如,试剂可在结合位点残基S16、E17、Q18、I19、M20、K21、T22、G23、A24、L25、L26、I27、Q28、G29、F30、I31、Q32、D33、R34、A35、G36、R37、M38、G39、G40、E41、A42、P43、E44、L45、A46、L47、D48、P49、V50、P51、Q52、D53、A54、V129、P130、E131、L132、I133、R134、T135、I136、M137、G138、¥139、1'140、1^141、0142、?143、1^144、1?1454146和1?147中一处或多处结合至从乂的~末端。替代地,或另外,试剂可在结合位点残基N73、M74、E75、L76、D98、M99、F100、S101、D102、G103、N104、F105、N106、W107、G108、R109、I152、Q153、D154、Q155、G156、G157、W158、D159、G160、L161、L162、S163、Y164、F165、G166、T167、P168、T169、W170、Q171、T172、V173、T174、I175、F176、V177、A178、G179、V180、L181、T182、A183、S184、L185、T186、I187、W188、K189K190、M191和G192中一处或多处结合至BAX的C末端。[0049]在本文所公开方法中的任何者中,对作为二聚体或单体的BAX的测量是使用荧光偏振测定法、尺寸排阻层析SEC、聚丙烯酰胺凝胶电泳、动态光散射和特异性结合BAX二聚体或BAX单体的抗体中的一者或多者来进行的。[0050]还提供了用于鉴别调节BAX活性的试剂的方法,所述方法包括:[0051]在试剂存在和缺少时,使BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点接触;以及[0052]测量MX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点之间的结合,其中相比于试剂缺少时的结合,在试剂存在时减少的结合表明试剂是BAX活性的调节剂。[0053]在一个实施方案中,试剂是BAX的抑制剂。或者,试剂可为BAX的激活剂。[0054]BAX的α9肽具有氨基酸序列TWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMGSEQID勵:11。84乂的〇9螺旋肽例示于图15中。在不同的实施方案中,BAX的α9螺旋肽或BAX的N末端结合位点可固定在固体基质上。BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点之间的结合可例如使用荧光测定法或表面等离激元共振测定法或免疫共沉淀测定法或NMR测定法来测量。[0055]还公开了鉴别用作BCL-2相关X蛋白(BAX的调节剂的试剂的方法,所述方法包括:使试剂与BAX接触,并且测量试剂是否抑制或促进BAX与另一个BAX或其部分的二聚化,其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时结合减少表明试剂抑制BAX二聚化,并且相比于试剂缺少时,在试剂存在时BAX与另一个BAX分子的结合增加表明试剂促进BAX二聚化。[0056]在本文所公开方法中的任何者中,BAX可为人ΒΑΧ。[0057]试剂可为例如,小分子、分离肽、合成肽、具有天然或非天然氨基酸或组合的肽基试剂、经钉合肽hydrocarbonstapledpeptide、限制性肽(constrainedpeptide、大环macrocycle、类肽(peptoid、模拟肽(peptidomimetic、折叠体、适体、抗体、单抗体monobody、纳米抗体、或它们的组合。在实施方案中,试剂是BAX的α9螺旋的模拟肽。[0058]在本文所述方法的实施方案中,试剂是2000道尔顿或更小的小分子。在本文所述方法的实施方案中,试剂是1500道尔顿或更小的小分子。在本文所述方法的实施方案中,试剂是1000道尔顿或更小的小分子。在本文所述方法的实施方案中,试剂是800道尔顿或更小的小分子。在本文所述方法的实施方案中,试剂是2000、1500、1000、800、700、600、500或400道尔顿或更小的小分子。在本文所述方法的实施方案中,试剂是有机小分子。[0059]本文所公开的方法可进一步包括向受试者施用鉴别为促进MX二聚化或抑制BAX的试剂,所述受试者患有与过早或不需要的细胞死亡相关联并且特征为BAX的异常激活、表达或功能的疾病或病症;以及测试试剂在治疗疾病上的功效。所述方法可进一步包括向患有癌症的受试者施用鉴别为抑制BAX二聚化或激活BAX的试剂,以及测试试剂在治疗癌症上的功效。[0060]还提供了与BAX的N末端结合位点相互作用的以下肽:[0061]ι·Twqtvtifvagvltaslti1Wkkmgseqidno:11对应于βαχ的α9[0062]2.TffQTVTIFVAGVLTASLTSEQIDNO:12[0063]3.TffQTVTIFVAGVLTASEQIDNO:13[0064]4·TWQTVTIFVAGVLSEQIDNO:14。[0065]突出显示的氨基酸残基与BAX的N末端结合位点相互作用。不与BAX的N末端结合位点相互作用的其它残基可突变至任何残基,但肽序列可仍具有结合和抑制功能。因此,本发明提供具有11-30个氨基酸残基的肽,所述肽包含序列:TXQTXXIFXAGSEQIDN0:15,其中任何位置处的"X"可独立地为任何氨基酸或非天然氨基酸。在一个实施方案中,具有11-30个氨基酸残基、包含序列TXQTXXIFXAGSEQIDN0:15的肽不包括SEQIDN0:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14中的任何者。本发明还提供具有15-30个氨基酸残基的肽,所述肽包含序列:TXQTXXIFXAGVXTASEQIDN0:16,其中任何位置处的"X"可独立地为任何氨基酸或非天然氨基酸。在一个实施方案中,具有15-30个氨基酸残基、包含序列TXQTXXIFXAGVXTASEQIDN0:16的肽不包括SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13和SEQIDNO:14中的任何者。本发明还提供具有11-30个氨基酸残基的肽,所述肽包含序列Y1XY2Y3XXY4Y5XY6Y7SEQIDN0:17,其中Yl为苏氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸,Y2为谷氨酰胺或保守残基或非天然氨基酸,其中Y3为苏氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸,其中Y4为异亮氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸,其中Y5为苯丙氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸,其中Y6为丙氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸,其中Y7为甘氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸,其中任何位置处的X可独立地为天然或非天然化学修饰氨基酸的任何氨基酸。优选每个序列中至少一个X或一个Y为非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸。例如11-30个氨基酸,其意指11-30之间任何数量的氨基酸,SMl、12、13、14.......29或30个氨基酸残基。在一个实施方案中,肽由序列TXQTXXIFXAGSEQIDN0:15或序列TXQTXXIFXAGVXTASEQIDNO:16组成。在不同的实施方案中,相互作用残基还可突变至将维持与BAX相互作用的保守或类似残基。在不同的实施方案中,肽可用诸如荧光标记或放射性标记的标记来标记。在一个实施方案中,本文要求保护的肽为化学合成肽或由重组DNA或cDNA产生的肽。例如,肽可通过液相合成或通过固相合成来制得。肽可例如使用重组DNA或cDNA来合成。在一个实施方案中,肽并不直接得自较大的天然存在BAX蛋白,例如通过消化蛋白质。在一个实施方案中,肽是分离和纯化的肽。[0066]提供了抑制BAX的方法,所述方法包括使BAX与本文所公开肽中的任何者接触。BAX可处于活细胞中,其中优选地,BAX的抑制抑制细胞死亡。MX可处于受试者中,诸如哺乳动物、诸如人,并且将试剂施用于受试者。受试者可患有与过早或不需要的细胞死亡相关联并且特征为BAX的异常激活、表达或功能的疾病或病症。[0067]与过早或不需要的细胞死亡相关联并且特征为MX的异常激活、表达或功能的疾病和病症包括:例如,心血管疾病和病症例如,动脉硬化、心力衰竭、心脏移植、动脉瘤、慢性肺病、缺血性心脏病、高血压、血栓形成、心肌病),神经变性和神经疾病和障碍例如,阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、色素性视网膜炎、脊髓性肌萎缩、各种形式的小脑变性、肌萎缩性侧索硬化症),肝疾病和病症,肾疾病和病症,免疫病症例如,器官移植排斥反应、关节炎、狼疮、IBD、克劳恩氏病、哮喘、多发性硬化症、糖尿病),缺血例如,中风、心肌梗塞和再灌注损伤),不育症例如,过早绝经、卵巢衰竭或卵泡闭锁),血液病症例如,范可尼贫血、再生障碍性贫血、地中海贫血、先天性中性白细胞减少症、脊髓发育不良),肾缺氧,肝炎,哮喘和AIDS。与细胞死亡的抑制相关联并且特征为MX的异常抑制、表达或功能的疾病包括例如,癌症和自身免疫疾病。[0068]还提供了鉴别用作抑制细胞死亡的候选试剂的试剂的方法,所述方法包括:[0069]在试剂存在和缺少时,使BCL-2相关X蛋白(ΒΑΧ与本文所公开肽的任何者中的一者或多者接触,以及[0070]测量一种或多种肽与BAX的结合,[0071]其中相比于试剂缺少时一种或多种肽与BAX的结合,在试剂存在时一种或多种肽与BAX减少的结合表明试剂是用于抑制细胞死亡的候选试剂。在一个实施方案中,例如用异硫氰酸荧光素FITC来荧光标记肽。[0072]如本文所使用,"ΒΑΧ"是BCL-2相关X蛋白。在实施方案中,BAX是哺乳动物型。在优选实施方案中,BAX是人BAX。在实施方案中,BAX包含具有以下序列的连续氨基酸残基:[0073]MDGSGEQPRGGGPTSSEQIMKTGALLLQGFIQDRAGRMGGEAPELALDPVPQDASTKKLSECLKRIGDELDSNMELQRMIAAVDTDSPREVFFRVAADMFSDGNFNWGRVVALFYFASKLVLKALCTKVPELIRTIMGWTLDFLRERLLGWIQDQGGWDGLLSYFGTPTWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMGSEQIDΝ0:1〇[0074]在本文所述方法的实施方案中,方法可用于鉴别治疗性细胞死亡抑制剂。在本文所述方法的实施方案中,方法可用于鉴别治疗性细胞死亡激活剂。[0075]除非本文中有另外指示或在上下文中另外明显地发生矛盾,否则本文所述各种要素的所有组合都在本发明的范围内。[0076]本发明将从下文的实验细节来更好地理解。然而,本领域技术人员将容易理解,所论述的特定方法和结果仅例示本发明,本发明如其后所接的权利要求书中更充分描述。[0077]实验细节[0078]材料和方法[0079]试剂一对应于BIM的BH3结构域的烃钉合肽、BIMSAHBa2=N-乙酰化145EIWIAQELRS5IGDS5FNAYYA164-C0NH2SEQIDN0:2,其中S5代表插入的用于烯烃复分解的非天然氨基酸,如先前由CPCScientific描述的进行合成、纯化和鉴定(11。[0080]重组BAX的产生一人MX野生型和突变体在pTYBl载体NewEnglandBiolabs中使用标准的基于PCR的克隆策略和基于PCR的定点诱变来产生,并且通过测序来证实构建物。重组蛋白以BL21DE3密码子+大肠杆菌菌株来表达并且如先前描述的纯化16。[0081]尺寸排阻层析一Superdex7510300GL和20010300GUGEHealthcare柱用于重组蛋白和细胞提取物的尺寸排阻层析。将重组蛋白注入用含有20mMHETOSpH7.2、150mMKCUlmMDTT的缓冲液平衡的柱中。将Img细胞溶质或膜提取物施加于在含有IOmMTris、pH7.5、lmMEGTA、200mM蔗糖和完全蛋白酶抑制剂的缓冲液中平衡的Superdex20010300GL。收集500yL成分,并且每个成分中的30μ1通过SDS-PAGE和免疫印迹来分析。所有操作在4°C下进行。还使凝胶过滤分子量标记物GEHealthcare经过柱以获得用于估计蛋白质分子量的标准曲线。[0082]动态光散射一各种样品的动态光散射使用来自WyattTechnology的DynaPr〇801仪器和用于数据收集和分析的DYNAMICSV.5.25.44软件来测量。在从尺寸排阻层析洗脱之后,将蛋白质样品以13,OOOrpm离心10min并装至塑料比色皿。通常,对每个100μΙ样品获得五秒的一百个扫描。归一化的强度对流体动力半径nm在20mMHEPESpH7.2、150mMKC1、ImMDTT缓冲液中测量。[0083]结晶一在20mMHEPESpH7.2、150mMKClUmMDTT缓冲液中的均质BAX蛋白使用过滤单元Milipore来浓缩至10mgml。针对BAX野生型和突变体的结晶条件的初始筛选通过在293K下使用96孔Intelli板HamptonResearch的坐滴式蒸气扩散方法(sitting-dropvapor-diffusion来进行。BAX蛋白在20mMHEPESpH7.2、150mMKCUlmMDTT中浓缩至10mgml,并且在结晶建立setup之前离心。衍射质量杆状晶体在0.1MBis-TrispH6.5、1.5M硫酸铵中使用24孔VDX板HamptonResearch经由悬滴式蒸气扩散方法来产生。将ΙμL蛋白质溶液和储备溶液混合并且对Iml储备溶液平衡。晶体通过在含有0.184-TrispH6.5、1.5Μ硫酸铵和25%vv甘油的20μ1防冷冻剂溶液中浸泡5s来防冷冻,并且在液氮中快速冷冻。[0084]数据收集和结构测定一X射线衍射数据收集于国家同步加速器光源(NationalSynchrotronLightSource和先进光子源AdvancedPhotonSource中的光束线。所有数据利用HKL2000来整合和缩放(19,并且利用CCP4软件套件来进行进一步处理20AAX的晶体结构通过将MX的单体匪R结构(PDBID:IF16用作搜索模型的分子置换方法来测定。模型突变至多Ala。使用C00T的多周期模型手动编辑和调整21,接着为通过模拟的退火、能量最小化来细化,和利用REFMAC的个别各向同性B因子细化22。螺旋a1与α2之间环的断链因建模阶段的较差衍射数据而实现。利用PR0CHECK23、PISA24来验证最终模型,并且使用PYMOL来给出分子模型25。数据收集和统计概述于表2中。[0085]NMR样品和谱一蛋白质样品于5%D20中、pH6.0的25mM磷酸钠、50mMNaCl溶液中制备。针对BAXP168G单体的骨架1H、13C、15N分配的相关性1H-15NHSQCJh-15NTROSY谱和三线共振谱:HNCO、HNCA、HNCOCA、HNCACB、HN⑶CACB和Ni5NNH-NOESY在25°C下于配备有低温探针的Inova600MHz匪R谱仪上获得,使用Topsin处理,并且利用CCPNMR来分析26AAX野生型交叉峰分配如先前报道的来应用(11,16。在指示的摩尔比率下的加权平均化学位移差异A计算为以p.p.m计的VASHi^ASN15A2。误差条的缺少表明无化学位移差异,或者存在脯氨酸或者重叠和未用于分析中的残基。根据标准方法,基于在所有残基间的平均化学位移加标准差来计算骨架酰胺化学位移变化的显著性阈。[0086]BAX二聚化测定一BAX野生型和突变体在BAX缓冲液(IOmMHEPESpH7、150mMKCUlmMDTT中浓缩至约0.5mM并且在20°C下孵育1-3天,之后稀释至250μ1的总体积并且装填至Superdex75HR1030尺寸排阻柱GEHealthcare上。这些条件允许与因BAX激活所致的聚集相比受控的二聚化过程。在4°C下使用0.5mlmin的流速实现单体和二聚BAX的分离。层析谱迹线显示出分别在约11.8ml和约10.4ml处的单体峰和二聚峰。使用蛋白质标准品GEHealthcare来校准凝胶过滤峰的分子质量。层析谱迹线代表数个新近SEC纯化的单体BAX的独立制备物。[0087]BAX交联一使用通过在冰上用20XBMH孵育指示剂量的BAX15min接着用ImMDTT淬灭的交联方法来检测二聚化。样品在90度下变性并且利用SDS-PAGE来分析。[0088]脂质体透化测定一脂质体由以下摩尔百分率的脂质(AvantiPolarLipids组成:磷脂酰胆碱48%;磷脂酰乙醇胺28%;磷脂酰肌醇10%;二油酰基磷脂酰丝氨酸10%;和四油酰基心磷脂4%,并且在挤压时用ANTSDPXMolecularProbe装载。ΒΑΧ400nM与指示浓度的BMSAHBa2以96孔格式Corning组合,并随后在测定缓冲液(IOmMHEPES、pH7、200mMKCl、5mMMgCl2和0.2mMEDTA中添加脂质体来自50mM总脂质原液的10μ1至100μΙ的最终体积。在从脂质体释放至上清液中时,基于当ANTS荧光团与DPX猝灭剂分离时发生的荧光强度升高来量化ANTSDPX释放。在30°C下使用TecanInfiniteΜ1000读板机随时间测量荧光λ臟=355腦和4谢=520腦)AOmin时ANTSDPX的释放百分率计算为释放百分率=F-FoAFiqq-FoX100,其中Fo和F·分别为基线荧光和最大荧光。使用l%Triton处理来测定每次测定的脂质体释放最大量,并且此值设定为100%值。[0089]细胞培养、细胞转染和凋亡测定一野生型MEF和SV40转化的Bax--Bak--DKOMEF维持在补充有1〇%1^3、1001]1111_1青霉素链霉素、211^1-谷氨酰胺、0.111^1^1非必需氨基酸和50μΜβ-疏基乙醇的DMEM高葡萄糖(Invitrogen中。通过BAX-IRES-GFP或BAXP168G-IRES-GFP质粒的逆转录病毒转导来实现将BAX和BAX突变体重建入DKO细胞中,接着对GFP阳性细胞进行MoFlo分拣。逆转录病毒的产生如先前描述的进行(17AAXWT和突变体蛋白的可比较的表达通过Western印迹分析证实。对于十字孢碱处理而言,MEF每个孔5X104在含血清培养基中接种于六孔透明底板16-18小时,并随后用ΙμΜ十字孢碱处理。对于BAX或BAX突变体的瞬时逆转录病毒转导而言,用表达BAX或BAX突变体的逆转录病毒侵染DKOMEF30-36小时。细胞死亡通过膜联蛋白-VBioVision染色来量化。流式细胞术使用LSRFortessaBDBiosciences来进行,并且使用FACSDivaBDBiosciences来分析数据。BAX或BAX突变体的表达量通过抗BAXWestern印迹来评估。统计分析的P值使用学生Studentt检验来获得。[0090]亚细胞分级一MEF维持在补充有10%FBS、IOOUmr1青霉素链霉素、2mM1-谷氨酰胺、0·ImMMEM非必需氨基酸和50μΜβ-疏基乙醇的DMEMInvitrogen中。MEF每个孔20X1〇6接种于150mm皿12小时。为了分离细胞溶质和线粒体成分,通过Dounce匀浆器在含有IOmMTris、pH7.5、ImMEGTA、200mM鹿糖和完全蛋白酶抑制剂(CompleteProteaseInhibitors的裂解缓冲液LB中裂解细胞。细胞裂解物以700Xg离心10min来去除未裂解的细胞和细胞核。上清液在4°C下以12000Xg离心10min,并且所得沉淀物收集为线粒体成分。膜沉淀物被再悬浮于LB+1%CHAPS中。[0091]Western印迹一20yg全细胞蛋白在4_12%NuPageInvitrogen凝胶上电泳分离,转移至Immobilon-FLPVDF膜Millipore并进行免疫印迹。对于利用Odyssey红外成像系统LI-CORBiosciences的蛋白质可视化而言,膜在含有2.5%乳粉的PBS中封闭。一级BAX抗体CelISignaling2772S在4°C下以1:1,000稀释孵育过夜。在漂洗之后,用1:5,000稀释的缀合IRdye800的山羊抗家兔IgG二级抗体LI-CORBiosciences孵育膜。利用Odyssey红外成像系统检测蛋白。[0092]BAX构象变化测定一细胞溶质成分经受免疫沉淀,接着是针对总BAX的免疫印迹。简单地说,100-300yg总蛋白被收集并用预平衡的蛋白质GSepharose微珠(SantaCruzBiotechnology公司)孵育1小时。然后,预清洗的样品在4°C下用6A7抗体(6μgml1:1,000,sc_23959,SantaCruzBiotechnology孵育四小时,接着添加预平衡的蛋白质GSepharose微珠1小时。微珠被沉淀、在4°C下用裂解缓冲液漂洗3次,并且通过在90°C下在LDSDTT上样缓冲液中加热微珠10分钟来洗脱蛋白质。免疫沉淀物经受电泳和使用抗BAX抗体(1:1,000CellSignaling2772S的Western印迹分析。[0093]结果[0094]本发明利用了以下发现:细胞溶质BAX形成二聚自抑制形式,所述二聚自抑制形式通过一个原聚体的N末端触发位点和包括第二个原聚体的α9的新相互作用C末端表面来介导。这些BAX的相互作用蛋白表面提供了理解BAX抑制的结构基础和设计用于药理调节BAX的药物的重要见解。发现了单体野生型MXBAXWT在缺少ΒΗ3激活结构域时,如通过尺寸排阻层析SEC和聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测量的,随着时间推移可逆地形成二聚体。诸如BAX的α8_α9环中P168G的单点突变控制螺旋α9活动化,产生SEC的相同二聚峰。BAXP168G形成在室温下存留数天的更稳定二聚体。[0095]研究了来自小鼠胚胎成纤维细胞MEF的重组BAX和细胞溶质BAX的构象。使用几丁质亲和层析接着是尺寸排阻层析SEC,从大肠杆菌提取物中纯化了重组全长BAX17。重组BAX从SEC洗脱,主要在对应于单体形式的峰(11,17并且另外在对应于二聚形式的第二相异峰(图1Α,1Β。培养的MEF在缓冲液中不利用去污剂来裂解,并且接着细胞溶质和线粒体成分利用SEC的分级来分离。令人惊奇地,使用相同的针对重组BAX的SEC条件,在对应于BAX二聚体的成分中洗脱出内源性BAX图1Β。接下来,用BAXV1PBAKV_双缺失DK0MEF和在内源性水平上稳定表达人MX的MEF重复SEC,并且再次地,细胞溶质MX显现为二聚体图1B。为了排除细胞溶质MX是与细胞溶质中抗凋亡BCL-2蛋白的异二聚体的可能性,细胞溶质和线粒体成分经受了Western印迹分析,证实细胞溶质中抗凋亡蛋白相比于BAX而言水平非常低并且主要存在于线粒体图5。此外,如通过使用仅识别活性BAX构象的6A7抗体的免疫沉淀分析证明的,细胞溶质BAX二聚体呈无活性构象(图618。然而,当用促进BAX激活的去污剂处理细胞溶质MX时,BAX以高分子量显著呈现,据推测形成BAX寡聚体。另外,较少部分洗脱为MX单体,表明BAX激活需要MX二聚体构象的破坏(图1Β。合起来看,这些结果证实细胞溶质BAX主要采用二聚和无活性构象。[0096]为了阐明细胞溶质BAX二聚体构象的生理作用,研究了BAX二聚化的分子基础。首先,通过如SEC所显示的高浓度MX单体孵育或用BMH交联剂处理接着是聚丙烯酰胺凝胶电泳(图1C,7,建立了用来可再现地产生足够量BAX二聚体的方法。SEC的单体和二聚峰通过分别对应于BAX单体约21KD和二聚体约42KD的均相群体的动态光散射来证实表1。在脂质体测定中,尽管MX单体不能够单独透化膜,但它在通过烃钉合的BIMBH3螺旋、BIMSAHBa2激活时激活和诱导膜透化(图1D11,12。相比之下,单独的SEC分离的BAX二聚体在脂质体透化测定中不显示诱导膜透化的能力,并且在添加SAHBa2时它几乎无活性(图1D。因此,BAX二聚体构象无活性并且相比于单体BAX而言对激活有抗性,表明BAX二聚体可形成自抑制构象。[0097]进行了X射线结晶学研究以获得对无活性BAX二聚体的更深见解。利用野生型BAX和突变体来监测SEC二聚体峰的稳定性以预测成功的结晶。用于衍射的晶体质量在与野生型BAX相比产生更稳定二聚体的突变体情况下更好。不改变MX结构但降低α8_α9环动力学的BAXP168G突变体成功产生晶体,并且获得了1.9A分辨率的天然X射线数据集。通过将全长BAX的NMR结构用作搜索模型的分子置换方法,解析和细化了晶体结构表2。非对称单元含有具有极佳电子密度图的两个BAX分子,其中除了N末端非结构化区的残基残基1-13和螺旋αΐ和α2之间非结构化环的四个残基残基37-40外,所有BAX残基可追踪(图2。二聚化界面由保守残基形成,并且是大范围的,掩埋了几乎1900A2表面面积(图2Α和8。值得注意地,BAX二聚体结构揭示了包括对BAX激活关键的两个结构表面的相互作用的二聚化界面;来自一个BAX原聚体的N末端触发位点和来自包括C末端α9螺旋的第二个BAX原聚体的新C末端表面(图2Β,14。应注意的,此二聚体结构和二聚化界面无关于MXP168G突变体,因为对螺旋1引入新氢键的ΒΗ3残基突变体G67R产生了如通过X射线晶体学测定的3JA分辨率的相同非对称二聚体构象图9,表2。[0098]在非对称MX二聚体结构内的MX原聚体与通过溶液NMR测定的无活性单体MX结构相似,然而,它们在螺旋取向和环构象上具有显而易见的差异(骨架r.m.s.d.2.1117。最明显的差异对应于位于包括螺旋α1、α6、α2和α1_α2环的N末端触发位点表面的残基。此外,与结合至ΒΗ3螺旋的全长BAX结构(骨架r.m.s.d.3.0A11的比较表明,在非对称二聚体中,α1_α2环呈封闭构象,与螺旋αΐ和α6形成特异性分子内接触,而结合BIMΒΗ3的BAX结构具有呈开放和活性构象的α1-α2环(11,12。因此,结构分析表明非对称二聚体结构含有呈相异但无活性构象的两个BAX分子,与细胞溶质无活性BAX二聚体的证据一致图1。[0099]非对称BAX二聚体构象突出了BAX的两个新相互作用表面(图3。一个BAX原聚体的相互作用表面主要包括先前鉴别的结合SAHBa2的BAX触发位点残基与其外围处的若干额外相互作用(11。此外,C末端表面处的相互作用位点是包括C末端螺旋α9的新的和未预见的BAX结合表面。C末端结合表面具有来自溶剂暴露的α9疏水残基的疏水中心,所述疏水残基由€[8、€17、€[3、€[4-€[5环和€[8-€[9环的极性和带电荷残基环绕(图34^末端结合表面具有来自溶剂暴露的由带电荷残基环绕的α1、α6和α1-α2环的疏水残基形成的疏水中心,其补充C末端结合表面的带电荷残基(图3Α。二聚化界面的核心是疏水的(图3B,C。数个残基形成补充螺旋α9与N末端BH3结合位点的结合的疏水相互作用网络(图3C。然而,若干氢键和盐桥促成二聚体形成和稳定性(图3B,D,E。因此,疏水的、极性相互作用和盐桥涉及大范围和高度互补的二聚化界面。[0100]在BH3结合至N末端触发位点时,α1-α2环置换成开放构象,该构象变化对暴露6A7表位残基12-24和BAX激活是必要的(I1,12,17,18图10Α。相比之下,在二聚体BAX结构中,α9以保持α1-α2环构象呈封闭和无活性构象的取向结合N末端ΒΗ3结合位点(图10Α。具体来说,ΒΗ3结合是通过αΐ和α6的暴露疏水残基与ΒΗ3的保守疏水残基介导的(图ΙΟΒ,ΙΙΑ。然而,在二聚体BAX结构中,许多这些αΐ残基被掩埋并且替代地与同一BAX原聚体的α1-α2环的残基相互作用。这产生了形成自αΐ和α1_α2环定位的替代疏水空腔,其促进与α9的疏水残基的相互作用(图10C。此封闭α1-α2环构象还定位环的极性和带电荷残基,以产生稳定化的分子间氢键(图10C,11B。因此,α1α6位点和α1_α2环内的这些新相互作用稳定了无活性MX构象,封闭进入BAX触发位点以及将螺旋α9维持在其自身疏水口袋内的位置图12。这些结构见解提供了细胞溶质BAX形成自抑制二聚体的强力证据,所述自抑制二聚体堵塞BAX激活和线粒体移位所需的关键相互作用。[0101]为了确认晶体结构中的二聚化界面和溶液中观测的BAX二聚体不是先前针对截短ΒΑΧΔC21报道的域交换二聚体(13,使用了称作4ΜΑ的内部交联突变体(C62S,C126S,V121C,I136C,4MA对激活有抗性并且不能形成如先前报道的域交换二聚体13。正如预期的,ΒΑΧ4MA保留形成BAX二聚体的能力,因为这些突变保持如MXWT结构中的无活性构象图4A。与二聚体晶体结构一致,在二聚化界面处形成关键相互作用的残基中的突变E75K和T172K或S184L使α9与BH3沟的相互作用不稳定,干扰二聚体形成(图4A。接下来,测试N末端触发位点结合因子BIMSHABa是否可竞争并解离二聚体。分离的ΒΑΧ4ΜΑ二聚体用或不用增加量的BIMSHABa孵育。结果显示高剂量的BIMSHABa可竞争并解离二聚体成单体(图14Α。此外,在存在减少内部交联ΒΑΧ4ΜΑ突变体的还原剂DTT时,B頂SHABa还可激活BAX4ΜΑ单体以诱导BAX寡聚化。这些生化数据进一步验证了自抑制二聚BAX作为通过仅ΒΗ3蛋白抑制激活的机制。[0102]为了研究MX二聚化机制的生理作用,着手做了MXWT和突变体形成自抑制二聚体和调控BAX激活的能力的研究。DKOMEF在生理表达水平上与BAXWT和突变体重组。P168G突变体形成比BAXWT更稳定的自抑制二聚体(图4Α,图14Β,而Ε75Κ和S184L突变体干扰BAX二聚化(图4Α。与此一致,BAXWT和BAXP168G蛋白二者在细胞溶质中仅形成二聚体;然而,ΒΑΧΕ75Κ和BAXS184L在细胞溶质中形成单体(图4Β。醒目地,BAX突变体与单体BAX的组成型表达显示出相比于MXWT在细胞死亡诱导上显著升高的活性(图4C。相比之下,具有更稳定细胞溶质二聚体的BAXP168G突变体细胞具有相比于MXWT受损的活性(图4C。此外,在十字孢碱处理时,相比于BAXWT,BAXP168G二聚体对在线粒体外膜中经受移位和寡聚化更有抗性(图4D。然而,在十字孢碱处理时,单体MXE75K和S184L比对应BAXWT二聚体经受更快的激活和在线粒体外膜处变换至寡聚体图4D。合起来看,数据表明细胞溶质BAX可使其构象从自抑制二聚体转换至单体,以及单体BAX有利于更快BAX激活和更强效细胞死亡活性,而二聚BAX妨碍BAX激活和最终细胞死亡活性。[0103]在凋亡起始期间,细胞溶质MX通过激活因子仅BH3蛋白与N末端触发位点的相互作用激活,接着是N末端构象变化和α9从其C末端疏水沟的位移,以便移位至线粒体。此外,在由激活因子仅ΒΗ3蛋白(BH3-〇nlyprotein进一步激活时,具有从其疏水沟移位的α9的线粒体连接的BAX经受N末端构象变化13。不论BAX激活的步骤,N末端和C末端表面处的构象变化是导致膜透化的完全BAX激活所需的。本文的工作表明细胞溶质BAX形成自抑制二聚体构象来阻止每个原聚体中N末端或C末端的构象变化并且维持MX激活在控制之下(图13。细胞中凋亡的诱导应需要保证促凋亡信号例如仅ΒΗ3蛋白)超过其表达水平或活性状态的随机波动;因此,BAX自抑制提供了封闭BAX激活和阻止不需要的凋亡的机制。最终,这些结构和功能见解对于药物调节剂的开发具有重要暗示,所述调节剂约束engageN末端位点或C末端位点来调节特征为过度细胞死亡或存活的疾病中的凋亡2,3。[0104]表1.来自尺寸排阻层析洗脱峰的BAX单体和二聚体的代表性动态光散射数据。[0105][0106][0107]表2.数据收集和细化的结构统计。[0108][0109][0110]括号中的数值是针对最高分辨率壳层的。1-〈12〈1,其中1是对给定折射的强度测量并且〈1是对此折射的多个测量的平均强度。[0111]参考文献[0112]l.N.N.Danial1S.J.Korsmeyer,Cell116,2052004.[0113]2.R.ff.Johnstone,Α.Α.Ruefli,S.ff.Lowe,Cell108,1532002.[0114]3.D.E.Bredesen,R.V.Rao,P.Mehlen,Nature443,7962006.[0115]4.R.J.Youle,A.Strasser,Nat.Rev.Mol.Ce11.Biol.9,47-592008.[0116]5.J.E.Chipuk,等人,Mol.Cell.37,299-310,(2010·[0117]6.K.G.Wolter,等人,J.CellBiol.139,1281-12921997·[0118]7.1.S.Goping,等人,J.CellBiol.143,207-2151998·[0119]8.A.Nechushtan,C.L.Smith,Y.T.Hsu,R.J.Youle1EMBOJ.182330-23411999.[0120]9.M.C.Wei等人,Science292,7272001·[0121]10.S.ff.Tait,D.R.Green,ColdSpringHarb.Perspect.Biol.5,2013.[0122]11.E.Gavathiotis等人,Nature455,10762008·[0123]12.E.Gavathiotis等人,Mol.Cell40,4812010·[0124]13.P.E.Czabotar,等人,Cell152,519-5312013·[0125]14.G.Lessene,P.E.Czabotar,P.M.Colman,Nat.Rev.DrugDisc.7,9892008.[0126]15.E.Gavathiotis等人,Nat.Chem.Bio.8,6392012·[0127]16.M.Suzuki,R.J.Youle1N.Tjandra1Cell103,6452000.[0128]17.H.Kimetal.,Mol.Cell36,4872009.[0129]18.Y.T.Hsu,R.J.Youle,J.Biol.Chem.272,138291997.[0130]19.Z.Otwinowski,ff.Minor,MethodsEnzymol.276,307-3261997.[0131]20.CollaborativeComputationalProject,ActaCrystalIogrDBiolCrystallogr50,760-3,1994.[0132]21.P.Emsley,K.Cowtan,ActaCrystallogrDBiolCrystallogr60,2126-2132,2004.[0133]22.M.D.Winn,G.Ν.Murshudov,Μ.Z.Papiz,MethodsEnzymol.374,300-321,2003.[0134]23.Laskowski,R.A.,等人,JournalofBiomolecularNMR8,477-4861996·[0135]24.E.Krissinel1K.Henrick,J.Mol.Biol.372,774-797.2007.[0136]25.ff.L.DeLano,DeLanoScientific1SanCarlos,CA,USA2002.[0137]26.Vranken,W.F·,等人,Proteins59,687-696,(2005·

权利要求:1.一种鉴别用作促进或抑制细胞死亡的候选试剂的试剂的方法,所述方法包括:a使试剂与BCL-2相关X蛋白(ΒΑΧ单体或其部分、和或与BAX二聚体接触,以及b测量试剂是否抑制或促进BAX的二聚化;其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时MX单体与其它MX单体或与MX单体的部分的结合减少表明试剂抑制BAX的二聚化,其中抑制BAX的二聚化的试剂是用于促进细胞死亡的候选试剂;以及其中相比于试剂缺少时,在试剂存在时BAX单体或其部分与其它BAX单体或其部分的结合增加表明试剂促进BAX的二聚化,其中促进BAX的二聚化的试剂是用于抑制细胞死亡的候选试剂。2.如权利要求1所述的方法,其中所述试剂结合至MX的N末端结合位点和或C末端结合位点的氨基酸残基。3.如权利要求1所述的方法,其中试剂在结合位点残基S16、E17、Q18、I19、M20、K21、T22、G23、A24、L25、L26、I27、Q28、G29、F30、I31、Q32、D33、R34、A35、G36、R37、M38、G39、G40、E41、A42、P43、E44、L45、A46、L47、D48、P49、V50、P51、Q52、D53、A54、V129、P130、E131、L132、1133、1?134、1'135、1136、]\1137、6138、¥139、1'140、1^141、0142小143、1^144、1?145』146和1?147中一处或多处结合至BAX的N末端。4.如权利要求1所述的方法,其中试剂在结合位点残基N73、M74、E75、L76、D98、M99、F100、S101、D102、G103、N104、F105、N106、W107、G108、R109、I152、Q153、D154、Q155、G156、G157、W158、D159、G160、L161、L162、S163、Y164、F165、G166、T167、P168、T169、W170、Q171、T172、V173、T174、I175、F176、V177、A178、G179、V180、L181、T182、A183、S184、L185、T186、1187、1188、11891190、]\1191和6192中一处或多处结合至84乂的:末端。5.如权利要求1-4中任何项所述的方法,其中对二聚体或单体形式的BAX的测量是使用荧光偏振测定法、尺寸排阻层析SEC、聚丙烯酰胺凝胶电泳、动态光散射和特异性结合BAX二聚体或BAX单体的抗体中的一者或多者来进行的。6.-种用于鉴别调节BAX的活性的试剂的方法,所述方法包括:在试剂存在和缺少时,使BAX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点接触;以及测量MX的α9螺旋肽与BAX的N末端结合位点之间的结合,其中相比于试剂缺少时的结合,在试剂存在时减少的结合表明试剂是BAX活性的调节剂。7.如权利要求6所述的方法,其中试剂是BAX的抑制剂。8.如权利要求6或7所述的方法,其中BAX的α9肽具有氨基酸序列TWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMGSEQIDΝ0:11。9.如权利要求6-8中任何项所述的方法,其中BAX的α9螺旋肽或BAX的N末端结合位点固定在固体基质上。10.如权利要求6-9中任何项所述的方法,其中MX的α9螺旋肽与MX的N末端结合位点之间的结合使用荧光测定法来测量。11.如权利要求1-10中任何项所述的方法,其中BAX是人ΒΑΧ。12.如权利要求1-11中任何项所述的方法,其中试剂是小分子、分离肽、合成肽、具有天然或非天然氨基酸或组合的肽基试剂、烃钉合肽、限制性肽、大环、类肽、模拟肽、折叠体、适体、抗体、单抗体、纳米抗体或它们的组合。13.如权利要求1-12中任何项所述的方法,进一步包括向受试者施用鉴别为促进BAX的二聚化或抑制BAX的试剂,所述受试者患有与过早或不需要的细胞死亡相关联并且特征为BAX的异常激活、表达或功能的疾病或病症;以及测试所述试剂在治疗所述疾病上的功效。14.如权利要求1-12中任何项所述的方法,进一步包括向患有癌症的受试者施用鉴别为抑制BAX的二聚化或激活BAX的试剂,以及测试所述试剂在治疗癌症上的功效。15.-种由以下组成的肽:aTffQTVTIFVAGVLTASLTIffKKMGSEQIDNO:11,bTffQTVTIFVAGVLTASLTSEQIDNO:12,cTffQTVTIFVAGVLTASEQIDNO:13,dTffQTVTIFVAGVLSEQIDNO:14,e包含序列TXQTXXIFXAGSEQIDN0:15的ll-30个氨基酸残基,其中任何位置处的X可独立地为任何氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸,f包含序列TXQTXXIFXAGVXTASEQIDN0:16的15-30个氨基酸残基,其中任何位置处的X可独立地为任何氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸,或g包含序列YlXY2Y3XXY4Y5XY6Y7SEQIDN0:17的ll-30个氨基酸残基,其中Yl为苏氨酸或保守氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸,Y2为谷氨酰胺或保守残基或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸,其中Y3为苏氨酸或保守氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸,其中Y4为异亮氨酸或保守氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸,其中Y5为苯丙氨酸或保守氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸,其中Y6为丙氨酸或保守氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸,其中Y7为甘氨酸或保守氨基酸或非天然氨基酸或非天然存在的化学修饰氨基酸,其中任何位置处的X可独立地为任何氨基酸或天然或非天然存在的化学修饰氨基酸。16.如权利要求15所述的肽,其由序列TXQTXXIFXAGSEQIDN0:15或序列TXQTXXIFXAGVXTASEQIDN0:16组成。17.-种化学合成肽,其由权利要求15或16所述肽中的任何者组成。18.-种通过重组DNA或cDNA产生的肽,所述肽由权利要求15或16所述肽中的任何者组成。19.一种分离和纯化的肽,其由权利要求15或16所述肽中的任何者组成。20.-种抑制MX的方法,所述方法包括使MX与权利要求15-19中任何项所述的肽接触。21.如权利要求20所述的方法,其中BAX处于活细胞中并且BAX的抑制抑制细胞死亡。22.如权利要求20或21所述的方法,其中所述BAX处于受试者中并且将试剂施用于受试者。23.如权利要求22所述的方法,其中受试者是人。24.如权利要求22或23所述的方法,其中受试者患有与过早或不需要的细胞死亡相关联并且特征为BAX的异常激活、表达或功能的疾病或病症。25.如权利要求13或24所述的方法,其中所述疾病或病症是心血管疾病或病症、神经变性或神经疾病或障碍、肝疾病或病症、肾疾病或病症、免疫病症、缺血、不育症、血液病症、肾缺氧、肝炎、哮喘或AIDS。26.-种标记的肽,其包含连接至荧光标记或放射性标记的权利要求15-19中任何项所述的肽。27.-种鉴别用作抑制细胞死亡的候选试剂的试剂的方法,所述方法包括:在试剂存在和缺少时,使BCL-2相关X蛋白(ΒΑΧ与权利要求15-19或26中任何项的一种或多种肽接触,以及测量所述一种或多种肽与BAX的结合,其中相比于试剂缺少时所述一种或多种肽与MX的结合,在试剂存在时所述一种或多种肽与BAX减少的结合表明试剂是用于抑制细胞死亡的候选试剂。

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