申请/专利权人：伯尔尼大学

申请日：2017-01-24

公开（公告）日：2018-09-28

公开（公告）号：CN108602868A

主分类号：C07K14/47(2006.01)I

分类号：C07K14/47(2006.01)I;A61K38/17(2006.01)I;B82Y5/00(2006.01)I;B82Y40/00(2006.01)I

优先权：["2016.01.25 EP 16152579.5"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.12.30#授权;2019.02.22#实质审查的生效;2018.09.28#公开

摘要：本发明涉及纳米球及其制备方法和所述纳米球的用途，所述纳米球包含相等数目的人SEC 14样蛋白和所述SEC 14样蛋白的同源配体。

主权项：1.一种纳米球，其包含相等数目的：i人SEC 14样蛋白，和ii所述SEC 14样蛋白的同源配体，所述纳米球优选由以上组成。

全文数据：SEC14样蛋白及同源配体的纳米球技术领域[0001]本发明涉及纳米球及制备其的方法和所述纳米球的用途，所述纳米球包含相等数目的人SECl4样蛋白和所述SECl4样蛋白的同源配体。背景技术[0002]SEC14基因产物SEC14p首先是在酵母酿酒酵母Saccharomycescerevisiae中鉴定出的，其用作使磷脂酰肌醇从高尔基体到质膜的转移蛋白。SEC14蛋白中的结构域的X射线结构揭示了具有用于脂质结合的疏水口袋的特征性α-β-α夹心。SecHp对于通过将脂质信号传导事件与涉及囊泡出芽的蛋白质整合的来自跨高尔基体网络的分泌囊泡的生物发生是必需的。SECHpSra2、SH13、SFH4和SH15的酵母同源物通过调节PtdIns激酶和磷脂酶D活性和通过促进磷酸肌醇生成来实现互补功能（LLi，X.等，MolBiolCell.200011:1989-2005和其中引用的参考文献）。[0003]在高等真核生物中，酵母SECHp的功能同源物构成具有相关功能的SEC14样蛋白家族（Peterman,Τ·Κ·等，PlantPhysiol.2004136:3080-3094elnterPro综合数据库https:www.ebi.ac.ukinterpro的蛋白质序列分析和分类预测了SEC14样蛋白家族的所有成员共同具有来源于CRALBP的主要结构和三重功能TRIO蛋白的特征性CRAL-TRI0IPR001251结构域。CRAL-TRI0结构域代表用于螯合小亲脂性分子的结构支架PanagabkoC等，Biochemistry200342:6467-6474和其中引用的参考文献）。该结构域可以构成SEC14样蛋白的全部或仅其一部分。CRAL-TRIO-only蛋白如SEC14p、CRALBP或α-ΤΤΡ已被鉴定为分别用于磷脂酰肌醇、11-顺式视黄醛和生育酚（α-tol的膜间转移的细胞溶质因子PanagabkoC等，Biochemistry200342:6467-6474和其中引用的参考文献）。[0004]α-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ是一种胞质32kDa蛋白，其促进亲脂性维生素E分子通过亲水介质转运并被生物体吸收。它属于已知参与脂质调节的SEC14样蛋白家族PanagabkoC等，Biochemistry200342:6467_6474;L.Aravind等，Curr.Biol.19999:195-197和其中引用的参考文献）。折叠由构成结合腔底部的五条平行的β-股线、可变数目的α-螺旋和在羧基末端区域的可移动螺旋门组成，其允许亲脂性同源配体进入结合口袋StockerA.AnnNYAcadSci.200141031:44-59;MeierR等，JMolBiol2003331:725-734w-ΤΤΡ在大鼠和人中均已分离，其主要在肝中表达，但其也存在于胎盘中和脑中Kaempf-Rotzoll等，Placenta200324,439-444和其中引用的参考文献）π-ΤΤΡ在调节肝细胞中的维生素E中起关键作用，并且对生物体的健康至关重要，因为其不良表达或突变与AVED遗传疾病的发生直接相关OuahchiK.等，Nat.Genet.19959:141-145。[0005]在1987年，细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP被鉴定为对9-顺式-视黄醛Kd=53nM、11-顺式-视黄醛Kd=20nM和11-顺式-视黄醇Kd=60nM具有纳摩尔亲和力的高亲和力结合剂（SaariJC和BredbergDLJBiolChem.1987262:7618-22。同一研究表明CRALBP不结合13-顺式或全反式-视黄醛。CRALBP的另一功能是通过其保护其同源顺式同源配体免受过早异构化的能力而给出的。CRALBP还增加视觉周期的视黄醛通量，即从全反式-视黄醛到11-顺式-视黄醛的眼睛的生化再生途径。在该途径中，CRALB刺激RPE65的异构酶活性P.D.Kiser等，2015NatureChemicalBiology11:409-415并且促进11-顺式视黄醇结合到RDH5脱氢酶中（GambleMVl等，JLipidRes.199940:2279-92。最后，其确保通过未知机制将来自RDH5的11-顺式-视黄醛转移通过细胞质移出细胞。表征人CRALBP的基因突变可以表明该蛋白质对于棒和锥中的有效暗适应是必需的（M.S.Brstedt等，2003VisionRes.43:2559-2571。[0006]SEC14样Clavesin1和2都只在神经元中表达。这些蛋白质是胞质的，但也通过它们的CRAL-TRI0结构域通过与内体膜中丰富的磷脂酰肌醇3，5-二磷酸相互作用而结合到内体溶酶体区室OiatohY等，JBiolChem.2009284:27646-54Xlavesin富含网格蛋白包被的囊泡，在那里它们与网格蛋白重链和衔接蛋白_1网格蛋白包被的囊泡的主要外壳成分形成复合物。使用干扰RNA的慢病毒递送在神经元中异构体特异性击倒clavesin表明对晚期内体溶酶体形态学的独特神经元特异性调节KatohY等，JBiolChem.2009284:27646-54〇[0007]SEC14样蛋白如α-ΤΤΡ和CRALBP以低纳摩尔亲和力结合特定的天然同源配体。这样的同源配体与血浆隔离，并被选择为克服阻碍不溶性脂质的自由扩散的热力学屏障Cohn，[,AmJClinNutr199969:156-157oCRALBP介导的眼内1H"页式视黄醛转移对于持续视力是必不可少的M.S.Brstedt等，2003VisionRes.43:2559-2571π-ΤΤΡ通过选择性保留α-维生素E、具有最高抗氧化能力的维生素E异构体而对维生素E体内平衡至关重要Κοηο,Ν.和Arai，H.Traffic201516:19-34。[0008]众多可遗传的疾病与SEC14样蛋白相关。据报道，TTPA的人α-ΤΤΡ基因产物中的缺陷导致具有孤立维生素E缺乏症的常染色体隐性共济失调AVED的表型（OuahchiΚ.等，Nat.Genet.19959:141-145。该疾病的特征在于维生素E的血浆水平检测不到或显著降低、脊髓小脑变性、共济失调、无反射和本体感觉丧失。具有相关神经表型的共济失调的另一种形式是由ATCAY的SEC14样Caytaxin基因产物中的突变引起的（BomarJ.M.等，Nat.Genet.200335:264-269ALBPl基因的CRALBP基因产物中的缺陷导致严重的视网膜病变MawM.A.等，1997Nat.Genet·17:198-200〇发明内容[0009]本发明涉及惊人发现，是以前未知的具有它们的同源配体的SEC14样蛋白家族的纳米球聚集体、其制备方法及其用途。[0010]因此，本发明的第一方面提供纳米球，其包含相等数目的（i人SEC14样蛋白、和[11]所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成。优选地，所述相等数目为3至60,进一步优选地，所述相等数目为9至60。在本发明的非常优选的实施方式中，所述人SEC14样蛋白选自（aα-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ;⑹细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP;CClavesinlCLVSl;⑹Clavesin2CLVS2;和eα-生育酚转移蛋白样TTPAL。[0011]在另一方面，本发明提供生产本发明的纳米球的方法和本发明的纳米球的用途。[0012]因此，在另一方面，本发明提供制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的⑴人SEC14样蛋白、和（ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成，其中所述方法包括以下步骤：（a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为ΙμΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6至9，并且其中优选所述溶液I包含盐，其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;⑹在溶液II中提供所述SEC14样蛋白的同源配体，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的浓度为5μΜ至500mM，并且其中所述溶液II的溶剂为水溶性溶剂；（c通过组合所述溶液I和所述溶液II以产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔），并且其中所述溶液III中所述水溶性溶剂的体积为0.5-8%体积体积）；（d使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体组装成纳米球；（e从所述溶液III中分离所述纳米球；（f任选地纯化所述纳米球。[0013]再一方面，本发明提供制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的（i人SEC14样蛋白、和（ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成;其中所述方法包括以下步骤：（a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为ΙμΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6到9;⑹在水溶液II中提供所述SEC14样蛋白的同源配体，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的浓度为5μΜ至500mM;并且其中所述溶液II包含洗涤剂；（c通过组合所述溶液I和所述溶液II以产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔）；（d从所述溶液III中去除所述洗涤剂，其中从所述溶液III中去除所述洗涤剂使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体组装成纳米球；（e从所述溶液III中分离所述纳米球；（f任选地纯化所述纳米球。[0014]再一方面，本发明提供制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的（i人SEC14样蛋白、和（ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成;其中所述方法包括以下步骤：（a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为ΙμΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6至9,并且其中优选所述溶液I包含盐，其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;b在溶液II中提供所述SEC14样蛋白的同源配体，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的浓度为5μΜ至500mM，并且其中所述溶液II的溶剂为水溶性溶剂；（c通过组合所述溶液I和所述溶液II以产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔），并且其中所述溶液III中所述水溶性溶剂的体积为0.5-8%体积体积）；（d使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体形成由所述SEC14样蛋白之一和所述SEC14样蛋白的所述同源配体之一组成的单体复合物；（e从所述溶液III中分离所述单体复合物；（f任选地纯化所述单体复合物；（g产生水溶液IV，其中所述溶液IV包含所述单体复合物，并且其中所述溶液IV中所述单体复合物的浓度为5mgml至50mgml;并且其中所述溶液IV的pH为6至9,并且其中优选所述溶液IV包含盐，其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;⑹使所述单体复合物形成所述纳米球的晶体。[0015]再一方面，本发明提供制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的（i人SEC14样蛋白、和（ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成;其中所述方法包括以下步骤：（a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为ΙμΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6到9;⑹在水溶液II中提供所述SEC14样蛋白的同源配体，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的浓度为5μΜ至500mM;并且其中所述溶液II包含洗涤剂；（c通过组合所述溶液I和所述溶液II以产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔）；（d从所述溶液III中去除所述洗涤剂，其中从所述溶液III中去除所述洗涤剂使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体形成由所述SEC14样蛋白之一和所述SEC14样蛋白的所述同源配体之一组成的单体复合物；（e从所述溶液III中分离所述单体复合物；⑴任选地纯化所述单体复合物；（g产生水溶液IV，其中所述溶液IV包含所述单体复合物，并且其中所述溶液IV中所述单体复合物的浓度为5mgml至50mgml，并且其中所述溶液IV的pH为6至9,并且其中优选所述溶液IV包含盐，并且其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;h使所述单体复合物形成所述纳米球的晶体。[0016]再一方面，本发明提供药物组合物，其包含a本发明的纳米球;和b药学上可接受的载体。[0017]再一方面，本发明提供本发明的纳米球或药物组合物在治疗或预防、优选治疗具有维生素E缺乏症的共济失调AVED、肌肉营养不良、低脂血症、低脂蛋白血症、血脂异常、人类不育症、伤口愈合受损或炎性疾病的方法中的用途，其中优选所述炎性疾病为关节炎。[0018]随着该说明书的进行，本发明的其它方面和优选实施方式将变得明显。附图说明[0019]图1:A由单体α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ和由包含α-ΤΤΡ三聚体的α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球组成的同源配体-复合物的混合物的制备型SEC迹线。峰S表示集中在与质量0.76Mda相关的保留体积的α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球，并且峰M表示与质量32kDa相关的单体α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ。峰V含有高度聚集的蛋白质，其集中在柱的空隙体积。Bap〇-a-TTP黑色迹线）的和代表由单体α-ΤΤΡ-α-Tol和由包含α-ΤΤΡ三聚体的a-TTP-a-Tol纳米球组成的同源配体-复合物的混合物的holo-a-TTP灰色迹线）的分析型SEC迹线。apo-a-TTP的黑色迹线表明集中在与质量64kDa相关的保留体积的二聚体apo-α-ΤΤΡ和集中在与质量32kDa相关的保留体积的单体apo-α-ΤΤΡ的存在。灰色holo-a-TTP迹线表明集中在与质量0.76Mda相关的保留体积的a-TTP-a-Tol纳米球和与质量32kDa相关的单体a-TTP-a-Tol的存在。次要峰D最可能在由集中在与质量64kDa相关的保留体积的无同源配体二聚体apo-α-ΤΤΡ组成时是可见的。[0020]图2:来自制备型SEC的峰S的峰部分的负染色透射电子显微镜TEM图像揭示了球形物体的物理存在。[0021]图3:来自制备型SEC的峰级分的蛋白质印迹;重组α-ΤΤΡ的存在由抗6xHis和抗-Ct-TTP抗体证实。[0022]图4:来自制备型SEC的峰级分M、D和S的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳:峰S包含具有近似质量〇.80MDa的低聚a-TTP-a-Tol纳米球，峰D主要包含具有近似质量64kDa的同源二聚体apo-α-ΤΤΡ，峰M主要含有单体α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ。[0023]图5:单体apo-a-TTP1、单体a-TTP-a-Tol2和低聚a-TTP-a-Tol纳米球⑶通过⑶光谱在222nm处监测的热变性迹线。[0024]图6:低聚a-TTP-a-Tol纳米球的四聚体组装的原子模型:在左边描绘了原子模型沿三个对称轴的视图。插图描绘了在a-TTP-a-Tol纳米球的氧化形式中沿着双重对称轴在菱形通道上的两个相邻C80之间的胱氨酸键形成。在右侧显示了具有坐在节点上的单体的带状卡通的扭曲蜂窝立方体TCC的几何表示。[0025]图7:A三重轴上的蛋白质-蛋白质相互作用的示意图A以及促进α-ΤΤΡ-α-Τ〇1纳米球稳定性的蛋白质-蛋白质相互作用的总结⑻。使用FoldXGueroisR，NielsenJE，SerranoL2002，JMolBio320:369-387计算机算法评估蛋白质-蛋白质相互作用。为此，使α-ΤΤΡ-α-Tol纳米球最小化在298K，pH7,0.05M离子强度下），以便为随后的能量计算和结构比较生成参考结构。[0026]图8:A大多数疏水性残基聚集成特征性序列图案，导致α-ΤΤΡ-α-Tol纳米球中的三聚体形式。CRALBP的一级序列（SEQIDΝ0:8和SEQIDΝ0:9中存在高度相似图案的疏水残基。Β使用MULTALIN网络服务（Corpet，F.!NucleicAcidsRes.198816:10881-10890对其它SEC14样蛋白中α-ΤΤΡ氨基酸47-90的N-末端片段和相关片段进行一级序列比对。保守或半保守残基用浅灰色表示。特征序列图案的大部分疏水性残基用实心三角形（SEQIDN0:10、SEQIDN0:ll、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13和SEQIDN0:14标记。Cα-TTP氨基酸47-90和CRALBP氨基酸91-123的二级螺旋-环-螺旋结构的基于PSIPRED的比较揭示了高度结构相似性SEQIDNO:15和SEQIDNO:16。[0027]图9:描述了优选的SECl4样蛋白的一级序列，特征序列图案的残基以浅灰色突出显不O[0028]图10:来自分析型SEC的CRALBP-11-顺式-视黄醛纳米球的峰值部分的负染色透射电子显微镜TEM图像揭示了在9至48nm的尺寸范围内的球形物体的物理存在。[0029]图11:由单体CRALBP-9-顺式-视黄醛和CRALBP-9-顺式-视黄醛纳米球组成的同源配体-复合物的混合物的分析型SEC迹线。A保留体积为17.5ml的峰与平均质量36kDa相关，并且15ml的峰与平均质量420kDa相关;B与在胆酸钠存在下预先加入的配体的混合物:保留体积为17.8ml的峰与平均质量36kDa相关，并且13.5ml的峰与平均质量1700kDa相关;C与在乙醇存在下预先加入的配体的混合物:保留体积为17.8ml的峰与平均质量36kDa相关，并且15ml的峰与平均质量540kDa相关。实线表示在280nm处监测的蛋白质浓度，而虚线表示在405nm处监测的结合9-顺式视黄醛的浓度。带数字的箭头表示同源低聚复合物的多样性。[0030]图12:单体α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ和包含α-ΤΤΡ三聚体的α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球的转胞吞作用A同时测定跨越人脐静脉内皮细胞HUVEC单层的转胞吞速率（阴影区域和细胞旁通量黑暗区域）。（B跨越异质人上皮结直肠腺癌细胞CaCo-2单层的相应转胞吞速率和细胞旁通量。具体实施方式[0031]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。[0032]纳米球:如本文所用，术语“纳米球”是指组合物，通常且优选为多面体结构，由多个SEC14样蛋白和相等数目的所述SEC14样蛋白的同源配体形成。通常且优选地，所述数目为至少3且至多60个。进一步优选地，所述数目为至少9且至多60。再进一步优选地，所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的同源配体的所述相等数目是3的倍数，并且其中进一步优选所述相等数目是3、9、12、24、36、48和60，再进一步优选9、12、24、36、48和60。再进一步优选地，所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的同源配体的相等数目是3的倍数，并且所述数目为至少3且至多60,其中进一步优选所述相等数目是3、9、12、24、36、48和60,再进一步优选9、12、24、36、48和60。通常且优选地，所述多面体结构的尺寸为511111至6〇11111，优选尺寸为7nm至55nm，并且进一步优选尺寸为9nm至48nm，优选地通过如本实施例3E所述方式的动态光散射来确定。因此，如本文所用，通常且优选地，术语“纳米球”是指尺寸为5nm至60nm，优选尺寸为7nm至55nm，并且进一步优选尺寸为9nm至48nm，优选地通过动态光散射来确定，并且进一步优选如本实施例3E中所述，并且其中所述多面体结构由至少三个拷贝的SEC14样蛋白和相等数目的所述SEC14样蛋白的同源配体形成，所述多面体结构进一步优选由至少九个，进一步优选由至少十二个或再进一步优选由至少24、36、48或60个形成。通常且优选地，所述相等规则数目的SEC14样蛋白形成中空蛋白质包衣，其中所述多面体结构的尺寸为5nm至60nm，优选7nm至55nm，并且进一步优选地通过动态光散射来确定，并且进一步优选如本实施例3E中所述，并且其中多面体结构中相等数目的所述SEC14样蛋白的同源配体聚集。因此，所述纳米球中所述SEC14样蛋白与所述SEC14样蛋白的同源配体的化学计量比为1:1。通常且优选地，所述纳米球由一种类型的SEC14样蛋白和相等数目的所述SEC14样蛋白的同源配体组成。通常且优选地，形成具有所述多面体结构的所述中空包衣的相等的SEC14样蛋白构建体在本文中也称为“原体”。[0033]SEC14样蛋白：如本文所用可互换使用的术语“SEC14样蛋白”或“SEC14样蛋白家族”是指命名为CRAL-TR10的蛋白质结构域（ShaBl等，Nature.1998391:506-10，其通常且优选地结合小亲脂性分子（PanagabkoC等，Biochemistry200342:6467-6474XRAL-TRIO脂质结合结构域是αί3结构域，其形成大疏水口袋。它的口袋地板由六个β-股线构成，其中股线2、3、4和5构成平行的β折叠，并且其中股线1和6是反平行的。空腔的侧面由α-螺旋形成。CRAL-TRI0结构域可以构成蛋白质的全部或仅其一部分（ShaBl等，Nature.1998391:506-10;PanagabkoC等，Biochemistry200342:6467-6474。通常且优选地，SEC14样蛋白的同源配体游离形式在本文中也称为所述SECl4样蛋白的“apo”形式。[0034]SEC14样蛋白的同源配体:如本文所用，术语“SEC14样蛋白的同源配体”是指分子，通常且优选指与CRAL-TR10脂质结合口袋结合的脂质，具有通常且优选I-IOOnM的纳摩尔亲和力，进一步通常且优选具有6_60nM的亲和力，并且该分子通常且优选在功能上与SEC14样蛋白相关。功能上相关:如本文所用，术语“功能上相关”是指SEC14样蛋白的生理功能，其严格依赖于生理同源配体本文中称为同源配体）的结合，具有至少通常且优选I-IOOnM的纳摩尔亲和力，进一步通常且优选具有6_60nM的亲和力。举例来说，R，R，R-α-生育酚代表α-生育酚转移蛋白（a-TTP的同源配体，并且R，R，R-a_生育酚代表最强的脂溶性抗氧化剂之一。[0035]结合:如本文所用，术语“结合”是指通过所有可能的方式、优选化学相互作用将两个分子连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价相互作用。非共价相互作用的通常示例是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用基于共价键。在优选的实施方式中，每个所述SEC14样蛋白通过至少一种共价或至少一种非共价相互作用与所述SEC14样蛋白的所述至少一种同源配体中的一种结合。进一步优选地，每个所述SEC14样蛋白通过至少一种非共价相互作用与所述SEC14样蛋白的所述至少一种同源配体中的一种结合。[0036]序列同一性:基于两个序列的比对来确定两个给定氨基酸序列的序列同一性。确定序列同一性的算法对于技术人员是可获得的。优选地，使用公众可获得的计算机同源程序如“BLAST”程序http:blast.ncbi.nlm.nih.govBlast.cgi或“CLUSTALW”http:www.genome.jptoolsclustalw，并因此优选地通过在NCBI主页http:blast·ncbi·nlm.nih.govBlast.cgi上提供的“BLAST”程序使用其中提供的默认设置来确定两个氨基酸序列的序列同一性。通常且优选的标准设置是:预期阈值：10;字大小:3;查询范围内的最大匹配数矩阵:BL0SUM62;差距成本:存在11，延期1;构图调整:条件构图分数矩阵调整。[0037]对应于残基...的位置:对应于另一个氨基酸序列的给定残基的氨基酸序列上的位置可以通过序列比对来识别，通常且优选地通过使用BLASTP算法，最优选地使用标准设置。通常且优选的标准设置是:预期阈值：10;字大小:3;查询范围内的最大匹配数:0;矩阵：BL0SUM62;差距成本:存在11，延期1;构图调整:条件构图分数矩阵调整。“对应于残基...的位置”的非常优选的确定方式凭借对应于本发明的优选实施方式的SEC14样蛋白α-ΤΤΡ和CRALBP而概述在图8Α和图8Β中。[0038]有效量:如本文所用，术语“有效量”是指实现期望的生物效应所必需或足够的量。优选地，术语“有效量”是指本发明的纳米球的量：（i治疗或预防特定疾病、医学状况或病症，（ii减弱、改善或消除一种或多种特定疾病、医学状况或病症的症状（iii预防或延迟本文所述的一种或多种特定疾病、医学状况或病症的症状的发作。本发明纳米球或所述药物组合物的有效量将是达到该选定结果的量，并且该量可以由本领域技术人员按常规方式确定。有效量可以根据施用的特定组合物和受试者的大小而变化。本领域普通技术人员可以凭经验确定本发明的特定组合物的有效量，而不需要过度的实验。[0039]本发明涉及惊人发现，是以前未知的具有它们的同源配体的SEC14样蛋白家族的纳米球聚集体、其制备方法及其用途。[0040]因此，本发明的第一方面提供纳米球，其包含相等数目的（i人SEC14样蛋白和ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成。优选地，所述相等数目是3至60。进一步优选地，所述相等数目是9至60。[0041]在本发明的一个非常优选的实施方式中，所述相等数目是3的倍数。在本发明的另一个非常优选的实施方式中，所述相等数目是3的倍数，并且所述相等数目是3至60。在本发明的另一个非常优选的实施方式中，所述相等数目是3的倍数，并且所述相等数目是3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57或60。[0042]在本发明的一个非常优选的实施方式中，所述相等数目是3、9、12、24、36、48或60。在本发明的另一个非常优选的实施方式中，所述相等数目是9、12、24、36、48或60。在本发明的另一个非常优选的实施方式中，所述相等数目是24或48。[0043]在本发明的另一个非常优选的实施方式中，所述人SEC14样蛋白选自（aα-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ;b细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP;cClavesinlCLVSl;dClavesin2CLVS2;和ea-生育酚转移蛋白样TTPAL。[0044]在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述SEC14样蛋白是a-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ，其中优选所述相等数目是24。优选所述a-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ的所述同源配体是生育酚，其中优选所述生育酚是a-生育酚，并且其中优选所述a-生育酚是R，R，R_a生育酚。[0045]在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述SEC14样蛋白是a-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ，并且所述a-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ的所述同源配体是a-生育酚，并且其中所述相等数目为3至60，并且其中优选所述a-生育酚是R，R，R-a生育酚。[0046]在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述SEC14样蛋白是α-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ，并且所述α-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ的所述同源配体是α-生育酚，并且其中所述相等数目为9至60，并且其中优选所述α生育酚是R，R，R-α生育酚。[0047]在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述SEC14样蛋白是α-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ，并且所述α-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ的所述同源配体是R，R，R-a_生育酚，并且所述相等数目为3至60,其中优选所述相等数目为3、9、12、24、36、48或60。在本发明的另一个非常优选的实施方式中，所述相等数目为24或48。[0048]在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述SEC14样蛋白是α-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ，并且所述α-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ的所述同源配体是R，R，R-a_生育酚，并且所述相等数目为9至60,其中优选所述相等数目为9、12、24、36、48或60。在本发明的另一个非常优选的实施方式中，所述相等数目为24或48。[0049]在又一个非常优选的实施方式中，本发明提供了纳米球，其包含相等数目的⑴人SEC14样蛋白和（ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成，其中所述相等数目是3的倍数，并且其中优选所述数目是3至60,并且其中所述人SEC14样蛋白选自（aα-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ;⑹细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP;cClavesinlCLVSl;dClavesin2CLVS2;和eα-生育酚转移蛋白样TTPAL。[0050]在本发明的又一个非常优选的实施方式中，所述SEC14样蛋白是细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP。优选所述CRALBP的所述同源配体是顺式-视黄醇或顺式-视黄醛，其中进一步优选所述顺式-视黄醇或所述顺式-视黄醛选自9-顺式-视黄醛、11-顺式-视黄醛、9,13-二顺式-视黄醛、9-顺式-视黄醇、11-顺式-视黄醇和9,13-二顺式-视黄醇。在本发明的一个非常优选的实施方式中，所述CRALBP的所述同源配体是9-顺式-视黄醛。在本发明的另一个非常优选的实施方式中，所述CRALBP的所述同源配体是11-顺式-视黄醛。在本发明的另一个优选实施方式中，所述CRALBP的所述同源配体是9-顺式-视黄醇。在本发明的另一个优选实施方式中，所述CRALBP的所述同源配体是11-顺式-视黄醇。在本发明的另一个实施方式中，所述CRALBP的所述同源配体是9,13-二顺式-视黄醛。在本发明的另一个实施方式中，所述CRALBP的所述同源配体是9，13-二顺式-视黄醇。[0051]在本发明的一个优选实施方式中，所述SEC14样蛋白是包含选自以下的氨基酸序列的蛋白质：（aSEQIDNO:3α-ΤΤΡHUMAN;⑹SEQIDNO:4CRALBPHUMAN;cSEQIDN0:5CLVS1HUMAN;⑹SEQIDN0:6CLVS2HUMAN;和（eSEQIDN0:7TTPALHUMAN。[0052]在本发明的另一个优选实施方式中，所述SEC14样蛋白包含氨基酸序列段，其中所述氨基酸序列段具有选自以下的氨基酸序列：（aSEQIDN0:3的氨基酸56至74;⑹SEQIDN0:4的氨基酸100至118;cSEQIDN0:5的氨基酸80至98;⑹SEQIDN0:6的氨基酸58至76;和（eSEQIDNO:7的氨基酸85至103。[0053]在本发明进一步优选的实施方式中，所述SEC14样蛋白的氨基酸序列包含a所述SEC14样蛋白的所述氨基酸序列的位置上选自L和I的氨基酸残基，其对应于SEQIDNO:3的位置56;⑹所述SEC14样蛋白的所述氨基酸序列的位置上的氨基酸残基F，其对应于SEQIDN0:3的位置61;c所述SEC14样蛋白的所述氨基酸序列的位置上选自1^、¥、〇、!1和¥的氨基酸残基，其对应于SEQIDN0:3的位置63;⑹所述SEC14样蛋白的所述氨基酸序列的位置上选自W、Y、F和L的氨基酸残基，其对应于SEQIDN0:3的位置67;e所述SEC14样蛋白的所述氨基酸序列的位置上的氨基酸残基L，其对应于SEQIDN0:3的位置70;或f所述SEC14样蛋白的所述氨基酸序列的位置上选自Y、V、F和H的氨基酸残基，其对应于SEQIDNO:3的位置74;其中所述SEC14样蛋白的所述氨基酸序列包含至少两个、优选至少三个、进一步优选至少四个、再进一步优选至少五个所述氨基酸残基a-f中的任一者;并且其中优选地，为所述纳米球所包含的所述数目的SEC14样蛋白中第一个SEC14样蛋白的所述氨基酸序列的a-f中的任一者的至少四个氨基酸残基结合为所述纳米球所包含的所述数目的SEC14样蛋白中第二和第三个SEC14样蛋白的所述氨基酸序列的a-f中的任一者的至少四个氨基酸残基。[0054]在本发明进一步优选的实施方式中，所述SEC14样蛋白包含氨基酸序列，其中所述SEC14样蛋白的所述氨基酸序列包含a对应于SEQIDN0:3的位置56的位置上选自L和I的氨基酸残基；⑹对应于SEQIDN0:3的位置61的位置上的氨基酸残基F;c对应于SEQIDN0:3的位置63的位置上选自L、V、Q、H和Y的氨基酸残基；⑹对应于SEQIDN0:3的位置67的位置上选自W、Y、F和L的氨基酸残基；（e对应于SEQIDN0:3的位置70的位置上的氨基酸残基L;或（f对应于SEQIDN0:3的位置74的位置上选自Y、V、F和H的氨基酸残基；其中所述SEC14样蛋白的所述氨基酸序列包含至少两个、优选至少三个、进一步优选至少四个、再进一步优选至少五个所述氨基酸残基a-f中的任一者;并且其中优选地，为所述纳米球所包含的所述数目的SEC14样蛋白中第一个SEC14样蛋白的所述氨基酸序列的a-f中的任一者的至少四个氨基酸残基结合为所述纳米球所包含的所述数目的SEC14样蛋白中第二和第三个SEC14样蛋白的所述氨基酸序列的a-f中的任一者的至少四个氨基酸残基。[0055]不受此理论的束缚，据信上述氨基酸序列残基和图案有利于形成所述SEC14样蛋白的三聚体聚集体，其转而有利于形成本发明的纳米球体。此外，并且同样不受该理论的束缚，据信所述SEC14样蛋白的同源配体的隔离过程伴随着SEC14样蛋白中的构象重排，包括其C端区域命名为移动门）的螺旋元件的闭合运动。因此，不受此理论的束缚，据信三聚体聚集体，特别是本发明的纳米球的形成取决于SEC14样蛋白的N端区域内的构象重排，其实现了携带前述氨基酸序列残基以及另外不与溶剂接触的图案的螺旋-转角-螺旋片段的未掩蔽。通常地，所述SEC14样蛋白的所述同源配体的加载过程产生单体和纳米球蛋白质-配体复合物的混合物，其可以通过合适的色谱法如尺寸排阻色谱法和或阴离子交换色谱法来纯化。[0056]此外，我们已经表明，本发明的纳米球，特别是本发明的SEC14样蛋白α-ΤΤΡ的纳米球确实有效地转胞吞穿过原代人脐静脉内皮细胞。通过证明没有相同纳米球的转胞吞作用穿过标准上皮细胞系，该过程显示出高度特异性。作为结果，预计本发明的纳米球非常适于在注入血流时克服血脑屏障。[0057]在本发明的一个优选实施方式中，每个所述SEC14样蛋白的所述同源配体通过至少一种非共价相互作用与所述SEC14样蛋白之一结合，其中优选每个所述SEC14样蛋白的所述同源配体通过至少一种非共价相互作用仅与所述SEC14样蛋白之一结合。[0058]在另一方面，本发明提供制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的（i人SEC14样蛋白和（ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成，其中优选所述相等数目为3至60,其中所述方法包括以下步骤：（a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为ΙμΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6至9,并且其中优选所述溶液I包含盐，其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;b在溶液II中提供所述SEC14样蛋白的同源配体，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的浓度为5μΜ至500mM，并且其中所述溶液II的溶剂为水溶性溶剂；（c通过组合所述溶液I和所述溶液II以产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔），并且其中所述溶液III中所述水溶性溶剂的体积为0.5-8%体积体积）；（d使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体组装成纳米球；（e从所述溶液III中分离所述纳米球；（f任选地纯化所述纳米球。[0059]本发明方法的进一步优选实施方式包括本发明纳米球的优选和非常优选的实施方式。特别地，在一个非常优选的实施方式中，所述相等数目是3的倍数，并且其中优选所述数目是3至60,并且其中所述人SEC14样蛋白选自（aa_生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ;⑹细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP;cClavesinlCLVSl;⑹Clavesin2CLVS2;和（ea-生育酚转移蛋白样TTPAL。[0060]在另一方面，本发明提供制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的（i人SEC14样蛋白和（ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成，其中优选所述相等数目为9至60,其中所述方法包括以下步骤：（a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为ΙμΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6至9,并且其中优选所述溶液I包含盐，其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;b在溶液II中提供所述SEC14样蛋白的同源配体，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的浓度为5μΜ至500mM，并且其中所述溶液II的溶剂为水溶性溶剂；（c通过组合所述溶液I和所述溶液II以产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔），并且其中所述溶液III中所述水溶性溶剂的体积为0.5-8%体积体积）；（d使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体组装成纳米球；（e从所述溶液III中分离所述纳米球；（f任选地纯化所述纳米球。[0061]本发明方法的进一步优选实施方式包括本发明纳米球的优选和非常优选的实施方式。特别地，在一个非常优选的实施方式中，所述相等数目是3的倍数，并且其中优选所述数目是3至60,并且其中所述人SEC14样蛋白选自（aa_生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ;⑹细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP;cClavesinlCLVSl;⑹Clavesin2CLVS2;和（ea-生育酚转移蛋白样TTPAL。[0062]在另一个优选的实施方式中，所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为0.ImM至ImM，并且进一步优选所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为0.25mM至0.75mM。[0063]在进一步优选的实施方式中，所述溶液I的pH为7至8。优选所述溶液I包含盐，其中所述盐的浓度为IOmM至500mM。进一步优选的是，所述盐的浓度为30mM至350mM，并且进一步优选所述盐的浓度为IOOmM至250mM。[0064]在进一步优选的实施方式中，所述盐选自一价、二价、三价或四价无机或有机盐，并且其中进一步优选所述盐选自二价、三价或四价无机或有机盐，并且其中再进一步优选所述盐包含选自HP〇42_、S〇42_、酒石酸根、丙二酸根、D-肌醇1，4,5_三磷酸根和D-肌醇1，3,4，5-四（磷酸钾盐的二价、三价或四价阴离子。[0065]在另一个优选的实施方式中，所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的所述浓度为30μΜ至300mM，进一步优选所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的浓度为200μΜ至200mM〇[0066]所述溶液II的溶剂是水溶性溶剂。在本发明的范围内，用于溶液II的水溶性溶剂可以包含少量，即至多10%vV的水，尽管通常且优选所述水溶性溶剂不包含任何另外量的水，而不是由制造商供应时通常包含在所述水溶性溶剂中的少量水。更优选地，所述水溶性溶剂不包含超过8%vv，优选超过7%vv，进一步优选超过5%vv的水。[0067]在本发明的一个优选实施方式中，所述水溶性溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇、丁醇、二甲基亚砜DMSO、四氢呋喃THF、二噁烷、甲基戊二醇和甘油;进一步优选所述水溶性溶剂选自乙醇、异丙醇和二甲基亚砜DMSO。[0068]在本发明的一个优选实施方式中，所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为3:1至1:3摩尔摩尔），并且优选所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为2:1至1:2摩尔摩尔）。[0069]在本发明的另一个优选实施方式中，所述溶液III中所述水溶性溶剂的体积为1-5%体积体积），优选所述溶液III中所述水溶性溶剂的体积为2-4%体积体积）。[0070]在本发明的一个优选实施方式中，所述使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体组装成纳米球是通过将所述溶液III保持在4-37Γ，优选在室温下放置1小时至24小时，优选12至24小时来实现的。[0071]在本发明进一步优选的实施方式中，所述从所述溶液III中分离所述纳米球是通过尺寸排阻色谱法或阴离子交换色谱法，优选通过尺寸排阻色谱法来实现的。[0072]在本发明的另一个优选实施方式中，所述纯化所述纳米球是通过尺寸排阻色谱法或阴离子交换色谱法，优选通过尺寸排阻色谱法来实现的。[0073]在另一方面，本发明提供制备如本文所述的本发明纳米球的方法，其中所述纳米球包含相等数目的⑴人SEC14样蛋白和（ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成，其中优选所述相等数目为3至60,其中所述方法包括以下步骤：（a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为ΙμΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6至9;⑹在水溶液II中提供所述SEC14样蛋白的同源配体，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的浓度为5μΜ至500mM;并且其中所述溶液II包含洗涤剂；（c通过组合所述溶液I和所述溶液II以产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔）；（d从所述溶液III中去除所述洗涤剂，其中从所述溶液III中去除所述洗涤剂使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体组装成纳米球；（e从所述溶液III中分离所述纳米球；（f任选地纯化所述纳米球。本发明方法的进一步优选实施方式包括本发明纳米球的优选和非常优选的实施方式。特别地，在一个非常优选的实施方式中，所述相等数目是3的倍数，并且其中优选所述数目是3至60,并且其中所述人SEC14样蛋白选自（aa_生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ;⑹细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP;cClavesinlCLVSl;dClavesin2CLVS2;和eα-生育酚转移蛋白样TTPAL。[0074]在另一方面，本发明提供制备如本文所述的本发明纳米球的方法，其中所述纳米球包含相等数目的⑴人SEC14样蛋白和（ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成，其中优选所述相等数目为9至60,其中所述方法包括以下步骤：（a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为ΙμΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6至9;b在水溶液II中提供所述SEC14样蛋白的同源配体，其中所述溶液I中SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度为5μΜ至500mM;并且其中所述溶液II包含洗涤剂；（c通过组合所述溶液I和所述溶液II以产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔）；⑹从所述溶液III中去除所述洗涤剂，其中从所述溶液III中去除所述洗涤剂使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体组装成纳米球；（e从所述溶液III中分离所述纳米球；（f任选地纯化所述纳米球。本发明方法的进一步优选实施方式包括本发明纳米球的优选和非常优选的实施方式。特别地，在一个非常优选的实施方式中，所述相等数目是3的倍数，并且其中优选所述数目是3至60,并且其中所述人SEC14样蛋白选自（aa_生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ;⑹细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP;cClavesinlCLVSl;dClavesin2CLVS2;和eα-生育酚转移蛋白样TTPAL。[0075]本发明方法的进一步优选的实施方式包括本发明纳米球的优选和非常优选的实施方式。[0076]在另一个优选的实施方式中，所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为0.ImM至ImM，并且进一步优选所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为0.25mM至0.75mM。在另一个优选的实施方式中，所述溶液I的pH为7至8。[0077]在另一个优选的实施方式中，所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的所述浓度为30μΜ至300mM，进一步优选所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的浓度为200μΜ至200mM〇[0078]对于本发明的方法，所述溶液II包含洗涤剂。洗涤剂用于溶解所述溶液II中所述SEC14样蛋白的同源配体。在本发明的一个优选实施方式中，所述洗涤剂选自非离子型洗涤剂或阴离子型洗涤剂。优选所述非离子型洗涤剂选自辛基β-D-葡糖苷、壬基β-D-葡糖苷、癸基β-D-葡糖苷、壬基β-D-麦芽糖苷、癸基β-D-麦芽糖苷、i^一烷基β-D-麦芽糖苷、十二烷基β-D-麦芽糖苷.，NonidetP40、聚乙二醇200。优选所述阴离子洗涤剂选自胆酸钠、脱氧胆酸钠、甘胆酸钠、脱氧甘胆酸钠和牛磺胆酸钠。[0079]在进一步优选的实施方式中，所述非离子型洗涤剂选自辛基β-D-葡糖苷、壬基β_D-葡糖苷、癸基β-D-葡糖苷、壬基β-D-麦芽糖苷、癸基β-D-麦芽糖苷、i^一烷基β-D-麦芽糖苷、十二烷基β-D-麦芽糖苷、、NonidetP40、聚乙二醇200。[0080]在另一个非常优选的实施方式中，所述阴离子洗涤剂选自胆酸钠、脱氧胆酸钠、甘胆酸钠、脱氧甘胆酸钠和牛磺胆酸钠。在一个非常优选的实施方式中，所述洗涤剂是阴离子洗涤剂，其中所述阴离子洗涤剂是胆酸钠。[0081]所述溶液II中使用的所述洗涤剂的浓度可以由本领域技术人员确定，并且基于本领域技术人员的知识，由于为了溶解所述溶液II中所述SEC14样蛋白的同源配体，浓度取决于所用洗涤剂的性质。通常且优选所述溶液II中所述洗涤剂的浓度高于所述洗涤剂、通常且优选所述非离子洗涤剂或所述阴离子洗涤剂的临界胶束浓度CMC。通常且优选所述洗涤剂通常且优选非离子型洗涤剂或所述阴离子型洗涤剂的临界胶束浓度CMC等于或高于0.5mM，并且其中进一步优选所述非离子型洗涤剂或所述阴离子洗涤剂的临界胶束浓度CMC等于或高于10mM。[0082]在进一步优选的实施方式中，所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为3:1至1:3摩尔摩尔），并且优选所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为2:1至1:2摩尔摩尔）。[0083]在另一个优选的实施方式中，所述从所述溶液III中去除所述洗涤剂通过透析进行;并且其中优选通过透析从所述溶液III中去除所述洗涤剂是跨膜进行的，其中优选所述膜包含截留分子量为l_25kD，优选5-20kD，并且还更优选10-15kD。透析优选用第一缓冲液进行，其中所述第一缓冲液包含碱金属的卤化物，其中优选所述碱金属的卤化物为氯化钾或氯化钠，并且其中优选所述碱金属的卤化物为氯化钠，其中优选所述第一缓冲液中所述碱金属的卤化物，优选所述氯化钠的浓度为1至lOOOmM，优选10至500mM，更优选50至250mM，最优选100-200mM。[0084]透析优选在4°C至37°C的温度下进行，并且其中优选所述透析在4至24小时内进行。[0085]在进一步优选的实施方式中，所述从所述溶液III中分离所述纳米球是通过尺寸排阻色谱法或阴离子交换色谱法，优选通过尺寸排阻色谱法来实现的。[0086]在进一步优选的实施方式中，所述纯化所述纳米球是通过尺寸排阻色谱法或阴离子交换色谱法，优选通过尺寸排阻色谱法来实现的。[0087]再一方面，本发明提供制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的（i人SEC14样蛋白和（ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成；其中所述方法包括以下步骤：（a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为ΙμΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6至9,并且其中优选所述溶液I包含盐，其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;b在溶液II中提供所述SEC14样蛋白的同源配体，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的浓度为5μΜ至500mM，并且其中所述溶液II的溶剂为水溶性溶剂；（c通过组合所述溶液I和所述溶液II以产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔），并且其中所述溶液III中所述水溶性溶剂的体积为0.5-8%体积体积）；（d使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体形成由所述SEC14样蛋白之一和所述SEC14样蛋白的所述同源配体之一组成的单体复合物；（e从所述溶液III中分离所述单体复合物；（f任选地纯化所述单体复合物；（g产生水溶液IV，其中所述溶液IV包含所述单体复合物，并且其中所述溶液IV中所述单体复合物的浓度为5mgml至50mgml;并且其中所述溶液IV的pH为6至9,并且其中优选所述溶液IV包含盐，其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;⑹使所述单体复合物形成所述纳米球的晶体。[0088]本发明方法的进一步优选实施方式包括本发明纳米球的优选和非常优选的实施方式。[0089]在另一个优选的实施方式中，所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为0.ImM至ImM，并且进一步优选所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为0.25mM至0.75mM。[0090]在进一步优选的实施方式中，所述溶液I的pH为7至8。优选所述溶液I包含盐，其中所述盐的浓度为IOmM至500mM。进一步优选的是，所述盐的浓度为30mM至350mM，并且进一步优选所述盐的浓度为IOOmM至250mM。[0091]在进一步优选的实施方式中，所述盐选自一价、二价、三价或四价无机或有机盐，并且其中进一步优选所述盐选自二价、三价或四价无机或有机盐，并且其中再进一步优选所述盐包含选自HP〇42_、S〇42_、酒石酸根、丙二酸根、D-肌醇1，4,5_三磷酸根和D-肌醇1，3,4，5-四（磷酸钾盐的二价、三价或四价阴离子。[0092]在另一个优选的实施方式中，所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的所述浓度为30μΜ至300mM，进一步优选所述溶液I中SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度为200μΜ至200mM〇[0093]所述溶液II的溶剂是水溶性溶剂。在本发明的范围内，用于溶液II的水溶性溶剂可以包含少量，即至多10%vV的水，尽管通常且优选所述水溶性溶剂不包含任何另外量的水，而不是由制造商供应时通常包含在所述水溶性溶剂中的少量水。更优选地，所述水溶性溶剂不包含超过8%vv，优选超过7%vv，进一步优选超过5%vv的水。[0094]在本发明的一个优选实施方式中，所述水溶性溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇、丁醇、二甲基亚砜DMSO、四氢呋喃THF、二噁烷、甲基戊二醇和甘油;进一步优选所述水溶性溶剂选自乙醇、异丙醇和二甲基亚砜DMSO。[0095]在本发明的一个优选实施方式中，所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为3:1至1:3摩尔摩尔），并且优选所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为2:1至1:2摩尔摩尔）。[0096]在本发明的另一个优选实施方式中，所述溶液III中所述水溶性溶剂的体积为1-5%体积体积），优选所述溶液III中所述水溶性溶剂的体积为2-4%体积体积）。[0097]在本发明的另一个优选的实施方式中，所述使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体形成所述单体复合物是通过将所述溶液III保持在4-37Γ，优选在室温下放置1小时至24小时，优选12至24小时来实现的。[0098]在本发明的另一个优选实施方式中，所述从所述溶液III中分离所述单体复合物是通过尺寸排阻色谱法或阴离子交换色谱法，优选通过尺寸排阻色谱法来实现的。[0099]在本发明的另一个优选实施方式中，所述纯化所述单体复合物是通过尺寸排阻色谱法或阴离子交换色谱法，优选通过尺寸排阻色谱法来实现的。[0100]在本发明的另一个优选实施方式中，所述溶液IV中所述单体复合物的浓度为1〇11^1111至4〇11^1111，并且优选所述溶液1¥中所述单体复合物的浓度为1〇11^1111至3〇11^1111，并且进一步优选所述溶液IV中所述单体复合物的浓度为12mgml至22mgml。优选地，所述溶液IV的pH为7至8，更优选所述溶液IV的pH为7.2至7.8。[0101]在另一个优选的实施方式中，所述溶液IV包含盐，其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;并且优选所述盐选自一价、二价、三价或四价无机盐或有机盐。更优选地，所述盐选自二价、三价或四价无机盐或有机盐，并且再进一步优选所述盐包含选自HP〇42_、S042_、酒石酸根、丙二酸根、D-肌醇1，4,5-三磷酸根和D-肌醇1，3,4,5-四（磷酸钾盐的二价、三价或四价阴离子。[0102]在另一个优选的实施方式中，所述溶液IV包含PEG，其中所述PEG的浓度为1%νν至30%vv;并且其中优选所述PEG的重均分子量为200至30000，进一步优选200至20000，包括PEG200、400、800、2000、3350、4000、8000、12000、16000。[0103]当包含在所述溶液IV中时，所述盐和所述PEG代表两性沉淀剂，对于本发明的所述溶液IV是有益的和优选的。本发明优选的两性沉淀剂和两性沉淀剂的混合物是本领域技术人员已知的。其它两性沉淀剂和两性沉淀剂的混合物包含在本发明内。[0104]在另一个优选的实施方式中，所述使所述单体复合物形成所述纳米球的晶体在4°C_37°C的恒定温度下进行，其中所述恒定温度优选为10°C-20°C，并且其中所述温度进一步优选为16°C-19°C。[0105]在另一方面，本发明提供制备如本文所述的本发明纳米球的方法，其中所述纳米球包含相等数目的⑴人SEC14样蛋白和（ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成，其中优选所述相等数目为3至60,其中所述方法包括以下步骤：（a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为ΙμΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6至9;⑹在水溶液II中提供所述SEC14样蛋白的同源配体，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的浓度为5μΜ至500mM;并且其中所述溶液II包含洗涤剂；（c通过组合所述溶液I和所述溶液II以产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔）；（d从所述溶液III中去除所述洗涤剂，其中从所述溶液III去除所述洗涤剂使所述SEC14-样蛋白和所述SEC14-样蛋白的所述同源配体形成由所述SEC14样蛋白之一和所述SEC14样蛋白的所述同源配体之一组成的单体复合物；（e从所述溶液III中分离所述单体复合物；（f任选地纯化所述单体复合物；（g产生水溶液IV，其中所述溶液IV包含所述单体复合物，并且其中所述溶液IV中的所述单体复合物的浓度为5mgml至50mgml，并且其中所述溶液IV的pH为6至9，并且其中优选所述溶液IV包含盐，并且其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;Gi使所述单体复合物形成所述纳米球的晶体。本发明方法的进一步优选实施方式包括本发明纳米球的优选和非常优选的实施方式。特别地，在一个非常优选的实施方式中，所述相等数目是3的倍数，并且其中优选所述数目是3至60，并且其中所述人SEC14样蛋白选自（aα-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ;⑹细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP;cClavesinlCLVSl;dClavesin2CLVS2;和eα-生育酚转移蛋白样TTPAL。[0106]在另一方面，本发明提供制备如本文所述的本发明纳米球的方法，其中所述纳米球包含相等数目的⑴人SEC14样蛋白和（ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成，其中优选所述相等数目是9至60,其中所述方法包括以下步骤：（a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为ΙμΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6至9;⑹在水溶液II中提供所述SEC14样蛋白的同源配体，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的浓度为5μΜ至500mM;并且其中所述溶液II包含洗涤剂；（c通过组合所述溶液I和所述溶液II以产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔）；（d从所述溶液III中去除所述洗涤剂，其中从所述溶液III去除所述洗涤剂使所述SEC14-样蛋白和所述SEC14-样蛋白的所述同源配体形成由所述SEC14样蛋白之一和所述SEC14样蛋白的所述同源配体之一组成的单体复合物；（e从所述溶液III中分离所述单体复合物；（f任选地纯化所述单体复合物；（g产生水溶液IV，其中所述溶液IV包含所述单体复合物，并且其中所述溶液IV中的所述单体复合物的浓度为5mgml至50mgml，并且其中所述溶液IV的pH为6至9，并且其中优选所述溶液IV包含盐，并且其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;Gi使所述单体复合物形成所述纳米球的晶体。本发明方法的进一步优选实施方式包括本发明纳米球的优选和非常优选的实施方式。特别地，在一个非常优选的实施方式中，所述相等数目是3的倍数，并且其中优选所述数目是3至60，并且其中所述人SEC14样蛋白选自（aα-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ;⑹细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP;cClavesinlCLVSl;dClavesin2CLVS2;和eα-生育酚转移蛋白样TTPAL。[0107]本发明方法的进一步优选实施方式包括本发明纳米球的优选和非常优选的实施方式。[0108]在另一个优选的实施方式中，所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为0.ImM至ImM，并且进一步优选所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为0.25mM至0.75mM。在另一个优选的实施方式中，所述溶液I的pH为7至8。[0109]在另一个优选的实施方式中，所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的所述浓度为30μΜ至300mM，进一步优选所述溶液I中所述SEC14样蛋白的同源配体的浓度为200μΜ至200mM〇[0110]对于本发明的方法，所述溶液II包含洗涤剂。洗涤剂用于溶解所述溶液II中所述SEC14样蛋白的同源配体。在本发明的一个优选实施方式中，所述洗涤剂选自非离子型洗涤剂或阴离子型洗涤剂。优选所述非离子型洗涤剂选自辛基β-D-葡糖苷、壬基β-D-葡糖苷、癸基β-D-葡糖苷、壬基β-D-麦芽糖苷、癸基β-D-麦芽糖苷、i^一烷基β-D-麦芽糖苷、十二烷基β-D-麦芽糖苷、.NonidetP40、聚乙二醇200。优选所述阴离子洗涤剂选自胆酸钠、脱氧胆酸钠、甘胆酸钠、脱氧甘胆酸钠和牛磺胆酸钠。[0111]在进一步优选的实施方式中，所述非离子型洗涤剂选自辛基β-D-葡糖苷、壬基β-D-葡糖苷、癸基β-D-葡糖苷、壬基β-D-麦芽糖苷、癸基β-D-麦芽糖苷、i^一烷基β-D-麦芽糖苷、十二烷基β-D-麦芽糖苷、、NonidetP40、聚乙二醇200。[0112]在另一个非常优选的实施方式中，所述阴离子洗涤剂选自胆酸钠、脱氧胆酸钠、甘胆酸钠、脱氧甘胆酸钠和牛磺胆酸钠。在一个非常优选的实施方式中，所述洗涤剂是阴离子洗涤剂，其中所述阴离子洗涤剂是胆酸钠。[0113]所述溶液II中使用的所述洗涤剂的浓度可以由本领域技术人员确定，并且基于本领域技术人员的知识，由于为了溶解所述溶液II中所述SEC14样蛋白的同源配体，浓度取决于所用洗涤剂的性质。通常且优选所述溶液II中所述洗涤剂的浓度高于所述洗涤剂、通常且优选所述非离子洗涤剂或所述阴离子洗涤剂的临界胶束浓度CMC。通常且优选所述洗涤剂通常且优选非离子型洗涤剂或所述阴离子型洗涤剂的临界胶束浓度CMC等于或高于0.5mM，并且其中进一步优选所述非离子型洗涤剂或所述阴离子洗涤剂的临界胶束浓度CMC等于或高于10mM。[0114]在进一步优选的实施方式中，所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为3:1至1:3摩尔摩尔），并且优选所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为2:1至1:2摩尔摩尔）。[0115]在另一个优选的实施方式中，所述从所述溶液III中去除所述洗涤剂通过透析进行;并且其中优选通过透析从所述溶液III中去除所述洗涤剂是跨膜进行的，其中优选所述膜包含截留分子量为l_25kD，优选5-20kD，并且还更优选10-15kD。透析优选用第一缓冲液进行，其中所述第一缓冲液包含碱金属的卤化物，其中优选所述碱金属的卤化物为氯化钾或氯化钠，并且其中优选所述碱金属的卤化物为氯化钠，其中优选所述第一缓冲液中所述碱金属的卤化物，优选所述氯化钠的浓度为1至lOOOmM，优选10至500mM，更优选50至250mM，最优选100-200mM。[0116]透析优选在4°C至37°C的温度下进行，并且其中优选所述透析在4至24小时内进行。[0117]在进一步优选的实施方式中，所述从所述溶液III中分离所述纳米球是通过尺寸排阻色谱法或阴离子交换色谱法，优选通过尺寸排阻色谱法来实现的。[0118]在进一步优选的实施方式中，所述纯化所述纳米球是通过尺寸排阻色谱法或阴离子交换色谱法，优选通过尺寸排阻色谱法来实现的。[0119]在本发明的另一个优选实施方式中，所述溶液IV中所述单体复合物的浓度为1〇11^1111至4〇11^1111，并且优选所述溶液1¥中所述单体复合物的浓度为1〇11^1111至3〇11^1111，并且进一步优选所述溶液IV中所述单体复合物的浓度为12mgml至22mgml。优选地，所述溶液IV的pH为7至8，更优选所述溶液IV的pH为7.2至7.8。[0120]在另一个优选的实施方式中，所述溶液IV包含盐，其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;并且优选所述盐选自一价、二价、三价或四价无机盐或有机盐。更优选地，所述盐选自二价、三价或四价无机盐或有机盐，并且再进一步优选所述盐包含选自HP〇42_、S042_、酒石酸根、丙二酸根、D-肌醇1，4,5-三磷酸根和D-肌醇1，3,4,5-四（磷酸钾盐的二价、三价或四价阴离子。[0121]在另一个优选的实施方式中，所述溶液IV包含PEG，其中所述PEG的浓度为1%νν至30%vv;并且其中优选所述PEG的重均分子量为200至30000，进一步优选200至20000，包括PEG200、400、800、2000、3350、4000、8000、12000、16000。[0122]当包含在所述溶液IV中时，所述盐和所述PEG代表两性沉淀剂，对于本发明的所述溶液IV是有益的和优选的。本发明优选的两性沉淀剂和两性沉淀剂的混合物是本领域技术人员已知的。其它两性沉淀剂和两性沉淀剂的混合物包含在本发明内。[0123]在另一个优选的实施方式中，所述使所述单体复合物形成所述纳米球的晶体在4°C_37°C的恒定温度下进行，其中所述恒定温度优选为10°C-20°C，并且其中所述温度进一步优选为16°C-19°C。[0124]通常且优选地，所述SEC14样蛋白通过在宿主中异源表达所述SEC14样蛋白来获得，其中优选所述宿主是大肠杆菌，并且其中任选地所述异源表达的SEC14样蛋白优选通过亲和色谱，进一步优选通过Ni-NTA树脂上的亲和色谱来纯化。[0125]再一方面，本发明提供了药物组合物，其包含a本发明的纳米球;和⑹药学上可接受的载体。[0126]在另一方面，本发明提供了根据本发明的纳米球或药物组合物作为药物的用途。[0127]再一方面，本发明提供了本发明的纳米球或药物组合物在治疗或预防、优选治疗具有维生素E缺乏症的共济失调AVED、肌肉营养不良、低脂血症、低脂蛋白血症、血脂异常、人类不育症、伤口愈合受损或炎性疾病的方法中的用途，其中优选所述炎性疾病为关节炎。优选所述治疗或预防的方法用于人。进一步优选所述预防用于老年人。[0128]在本发明进一步优选的实施方式中，根据本发明的所述纳米球或所述药物组合物用于治疗或预防，优选治疗具有维生素E缺乏症的共济失调AVED、肌肉营养不良、低脂血症、低脂蛋白血症、血脂异常、人类不育症、伤口愈合受损或炎性疾病，其中优选所述炎性疾病为关节炎。[0129]在另一方面，本发明提供根据本发明的纳米球或药物组合物在治疗或预防通过增加人体内维生素E水平而缓解的疾病的方法中的用途，其中优选所述疾病是具有维生素E缺乏症的共济失调AVED、肌肉萎缩症、低血脂症、低脂蛋白血症、血脂异常、人类不育症、伤口愈合受损或炎性疾病，并且其中进一步优选所述炎性疾病为关节炎，并且其中所述人SEC14样蛋白选自α-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ。[0130]根据本发明的治疗和或预防伤口愈合优选被认为有利于在手术后增加瘢痕疙瘩形成。[0131]在另一方面，本发明提供根据本发明的纳米球或药物组合物在治疗或预防通过增加人体内维生素A水平而缓解的疾病的方法中的用途，其中优选所述疾病是眼疾病或人类不育症，并且其中所述人SEC-14样蛋白是细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP。[0132]根据本发明的治疗和或预防人类不育症，并因此特别是治疗和或预防一对夫妇不能怀孕，据信有利于减少或消除女性子宫功能或精子计数或精子活力中的任一个损伤。[0133]在另一方面，本发明提供根据本发明的纳米球或药物组合物在制备用于治疗或预防，优选治疗具有维生素E缺乏症的共济失调AVED、肌营养不良、低脂血症、低脂蛋白血症、血脂异常、人类不育症、伤口愈合受损或炎性疾病的药物中的用途，其中优选所述炎性疾病为关节炎。[0134]在另一方面，本发明提供了根据本发明的纳米球或药物组合物在治疗或预防，优选治疗具有维生素E缺乏症的共济失调AVED、肌肉营养不良、低脂血症、低脂蛋白血症、血脂异常、人类不育症、伤口愈合受损或炎性疾病中的用途，其中优选所述炎性疾病为关节炎。[0135]在另一方面，本发明提供治疗和或预防，优选治疗具有维生素E缺乏症的共济失调AVED、肌肉营养不良、低血脂症、低脂蛋白血症、血脂异常、人类不育症、伤口愈合受损或炎性疾病的方法，其中优选所述炎性疾病是关节炎，所述方法包括对所述人施用有效量的根据本发明的纳米球或药物组合物。[0136]在另一方面，本发明提供根据本发明的纳米球或药物组合物在治疗或预防通过增加人体内维生素A水平而缓解的疾病的方法中的用途，其中优选所述疾病是眼疾病，并且其中所述人SECl4样蛋白是细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP。[0137]在另一方面，本发明提供可通过本发明的任一发明方法获得的纳米球，其中所述纳米球包含相等数目的：（i人SEC14样蛋白和ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成，其中优选所述相等数目为3至60。在另一个非常优选的实施方式中，所述相等数目为3的倍数，并且其中优选所述数目为3至60,以及其中所述人SEC14样蛋白选自（aα-生育酚转运蛋白（α-ΤΤΡ;⑹细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP;cClavesinlCLVSl;⑹Clavesin2CLVS2;和eα-生育酚转移蛋白样TTPAL。[0138]在另一方面，本发明提供可通过本发明的任一发明方法获得的纳米球，其中所述纳米球包含相等数目的：（i人SEC14样蛋白和ii所述SEC14样蛋白的同源配体，优选由其组成，其中优选所述相等数目为3至60。在另一个非常优选的实施方式中，所述相等数目为3的倍数，并且其中优选所述数目为3至60,以及其中所述人SEC14样蛋白选自（aα-生育酚转运蛋白（α-ΤΤΡ;⑹细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP;cClavesinlCLVSl;⑹Clavesin2CLVS2;和eα-生育酚转移蛋白样TTPAL。[0139]实施例[0140]实施例1[0141]单体α-ΤΤΡ的表达和纯化[0142]N-末端His6-标记的α-ΤΤΡ表达构建体通过将来源于人cDNA文库的PCR产物克隆至IJpET-28a载体的NdeI和XhoI位点中（Stratagene，CA.USA，使用引物5’_GGGAATTCGCAGAGGCGC-GATCCCAG-3’（SEQIDN0:1和5’-CCGTCATTGAATGCTCTCAGAAATGC-3’SEQIDN0:2来制备。蛋白质表达在T7启动子的控制下在大肠杆菌菌株BL21DE3中进行。转化的细菌在37°C下生长至0.8的光密度OD6qq，并在30°C下用330mM异丙基-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导过夜。通过在7300g和4°C下离心30分钟来收获细菌。将从IL培养基获得的细菌颗粒重新悬浮于25ml裂解缓冲液20mMTris，pH8.0，100mMNaCl，10mM咪唑，0.5vvTritonX-100和ImM苯基甲基磺酰氟）中。收集的细胞在法国压力室中被破坏两次。将溶胞产物在39000g和4°C下离心40分钟。将澄清的上清液通过含有12mlTALONSuperflowClontechLaboratories，CA，USA的柱子。通过用清洗缓冲液（20mMTris，IOOmMNaCl，IOmM咪唑，pH8.0冲洗柱子以去除非特异性结合的蛋白质，直到在280nm处的UV吸收恢复了基线水平。用洗脱缓冲液20mMTris，100mMNaCl，150mM咪唑，pH8.0洗脱蛋白质。使用凝血酶（GEHealthcare，LittleChalfont，UK在洗脱缓冲液（20mMTris，IOOmMNaCl，150mM咪唑，pH8.0中于4°C过夜裂解（His6-标签。合并蛋白洗脱液并使用VivaspinSatorius，Goettingen，DE离心浓缩器MWCOIOkDa浓缩至2.5mgml以防止ap〇-a-TTP的聚集。[0143]实施例2[0144]由单体α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ和由包含α-ΤΤΡ三聚体的α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球组成的同源配体-复合物的混合物的制备[0145]α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ同源配体-复合物的形成是通过在洗涤剂溶解的α-生育酚存在下透析新鲜制备的apo-α-ΤΤΡ来实现的。简而言之，将Imga-Tol的微滴用40.9mg固体胆酸钠覆盖，随后将其悬浮于Iml洗脱缓冲液（20mMTris，IOOmMNaCl，150mM咪唑，pH8.0中。将该悬浮液进行超声波处理直至所有物质溶解成澄清溶液。Ap〇-a-TTPllml，2.5mgml与生育酚-胆酸钠溶液以9:1vv比例互补并转移至具有MffCO范围12-14kDa的CelluSepT3透析管状膜MembranesFiltrationProducts，TX，USA中。在4°C下，分别用3μ1缓冲液20mMTris，100mMNaCl，pH8.0分两步进行透析6小时。将透析液（12ml通过补充有TritonX-100最终浓度为0.01%vv的MillexGP0·22μπι过滤器EMDMilipore，MA，USA过滤，减少至2ml并通过制备型尺寸排阻色谱法分离。合并对应于单体α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ同源配体-复合物的大小的级分并使用Vivaspin浓缩器MWCOIOkDa;Satorius，Goettingen，DE浓缩至20mgml，并直接用于结晶。合并对应于包含α-ΤΤΡ三聚体的α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球的大小的级分并使用Vivaspin浓缩器MffCO30kDa浓缩至10mgml，并通过分析型大小排阻色谱SEC重新纯化。[0146]实施例3[0147]包含α-ΤΤΡ三聚体的α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球的表征[0148]Α.尺寸排阻色谱法[0149]α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球的制备型和分析型SEC分别在HiLoad1660Supersose75制备级和Superose610300柱GEHealthcare，LittleChalfont，UK上进行，二者都连接到AEKTAPurifier色谱系统GEHealthcare，英国LittleChalfont。运行在SEC缓冲液IOmMTris，100mMNaCl，pH8.0中在6°C下以0.5分析型）至1.5ml分钟（制备型）的流速进行。SEC柱使用市售蛋白质校准试剂盒GEHealthcare，LittleChalfont，UK校准（图1〇[0150]B.负染透射电子显微镜[0151]将浓度为300ygml的α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球样品吸附1分钟至parlodion碳涂覆的铜网格，所述网格先前通过辉光放电在低压下在空气中呈现亲水。吸附后，网格用三滴双蒸水洗涤并用两滴〇.75%甲酸铀酰染色。电子显微照片用在80kV下操作并配备有MoradaC⑶照相机软成像系统）的PhilipsCM12透射电子显微镜记录。用ImageJ图像处理程序VI.49〇NIH，MD，USA进行图像分析图2。[0152]C.蛋白质印迹[0153]简而言之，在12%PAGE凝胶上进行SDS-PAGE。在印迹硝酸纤维素膜之前，将凝胶在转移缓冲液25mMTris，192mM甘氨酸，20%甲醇，pH8.3中温育20分钟。使用半干印迹装置Bio-RadLaboratories，CA，USA以130mA进行印迹50分钟。为了分析市售的抗α-ΤΤΡαTTP抗体[C2C3]C-term，GeneTexInc.，CA，USA的一抗，采用来自LI-COR的IRDye二抗以用IRDye800CW或IRDye680RD进行可视化，并在LI-COR奥德赛红外系统（LI-C0RBiosystems，NE，USA上进行扫描（图3。[0154]D.天然聚丙烯酰胺凝胶电泳[0155]使用预制的NativePAGENovex4-16%Bis_Tris蛋白凝胶（LifeTechnologies，CA，USA进行天然PAGE。将每种蛋白质样品（20μ1，0.5mgml与等体积的天然PAGE加样缓冲液（62mMTris，25%甘油，1%溴酚蓝，pH6.8混合。凝胶在4°C在运行缓冲液（50mMTricine，50mMBisTris，pH8.0中在160V下运行30分钟，然后在180V下直至溴酸蓝标记达到凝胶末端。通过用SYPRO红宝石蛋白质凝胶染色剂LifeTechnologies，CA，USA染色来实现蛋白质可视化图4。[0156]E.动态光散射[0157]通过动态光散射DLS分析从分析型SECIOmMTris，IOOmMNaCl，pH8.0获得的新合并的：1_1^?-€[-1'01纳米球级分（浓度范围0·1-0·2mgml。使用UVetteEppendorf，Hamburg，DE在Icm路径长度的DynaPro分子尺寸仪器蛋白质溶液上测定每个样品的尺寸分布图。每个数据组至少收集5分钟，包含至少100次单次测量。从DLS—式三份测量获得17·6±3·8nm的流体动力学半径。[0158]F·热力学分析[0159]使用具有Ϊ白耳帖PFD-350S温度控制器的JascoJ-175Spectropolarimeter来测量apo-α-ΤΤΡ、单体α-ΤΤΡ和α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球的⑶谱和温度依赖性蛋白展开。为此，使用Imm路径长度的石英池具有ΙΟΟμΙ样品）并且蛋白质浓度范围为0.1-0.5mgml。响应设置为Is，带宽为5nm。在CD光谱的结果之后，对于温度依赖性蛋白展开实验，将波长调整到222nm。对于单体a-TTP，温度以2K分钟_1的速率从20°C增加到80°C，对于a-TTP-a-Tol纳米球，从20tC到100°C，增量均为0.5K。转变温度Tm由展开曲线的一阶导数计算图5。[0160]实施例4[0161]包含a-TTP三聚体的a-TTP-a-Tol纳米球的结晶和结构测定[0162]通过悬挂或坐式蒸汽扩散在18°C下使用在IOOmMHepes钠pH7.5中范围为10至15%PEG-4000、100至175mM硫酸铵的储库溶液来生长晶体。使用新鲜制备的单体a-TTP同源配体-复合物的浓度范围为12_22mgml。在两周内，观察到完全还原的a-TTP-a-Tol纳米球的最高质量晶体蛋白质相对于储库的滴度比在31至21vv的范围内。晶体具有立方体形状，边缘长度在20至80μπι的范围内。两个月后收集完全氧化的a-TTP-a-Tol纳米球的同形晶体。在两个步骤中加入甘油至20%vv的最终浓度后，将所有晶体在氮气中快速冷冻。使用DectrisPilatus2MCCD检测器（DECTRISLtd.，Baden，Switzerland在100K下在瑞士光源（SLS同步加速器束线X06DAPSIVilligen上收集衍射数据。所有数据都用XDS进行索引、整合和缩放（KabschW.;ActaCrystallographicaSectionD:BiologicalCrystallography.201066:125-132C3Phaser-MR用于计算单体a-TTPPDBID:10P的截短结构模型残基47-275作为搜索结构的初始阶段。还原的a-TTP-a-Tol纳米球和氧化的a-TTP-a-Tol纳米球的原子模型均通过使用⑶OT的手动模型建立的迭代循环来精制EmsleyP,LohkampB,ScottWG,CowtanK.；ActaCrystallographicaSectionD：BiologicalCrystallography.201066:486-501以及使用Phenix程序套件（AdamsPD等；ActaCrystallographicaSectionD:BiologicalCrystallography.201066:213-221进行限制性精制。两种结构的坐标和结构因子已存入RCSB蛋白质数据库，ID编码为®Ι6和OTLU。[0163]实施例5[0164]导致形成包含α-ΤΤΡ三聚体的α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球的蛋白质-蛋白质相互作用的表征[0165]α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球仅在从单体α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ同源配体-复合物的单分散溶液开始时结晶。纳米球包含24个原子，各结合一个α-Tol，组装成一个让人想起病毒衣壳的球状壳。α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球的X射线结构模型对于氧化还原态都具有16.8nm的外径，其大小与来自可溶性制剂的α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ颗粒的测量值一致。该结构的进一步特征在于直径为8.Inm的明显空心腔。仔细检查颗粒的X射线结构模型揭示了扭曲的蜂窝立方体（点对称基团〇，Schoenflies符号）的拓扑结构，以每个蛋白质单体的中心为顶点，并通过蛋白质-蛋白质接触界面连接它们。根据它的点基团，纳米球的对称操作仅在三个C4、四个C3和六个C2轴周围进行适当的旋转（图6。[0166]每个α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ单体都与四个第一邻居接触。有两个这样的邻居，它形成了由C3对称轴穿过的八个三元界面中的一个，而后两个邻居则参与构建由C4轴之一穿过的六个四元界面中的一个。四聚单位由第二个相邻单位完成，无论如何不直接接触。十二个菱形面完成纳米笼，每个笼由C2对称轴之一穿过。这种界面的两个不对称边缘对应于三聚体和四聚体组装的边缘。每个单体都涉及这两个界面。从α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球中氧化的一个二硫桥将两个α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ单元的C80通过菱形六面体通道交联。因此，氧化的α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球总共包含12个共价结合所有三聚体亚基的S-S桥。氧化伴随着局部的螺旋片段展开氨基酸65-79。它还诱导相邻C-末端氨基酸275-278的结构化为规则的α-螺旋基序。在α-ΤΤΡ-α-Tol纳米球的还原和氧化形式之间没有观察到其它显著的结构差异。[0167]高度包装的三聚体界面由几种蛋白质-蛋白质接触构成。每个单元通过螺旋片段49-56、57-64环和螺旋片段65-79的第一轮，以及残基R151与下一个单元相互作用。配偶体蛋白与螺旋片段65-79中的氨基酸67-74以及C-末端残基氨基酸275-278相互作用（图7。[0168]三聚体界面的特征在于疏水填充，并通过盐桥进一步稳定。这些静电相互作用主要集中在界面的外部，其中一个蛋白质上的残基R57和R151与朝向单元的C-末端相互作用。残基D64和Κ71构成一个额外的盐桥，定位成更靠近界面核心。在正中心，三个W67残基通过范德华力叠加以T形彼此相互作用。经过我们观察，这是整个α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球中涉及超过两种蛋白质的唯一接触点。[0169]W67与L63、F61和L56—起构成一个经典的“热点”，其约占界面整体结合自由能的四分之三（77%ClacksonT，WellsJA.Science1995267:383-386。[0170]实施例6[0171]导致α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球的三聚体形式的蛋白质-蛋白质相互作用基序内的保守序列图案的鉴定[0172]α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ单体与α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球原体的3-D叠加证明，在单体α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ中，三聚体界面由于N末端片段氨基酸1-47的折叠而不暴露于溶剂。SEC14样家族的不同成员的已知结构的比较证明N-末端片段1-47并不总是通过X射线散射而完全检测到，表明这部分蛋白质结构较少并且更倾向于重新折叠（ShaBI,PhillipsSE，BankaitisVA，LuoM.,Nature.1998391：506-10；MeierR,TomizakiT,Schulze-BrieseC,BaumannU,StockerA.,JMolBiol2003331：725-734；HeX,LobsigerJ,StockerA.,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences2009106:18545-18550;ChristenM等，Journalofstructuralbiology2015190:261-270。得出的结论是，形成三聚体组装需要通过置换α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球外层空间中α-ΤΤΡ的N末端尾部来暴露三聚体基序。因此，在纳米球上的结构中未检测到1-47片段，可能是由于构象紊乱。[0173]通过使用PSIPREDweb服务分析二级结构表明α-ΤΤΡ氨基酸47-90和CRALBP氨基酸91-123的相应螺旋转角螺旋基序高度相似。在该基序内确定了主要疏水性残基的特征序列图案，其导致α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球内的三聚体形式（图8。通过Multalinweb服务Corpet，F.,NucleicAcidsRes.198816:10881-10890，a-TTPaa47-90的N-末端片段与相关SEC14-样蛋白的相应片段的一级序列比对揭示了螺旋片段49-56、57-64环和螺旋片段65-79图8的第一轮内残基的高度保守性。[0174]用于MULTALIN比对的人源序列为：spIP49638ITTPA_HUMANa-生育酚转移蛋白，spQ9BTX7ITTPAL_HUMANa-生育酚转移蛋白样、spIQ8IUQ0ICLVS1_HUMANClavesin-I，spQ5SYC11CLVS2_HUMANClavesin-2和spIP122711RLBP1_HUMAN视黄醛结合蛋白I图9。[0175]实施例7[0176]单体CRALBP的表达和纯化[0177]人RLBPlcDNA获自DeutschesRessourcenzentrumfiirGenomforschungGmbHJRAUp969D1020D。通过克隆到pET-28a载体（Stratagene的NdeI和XhoI位点中来构建N-末端His6标记的CRALBP过表达载体。将N-末端His6标记的构建体转化到大肠杆菌BL21DE3Invitrogen中。将细胞在37°C下在含有30ygmL卡那霉素的120mLLB培养基中搅拌培养过夜。过夜培养物用于接种6LLB培养基（30ygmL卡那霉素）。培养物在20°C生长至0D600为0.7,然后用ImM异丙基-硫代吡喃半乳糖苷诱导16小时。通过5000g离心45分钟以收集细胞并将其重悬于250mL冰冷的裂解缓冲液20mM咪唑；IOOmMNaCl;20mMTris-HCl，pH7.4;1重量体积％1^切11乂-100。通过超声破碎细胞20分钟，将溶胞产物以2000^离心35分钟以去除碎片。根据制造商的说明书通过在IOmLNi-NTASUPERFLOWQiagen上的亲和色谱从上清液中纯化His6标记的CRALBP。简而言之，将裂解物加载到预先用裂解缓冲液平衡的柱上，用200mL裂解缓冲液洗涤，并在35mL洗脱缓冲液20mMTris-HCl，pH7.4;200mM咪唑；IOOmMNaCl。通过SDSPAGE判断，通常产量为35-40mg纯CRALBP。合并蛋白质洗脱液并使用VivaspinSatorius，Goettingen，DE离心浓缩器MffCOIOkDa浓缩至10mgml以防止apo-CRALBP聚集。[0178]实施例8[0179]由单体CRALBP-11-顺式-视黄醛和CRALBP-11-顺式-视黄醛同源低聚物的同源配体-复合物组成的混合物的制备[0180]除非另有规定，否则所有涉及11-顺式-视黄醛的程序均在4°C暗红光40-W红宝石灯泡下进行。通过在胆酸钠55.7mM存在下添加浓度为16.7mM的配体并将混合物在4°C下温育15分钟，将CRALBP结合至11-顺式-视黄醛相对于CRALBP为1.5倍摩尔过量）。可选地，通过在乙醇中添加浓度为16.7mM的配体并且在4°C下温育混合物15分钟或至多45分钟，将CRALBP结合至11-顺式-视黄醛相对于CRALBP为1.5倍摩尔过量）。通过加入20单位凝血酶蛋白酶GEHealthcare裂解His6-标签并随后在4°C下温育过夜。然后将蛋白质溶液通过Ni-NTA柱以去除未裂解的材料。Centriprep-10Millipore将流量浓缩至20mgmL。在Superose6SE^i^GEHealthcare上分离CRALBP的同源配体-复合物。[0181]实施例9[0182]由单体CRALBP-9-顺式-视黄醛和CRALBP-9-顺式-视黄醛同源低聚物的同源配体-复合物组成的混合物的制备[0183]除非另有规定，否则所有涉及9-顺式-视黄醛的程序均在4°C暗红光40-W红宝石灯泡下进行。通过在胆酸钠55.7mM存在下添加浓度为16.7mM的配体并在4°C下温育混合物15分钟，将CRALBP结合9-顺式-视黄醛相对于CRALBP为1.5倍摩尔过量）。可选地，通过在乙醇中添加浓度为16.7mM的配体并将混合物在4°C下温育15分钟，将CRALBP结合到9-顺式-视黄醛相对于CRALBP为1.5倍摩尔过量）。通过20单位凝血酶蛋白酶GEHealthcare在4°C下裂解His6_标签过夜，并将蛋白质溶液通过Ni-NTA柱。Centriprep-10Millipore将流量浓缩至20mgmL。在Superose6IncreaseSEC柱（GEHealthcare上分离CRALBP的同源配体-复合物的混合物（图11A、图11B、图11C。[0184]实施例10[0185]CRALBP-11-顺式-视黄醛同源低聚物复合物的表征[0186]A.尺寸排阻色谱法[0187]在HiLoad1660Supersose75制备级和Superose6SEC柱（GEHealthcare，LittleChalfont，UK上分别进行CRALBP-11-顺式-视黄醛同源低聚物的制备型和分析型SEC，二者都连接到AEKTAPurifier色谱系统（GEHealthcare，英国LittleChalfont。运行在SEC缓冲液20mMTris，pH7.4;IOOmMNaCl中在6°C下以0.5分析型）至1.5ml分钟制备型）的流速进行。两个SEC色谱柱均使用市售蛋白质校准试剂盒GEHealthcare，LittleChalfont，UK进行校准。将代表单体CRALBP-11-顺式-视黄醛和同源低聚物CRALBP-11-顺式-视黄醛的峰级分合并并通过Centriprep-10Millipore浓缩至20mgmL。[0188]B.负染透射电子显微镜[0189]将浓度为0.3mgml的CRALBP-11-顺式-视黄醛同源低聚物样品吸附1分钟至parlodion碳涂覆的铜网格，所述网格先前通过辉光放电在低压下在空气中呈现亲水。吸附后，网格用三滴双蒸水洗涤并用两滴0.75%甲酸铀酰染色。电子显微照片用在SOkV下操作并配备有MoradaCXD照相机软成像系统）的PhilipsCM12透射电子显微镜记录。用ImageJ图像处理程序Vl.490NIH，MD，USA进行图像分析图10。[0190]实施例11[0191]CRALBP-9-顺式-视黄醛同源低聚物复合物的表征[0192]A.尺寸排阻色谱法[0193]在HiLoad1660Supersose75制备级和Superose6IncreaseSEC柱（GEHealthcare，LittleChalfont，UK上分别进行CRALBP-9-顺式-视黄醛同源低聚物的制备型和分析型SEC，二者都连接到AEKTAPurifier色谱系统（GEHealthcare，LittleChalfont，UK。运行在SEC缓冲液20mMTris，pH7·4;100mMNaCl中在6°C下以0·5分析型至1.5ml分钟（制备型）的流速进行。两个SEC色谱柱均使用市售蛋白质校准试剂盒GEHealthcare，LittIeChalfont，UK进行校准。将代表单体CRALBP-9-顺式-视黄醛和同源低聚物CRALBP-9-顺式-视黄醛的峰级分合并并通过Centriprep-10Millipore浓缩至20mgmL图11A、图11B、图11C。[0194]实施例12[0195]通过包含α-ΤΤΡ三聚体的α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球的转胞吞作用[0196]根据HorisbergerHorisberger，Μ·1984·，Polak，J.，Varndel，I.Ed.Elsevier:Amsterdam，p.98先前描述的PIERCE方法，将对应于来自分析凝胶过滤的单体和四聚体蛋白的α-ΤΤΡ级分用异硫氰酸荧光素FITC标记。简而言之，将蛋白质样品转移到碳酸盐缓冲液（0.1Μ，ρΗ9.0中以使用预先在相同缓冲液中平衡的PD-IO脱盐柱（GEHealthcare，LittleChalfont，UK进行标记。FITC在使用前在无水DMSOlmgml中新鲜溶解。通过向Iml蛋白质（lmgml中加入50μ1FITCDMSO溶液开始标记反应。反应混合物在37°C下温育2小时，并通过使用预先在PBS中平衡的PD-IO柱（IOmM磷酸盐，138mMNaCl，27mMKCl，pH7.4去除过量的FITC以终止反应混合物。标记的蛋白质样品最终通过在PBS中在Superose610300GL柱GEHealthcare，LittleChalfont，UK上的分析型SEC纯化。转铁蛋白用相同的方法标记，并在转胞吞作用实验中用作阳性对照。为了证明通过α-ΤΤΡ-α-ΤοΙ纳米球促进转胞吞作用，我们使用来自人脐静脉HUVEC的内皮原代细胞，根据MiltenyiBiotec方案，在胰蛋白酶EDTA的帮助下从新鲜脐带线中分离HUVEC。通过VonWi11ebrand因子vWF和⑶31的阳性免疫荧光共染色验证内皮源的真实性。将HUVEC在Transwell系统孔径0.4μπι的可渗透聚酯膜;美国康宁公司Corning，USA中在具有明胶预涂层德国Sigma-Aldrich公司）的包含lOOUml青霉素和lOOygml链霉素PANBiotech，德国）的内皮细胞生长培养基Promocell，德国）中培养。使细胞在培养7天内形成紧密单层，而培养基每隔一天更换一次。对于包含200ygRITC-葡聚糖70kDaSigmaAldrich，MO，USA和200ygFITC标记的单体α-ΤΤΡ、α-ΤΤΡ-α-Τ〇1纳米球或转铁蛋白（作为阳性对照）的胞吞作用测量培养基，其被分别施加到顶端室。在将样品加入顶端室后，在不同时间点（15、30、45、60、120、180和240分钟）对ΙΟΟμΙ基底外侧培养基进行采样以监测转运。随后使用Tecaninfinite200酶标仪Tecan，Maennedorf，CH在485nm的激发波长和535nm的发射波长FITC下分析基底外侧等分试样的荧光，然后在545nm的激发波长和590nm的发射波长RITC下测量。代表上皮细胞模型的CaC〇-2TC7细胞系（人结肠直肠腺癌细胞；由英国纽卡斯尔大学的G.Lietz博士友情提供用作转胞吞作用实验中的阴性对照。将CaCo-2细胞维持在含有4.5gl葡萄糖、4_〇11^谷氨酰胺、1!111]1〇11丙酮酸钠、1001]1111青霉素、10^81111链霉素的011]^6〇〇〇’81〇1;[_61Eagles培养基PANBiotec，德国）和20%vvFCSGibco，Germany中。CaC0-2细胞广泛用作屏障和转运研究的体内模型（PiegholdtS等，FreeRadicalBiologyandMedicine201470：255-264；KopsSK,ffestAB,LeachJ,MillerRH.,TheJournalofnutrition1997127：1744-1751；LevyE,MehranM,SeidmanE.,TheFASEBJournal19959:626-635XaCo-2细胞在培养10天内在如上所述的相同Transwell系统中分化并形成紧密上皮单层。根据HUVEC实验进行转胞吞作用实验。如Fisher等先前所述FisherJ等，AmericanJournalofPhysiology-CellPhysiology2007293:C641_C649计算通量的速率。作为细胞旁通量的对照和作为形成紧密连接的保证，在每个实验中将罗丹明异硫氰酸酯RITC葡聚糖（70kDa同时添加至顶端室作为紧密连接对照。除了在545nm的激发波长和590nm的发射波长处检测到RITC之外，以与FITC-a-TTP相同的方式测量RITC葡聚糖的细胞旁转运水平。RITC和FITC的不同荧光行为允许同时分析感兴趣的蛋白和葡聚糖对照。由于葡聚糖不被内皮细胞内化至可观的水平，所以基底室中葡聚糖的任何积聚与细胞旁通量相关（图120[0197]实施例13[0198]通过包含CRALBP三聚体的CRALBP-顺式-视黄醛纳米球的转胞吞作用[0199]根据HorisbergerHorisberger，Μ·1984·，Polak，J.，Varndel，I.Ed.Elsevier:Amsterdam，p.98先前描述的PIERCE方法，将对应于来自分析凝胶过滤的单体和同源低聚物蛋白的CRALBP级分用异硫氰酸荧光素FITC标记。简而言之，将蛋白质样品转移到碳酸盐缓冲液（〇.IM，pH9.0中以使用预先在相同缓冲液中平衡的PD-10脱盐柱（GEHealthcare，LittleChalfont，UK进行标记。FITC在使用前在无水DMSOlmgml中新鲜溶解。通过向Iml蛋白质（lmgml中加入50μ1FITCDMSO溶液开始标记反应。反应混合物在37°C下温育2小时，并通过使用预先在I3BS中平衡的PD-IO柱（IOmM磷酸盐，138mMNaCl，27mMKCl，pH7.4去除过量的FITC以终止反应混合物。标记的蛋白质样品最终通过在I3BS中在Superose610300GL柱（GEHealthcare，LittleChalfont，UK上的分析型SEC纯化。转铁蛋白用相同的方法标记，并在转胞吞作用实验中用作阳性对照。为了证明通过CRALBP-顺式-视黄醛纳米球促进转胞吞作用，我们使用来自人脐静脉HUVEC的内皮原代细胞，根据MiltenyiBiotec方案，在胰蛋白酶EDTA的帮助下从新鲜脐带线中分离HUVEC。通过VonWillebrand因子（vWF和⑶31的阳性免疫荧光共染色验证内皮源的真实性。将HUVEC在Transwell系统孔径0.4μηι的可渗透聚酯膜;美国康宁公司（Corning，USA中在具有明胶预涂层德国Sigma-Aldrich公司）的包含lOOUml青霉素和100ygml链霉素PANBiotech，德国）的内皮细胞生长培养基Promocell，德国）中培养。使细胞在培养7天内形成紧密单层，而培养基每隔一天更换一次。对于包含200ygRITC-葡聚糖70kDaSigmaAldrich，MO，USA和200ygFITC标记的单体CRALBP、CRALBP-顺式-视黄醛纳米球或转铁蛋白（作为阳性对照）的胞吞作用测量培养基，其被分别施加到顶端室。在将样品加入顶端室后，在不同时间点（15、30、45、60、120、180和240分钟）对10^1基底外侧培养基进行采样以监测转运。随后使用了6〇11；[11；1^11；^6200酶标仪016011，]\^6111161〇1；1^，0{在485111]1的激发波长和535111]1的发射波长FITC下分析基底外侧等分试样的荧光，然后在545nm的激发波长和590nm的发射波长〇?ITC下测量。代表上皮细胞模型的CaC〇-2TC7细胞系（人结肠直肠腺癌细胞；由英国纽卡斯尔大学的G.Lietz博士友情提供用作转胞吞作用实验中的阴性对照。将CaCo-2细胞维持在含有4.5gl葡萄糖、4mmolL-谷氨酰胺、lmmol1丙酮酸钠、100Uml青霉素、IOOygml链霉素的Dulbecco’sModi_edEagles培养基（PANBiotec，德国）和20%vvFCSGibco，Germany中。CaC〇-2细胞广泛用作屏障和转运研究的体内模型PiegholdtS等，FreeRadicalBiologyandMedicine201470：255-264；KopsSK,ffestAB,LeachJ,MillerRH.,TheJournalofnutrition1997127:1744-1751；LevyE,MehranM，SeidmanE.，TheFASEBJournal19959:626-635XaC〇-2细胞在培养10天内在如上所述的相同Transwell系统中分化并形成紧密上皮单层。根据HUVEC实验进行转胞吞作用实验。如Fisher等先前所述（FisherJ等，AmericanJournalofPhysiology-CellPhysiology2007293:C641-C649计算通量的速率。作为细胞旁通量的对照和作为形成紧密连接的保证，在每个实验中将罗丹明异硫氰酸酯RITC葡聚糖70kDa同时添加至顶端室作为紧密连接对照。除了在545nm的激发波长和590nm的发射波长处检测到RITC之外，以与FITC-a-TTP相同的方式测量RITC葡聚糖的细胞旁转运水平。RITC和FITC的不同荧光行为允许同时分析感兴趣的蛋白和葡聚糖对照。由于葡聚糖不被内皮细胞内化至可观的水平，所以基底室中葡聚糖的任何积聚与细胞旁通量相关。

权利要求：1.一种纳米球，其包含相等数目的：⑴人SEC14样蛋白，和ii所述SEC14样蛋白的同源配体，所述纳米球优选由以上组成。2.根据权利要求1所述的纳米球，其中，所述相等数目为3至60。3.根据权利要求1或2所述的纳米球，其中，所述人SEC14样蛋白选自：aa-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ;⑹细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP;cClavesinlCLVSl；dClavesin2CLVS2;和eα-生育酚转移蛋白样TTPAL。4.根据权利要求1至3中任一项所述的纳米球，其中，所述人SEC14样蛋白是α-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ。5.根据权利要求5所述的纳米球，其中，所述相等数目为24。6.根据权利要求4或5所述的纳米球，其中，所述α-生育酚转移蛋白（α-ΤΤΡ的所述同源配体是生育酚，其中优选所述生育酚是α-生育酚，并且其中进一步优选所述α-生育酚是R，R，R-a_生育酚。7.根据权利要求1至3中任一项所述的纳米球，其中，所述SEC14样蛋白是细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP。8.根据权利要求7所述的纳米球，其中，所述CRALBP的所述同源配体是顺式-视黄醇或顺式-视黄醛，其中优选所述顺式-视黄醇或所述顺式-视黄醛选自9-顺式-视黄醛、11-顺式-视黄醛、9,13-二顺式-视黄醛、9-顺式-视黄醇、11-顺式-视黄醇和9,13-二顺式-视黄醇。9.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米球，其中，所述SEC14样蛋白包含氨基酸序列，其中所述SEC14样蛋白的所述氨基酸序列包含：a与SEQIDNO:3的位置56对应的位置上的选自L和I的氨基酸残基；⑹与SEQIDNO:3的位置61对应的位置上的氨基酸残基F;c与SEQIDNO:3的位置63对应的位置上的选自L、V、Q、H和Y的氨基酸残基；d与SEQIDNO:3的位置67对应的位置上的选自W、Y、F和L的氨基酸残基；e与SEQIDNO:3的位置70对应的位置上的氨基酸残基L;或f与SEQIDNO:3的位置74对应的位置上的选自Y、V、F和H的氨基酸残基；其中所述SEC14样蛋白的所述氨基酸序列包含至少两个、优选至少三个、进一步优选至少四个、再进一步优选至少五个所述氨基酸残基a-f中的任一者；并且其中优选地，为所述纳米球所包含的所述数目的SEC14样蛋白中第一个SEC14样蛋白的所述氨基酸序列的a-f中的任一者的至少四个氨基酸残基结合为所述纳米球所包含的所述数目的SEC14样蛋白中第二和第三个SEC14样蛋白的所述氨基酸序列的a-f中的任一者的至少四个氨基酸残基。10.—种制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的：⑴人SEC14样蛋白，和ii所述SEC14样蛋白的同源配体，所述纳米球优选由以上组成，其中所述方法包括以下步骤：a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为1μΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6至9,并且其中优选所述溶液I包含盐，其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;⑹在溶液II中提供SEC14样蛋白的所述同源配体，其中所述溶液I中SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度为5μΜ至500mM，并且其中所述溶液II的溶剂为水溶性溶剂；c通过组合所述溶液I和所述溶液II产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔），并且其中所述溶液ΠI中所述水溶性溶剂的体积为0.5-8%体积体积）；d使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体组装成纳米球；e从所述溶液III中分离所述纳米球；f任选地纯化所述纳米球。11.一种制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的：⑴人SEC14样蛋白，和ii所述SEC14样蛋白的同源配体，所述纳米球优选由以上组成；其中所述方法包括以下步骤：a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为1μΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6到9;⑹在水溶液II中提供SEC14样蛋白的所述同源配体，其中所述溶液I中SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度为5μΜ至500mM;并且其中所述溶液II包含洗涤剂；c通过组合所述溶液I和所述溶液II产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔）；d从所述溶液III中去除所述洗涤剂，其中从所述溶液III中去除所述洗涤剂使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体组装成纳米球；e从所述溶液III中分离所述纳米球；f任选地纯化所述纳米球。12.—种制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的：⑴人SEC14样蛋白，和ii所述SEC14样蛋白的同源配体，所述纳米球优选由以上组成；其中所述方法包括以下步骤：a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为1μΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6至9,并且其中优选所述溶液I包含盐，其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;⑹在溶液II中提供SEC14样蛋白的所述同源配体，其中所述溶液I中SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度为5μΜ至500mM，并且其中所述溶液II的溶剂为水溶性溶剂；C通过组合所述溶液I和所述溶液II产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔），并且其中所述溶液ΠI中所述水溶性溶剂的体积为0.5-8%体积体积）；d使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体形成由所述SEC14样蛋白之一和所述SEC14样蛋白的所述同源配体之一组成的单体复合物；e从所述溶液III中分离所述单体复合物；f任选地纯化所述单体复合物；g产生水溶液IV，其中所述溶液IV包含所述单体复合物，并且其中所述溶液IV中所述单体复合物的浓度为5mgml至50mgml;并且其中所述溶液IV的pH为6至9,并且其中优选所述溶液IV包含盐，并且其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;⑹使所述单体复合物形成所述纳米球的晶体。13.—种制备纳米球的方法，所述纳米球包含相等数目的：⑴人SEC14样蛋白，和ii所述SEC14样蛋白的同源配体，所述纳米球优选由以上组成；其中所述方法包括以下步骤：a在水溶液I中提供所述SEC14样蛋白，其中所述溶液I中所述SEC14样蛋白的浓度为1μΜ至5mM，并且其中所述溶液I的pH为6到9;⑹在水溶液II中提供SEC14样蛋白的所述同源配体，其中所述溶液I中SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度为5μΜ至500mM;并且其中所述溶液II包含洗涤剂；c通过组合所述溶液I和所述溶液II产生溶液III，其中所述溶液III中所述SEC14样蛋白的浓度与所述SEC14样蛋白的所述同源配体的浓度之比为4:1至1:4摩尔摩尔）；d从所述溶液III中去除所述洗涤剂，其中从所述溶液III中去除所述洗涤剂使所述SEC14样蛋白和所述SEC14样蛋白的所述同源配体形成由所述SEC14样蛋白之一和所述SEC14样蛋白的所述同源配体之一组成的单体复合物；e从所述溶液III中分离所述单体复合物；f任选地纯化所述单体复合物；g产生水溶液IV，其中所述溶液IV包含所述单体复合物，并且其中所述溶液IV中所述单体复合物的浓度为5mgml至50mgml，并且其中所述溶液IV的pH为6至9,并且其中优选所述溶液IV包含盐，并且其中所述盐的浓度为IOmM至500mM;⑹使所述单体复合物形成所述纳米球的晶体。14.一种药物组合物，其包含：a根据权利要求1至9中任一项所述的纳米球;和⑹药学上可接受的载体。15.根据权利要求1至9中任一项所述的纳米球或根据权利要求14所述的药物组合物在治疗或预防、优选治疗具有维生素E缺乏症的共济失调AVED、肌肉营养不良、低脂血症、低脂蛋白血症、血脂异常、人类不育症、伤口愈合受损或炎性疾病的方法中的用途，其中优选所述炎性疾病为关节炎。

百度查询： 伯尔尼大学 SEC14样蛋白及同源配体的纳米球

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