申请/专利权人：拜耳药业股份公司

申请日：2013-05-08

公开（公告）日：2019-03-12

公开（公告）号：CN104684932B

主分类号：C07K16/36(2006.01)I

分类号：C07K16/36(2006.01)I

优先权：["2012.05.10 EP 12167438.6","2012.08.24 EP 12181697.9","2013.01.07 EP 13150361.7","2013.04.30 US 61/817,675"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2019.03.12#授权;2015.07.01#实质审查的生效;2015.06.03#公开

摘要：本发明涉及能够结合凝血因子XI和或其活化形式因子XIa的抗体及其使用方法，特别是作为抑制血小板聚集并由此抑制血栓形成的试剂的使用方法。

主权项：1.能够结合凝血因子XIaFXIa的人单克隆抗体及其抗原结合片段，其包含可变轻链结构域和可变重链结构域，其中所述可变轻链结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:19组成，且所述可变重链结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:20组成。

全文数据：能够结合凝血因子XI和或其活化形式因子XIa的抗体及其用途技术领域本发明涉及能够结合凝血因子XI和或其活化形式因子XIa的抗体及其使用方法，特别是作为抑制血小板聚集并由此抑制血栓形成的试剂的使用方法。背景技术1964年，Macfarlane和Davie&Ratnoff提出了他们关于血液凝血过程的级联假说[MacfarlaneRG.Anenzymecascadeinthebloodclottingmechanism,anditsfunctionasabiochemicalamplifier.Nature1964；202:498–9.；DavieEW,RatnoffOD.Waterfallsequenceforintrinsicbloodclotting.Science1964；145:1310–2.]。从那时起，我们对于体内凝血功能的知识已经增加了。在过去的几年内，起始凝血并会聚于一个共同途径，最终导致凝血酶产生和纤维蛋白沉积的两种不同路径——所谓的外源和内源途径——的理论已经得到修正。在目前的模型中，当血浆蛋白酶激活因子VII与组织因子TF接触并以此形成复合物时起始了凝血。这种组织因子-FVIIa复合物能够将酶原FX激活成其活化形式FXa，FXa能够将凝血酶原凝血因子II转化为凝血酶IIa。凝血酶——凝血过程中的关键因素——其进而能催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白。另外，凝血酶激活由血小板所表达的特定受体，这导致血小板的活化。活化的血小板和纤维蛋白对于凝血块形成是必需的，并因此是正常止血的基本因素。第二条放大路径是通过凝血因子XIFXI形成的。已很好地证实，与凝血级联中的其他成员一样，FXI是在连接体内血液凝结的起始阶段与放大阶段中起关键作用的血浆丝氨酸蛋白酶酶原[DavieEW,FujikawaK,KisielW.Thecoagulationcascade:initiation,maintenance,andregulation.Biochemistry1991；30:10363–70；GailaniD,BrozeJrGJ.FactorXIactivationinarevisedmodelofbloodcoagulation.Science1991；253:909–12；KravtsovDV,MatafonovA,TuckerEI,SunMF,WalshPN,GruberA,etal.FactorXIcontributestothrombingenerationintheabsenceoffactorXII.Blood2009；114:452–8.3-5]。FXI缺乏通常不会导致自发性出血，但是其与止血困难的出血的风险增加相关，而出血的严重程度与FXI的血浆水平不太相关。在人类中，严重的FXI缺乏对血栓性疾病起到某些保护作用[SalomonO,SteinbergDM,ZuckerM,VaronD,ZivelinA,SeligshonU.PatientswithseverefactorXIdeficiencyhaveareducedincidenceofdeep-veinthrombosis.ThrombHaemost2011；105:269–73；SalomonO,SteinbergDM,Koren-MoragN,TanneD,SeligsohnU.ReducedincidenceofischemicstrokeinpatientswithseverefactorXIdeficiency.Blood2008；111:4113–7]。而高水平的FXI一直与血栓形成事件相关[MeijersJC,TekelenburgWL,BoumaBN,BertinaRM,RosendaalFR.HighlevelsofcoagulationfactorXIasariskfactorforvenousthrombosis.NEnglJMed2000；342:696–701]。因此，已经提议将抑制FXI作为开发新的抗血栓药以获得提高的效益-风险比的新方法。因此，仍然对有效阻断血管内血栓形成而又不损害止血的抗血栓形成、抗血小板药物具有很大的医疗需求。发明内容近年来，新抗血栓试剂的开发已取得了很大的进展。但是，这些试剂所造成的不希望的出血事件仍然是一个严重的问题。因此，仍然有待发现能够理想地抑制血栓形成而又不损害止血的最佳抗血栓化合物。凝血因子XIFXIFXIa与血小板受体apoER2相互作用。本发明首次证明了抑制FXIFXIa活性干扰了在剪切流动条件下的病理性的血小板激活和血小板聚集的过程。在离体血栓形成模型中，抑制FXIFXIa活性导致在经过胶原蛋白表面的生理流动条件下全血中血小板活化标记物如CD62P的显著减少以及导致下游微聚集体的减少。因此，在血小板依赖性的动脉血栓形成的灵长类模型中，抑制FXIa降低了血小板沉积而不会影响血小板依赖性的初期止血。虽然具有显著的抗血小板作用，但是令人惊讶地，血小板与组织因子依赖性的初期止血栓子形成所必需的血管外基质蛋白的初始相互作用却没有受到影响。因此，抑制FXIFXIa活性代表一种理想的药理学原理，其表现出抗血栓形成活性而不会引起出血相关的副作用。为了清楚起见：不损害止血意指抑制凝血因子XI和或XIa不导致不需要的且可测量的出血事件，即使在存在其他抗凝血化合物和或抗血小板化合物的情况下。如在血友病CHemophiliaC患者中所显示的一样，只有在密集手术和或严重受伤的情况下才会发生出血。提供了组合物和方法用于显示针对以其酶原形式和或其活化形式凝血因子XIa存在的凝血因子XI的抗体、抗原结合片段或其变体，通过抑制或减少血小板聚集并由此抑制或减少微聚集体和或血栓凝血块的产生而表现出抗血小板活性。使用本发明的这些抗凝血因子XI的抗体和或抗凝血因子Xia的抗体，抗原结合抗体片段以及所述抗体和片段的变体抑制血小板聚集并由此抑制血栓形成而不会损害止血。本文还描述了抗凝血因子XI的抗体和或抗凝血因子Xia的抗体的给药是中和抗体，以及本发明的这些抗体、抗原结合抗体片段以及所述抗体和片段的变体以用作抗凝血、抗血栓形成疗法不会增加不需要的出血事件的风险。本发明提供了能够选择性结合活化形式的血浆因子XI——FXIa，并因此抑制了血小板聚集及相关的血栓形成而不会损害止血的人单克隆抗体。组合物包括能够结合凝血因子XI的重链和或凝血因子XIa的轻链的确定表位的抗凝血因子XI的抗体和或抗凝血因子Xia的抗体。这些抗体通过或和阻遏凝血因子XIa的蛋白水解活性和或通过抑制凝血因子XI经由凝血因子FXIIa和或凝血酶转化为其活化形式凝血因子XIa来表现中和活性。在一个优选的实施方案中，本发明还包含了所述抗体与来自非人的其他物种主要来自于兔的凝血因子XI和或XIa的交叉反应性，使得能够进行深入的药理学和毒理学分析。在另一个优选的实施方案中，使用方法来优化和降低本发明组合物的免疫原性以降低开发抗药物抗体的风险。本发明还包含与本文所述的抗体中的一个相竞争的人类抗体。另外，组合物包括本发明中的抗原结合抗体片段、抗体和片段的变体、产生这些抗体的细胞系和编码这些抗体的氨基酸的分离的核酸。本发明还包含药物组合物，所述药物组合物包含在可药用载体和或溶液中的本发明的抗凝血因子XI的抗体和或抗凝血因子Xia的抗体、或抗原结合抗体片段，以及所述抗体和片段的变体。本发明的方法包括将上述组合物给予需要的受试者，目的是抑制血小板聚集并由此抑制血栓形成，降低了在血栓治疗中任何其他抗凝血试剂或抗血栓试剂的所需剂量，可治疗急性炎症反应，或治疗癌症，或治疗任何其他与所述凝血级联激活相关的疾病。还提供了用于产生本发明的抗凝血因子XI的抗体和或抗FXIa的抗体、或抗原结合抗体片段，以及抗体和片段的变体的方法。附图说明图1：包含可变轻链结构域的氨基酸序列SEQIDNO:19和可变重链结构域的氨基酸序列SEQIDNO:20的抗FXIa的抗体076D-M007-H04抑制人FXIa的剂量响应曲线EC50等同于IC50。此抗体包含CDRH1SEQIDNO:21、CDRH2SEQIDNO:22和CDRH3SEQIDNO:23。此抗体还包含CDRL1SEQIDNO:24、CDRL2SEQIDNO:25和CDRL3SEQIDNO:26。在所示浓度下测试了在淘选筛选过程中鉴定的抗体抑制人FXIa的蛋白水解活性的能力。相关的DNA序列如SEQIDNO:1至SEQIDNO:8所示。图2：抗FXIa的抗体076D-M007-H04抑制兔FXIa的剂量响应曲线。在所示浓度下测试了在淘选筛选过程中鉴定的抗体抑制兔FXIa的蛋白水解活性的能力。图3：包含可变轻链结构域的氨基酸序列SEQIDNO:27和可变重链结构域的氨基酸序列SEQIDNO:20的抗FXIa的抗体076D-M007-H04-CDRL3-N110D抑制人FXIa的剂量响应曲线。在所示浓度下测试了在淘选筛选过程中鉴定的抗体抑制人FXIa的蛋白水解活性的能力。图4：抗FXIa的抗体076D-M007-H04-CDRL3-N110D的剂量响应曲线。在所示浓度下测试了在淘选筛选过程中鉴定的抗体抑制兔FXIa的蛋白水解活性的能力。图5：包含可变轻链结构域的氨基酸序列SEQIDNO:29和可变重链结构域的氨基酸序列SEQIDNO:30的抗FXI的抗体076D-M028-H17通过凝血因子XIIa抑制人FXI转化为FXIa的剂量响应曲线。此抗体包含CDRH1SEQIDNO:31、CDRH2SEQIDNO:32和CDRH3SEQIDNO:33。此抗体还包含CDRL1SEQIDNO:34、CDRL2SEQIDNO:35和CDRL3SEQIDNO:36。在所示浓度下测试了在淘选筛选过程中鉴定的抗体抑制酶原FXI转化为其活化形式FXIa的能力。相关的DNA序列如SEQIDNO:11至SEQIDNO:18所示。图6：抗FXI的抗体076D-M028-H17通过凝血因子IIa抑制人FXI转化为FXIa的剂量响应曲线。在所示浓度下测试了在淘选筛选过程中鉴定的抗体抑制酶原FXI转化为其活化形式FXIa的能力。图7：抗FXI的抗体076D-M028-H17通过凝血因子XIIa抑制兔FXI转化为FXIa的剂量响应曲线。在所示浓度下测试了在淘选筛选过程中鉴定的抗体抑制酶原FXI转化为其活化形式FXIa的能力。图8：抗FXI的抗体076D-M028-H17通过凝血因子IIa抑制兔FXI转化为FXIa的剂量响应曲线。在所示浓度下测试了在淘选筛选过程中鉴定的抗体抑制酶原FXI转化为其活化形式FXIa的能力。图9：076D-M007-H04对人FXIa催化结构域的结合和阻断活性。尽管076D-M007-H04抑制了人FXIa的蛋白水解活性，而076D-M028-H17没有显示这种活性，表明了076D-M007-H04结合到FXIa的催化结构域上。图10:使用Lineweaver–Burk曲线图对076D-M007-H04的结合模式进行的表征显示该抗体表现出竞争性抑制活性。图11：CD62P表达和血小板微聚集体形成的流式细胞术分析。通过光散射和FITC-CD41CD61GPIIbIIIa荧光的组合检测了单个血小板。A通过使用FITC-CD41和PE-CD62P荧光的点阵图确定CD62P表达。示出了灌注前左侧和灌注后右侧的圈选的血小板。B由增加的尺寸正向散射定义血小板微聚集体形成，示于圆圈中。示出了灌注前左侧和灌注后右侧收集的样品的点阵图。图12：通过FXIa抗体降低血小板CD62P表达。用A076D-M007-H04和B076D-M028-H17处理全血并在再钙化后立即灌注到胶原蛋白包被的表面上。作为平行实验，用载体或抑制剂处理后收集全血样品，并用TRAP610μgml孵育5分钟或不进行孵育。如图11中所示，通过流式细胞术分析血小板CD62P表达。将数据表示为在至少5次实验的圈选群体中的CD62P-阳性血小板的平均值±SEM百分比。在每次处理的5分钟灌注过程中最高的CD62P表达水平示于图表中。图13：通过FXIa抗体抑制血小板微聚集体形成。用A076D-M007-H04和B076D-M028-H17处理全血并在再钙化后立即灌注到胶原蛋白包被的表面上。如图13中所示，通过流式细胞术分析血小板微聚集体并展示。将数据表示为相对于至少5次实验的104个圈选的单个血小板的平均值±SEM聚集体计数。在每次处理的5分钟灌注过程中最大的聚集体计数示于图表中。图14：076D-M007-H04对氯化铁诱导的血栓形成的体内作用a和对耳出血时间的体内作用b。可证明076D-M007-H04剂量依赖性地降低了血栓重量而没有增加耳出血时间。图15：076D-M007-H04-CDRL3-N110D对氯化铁诱导的血栓形成的体内作用a和对耳出血时间的体内作用b记载于实施例XXX中。可以证明076D-M007-H04-CDRL3-N110D剂量依赖性地降低了血栓重量而没有增加耳出血时间。图16：076D-M028-H17对氯化铁诱发的血栓形成的体内作用a和对耳部出血时间的体内作用b记载于实施例XXX。可以证明076D-M028-H17剂量依赖性的降低了血栓重量但没有增加耳出血时间。图17：该图显示了与FIXa上部分复合的Fab076D-M007-H04下部分的卡通示意图。图18a：该图显示了Fab076D-M007-H04卡通图对FIXaC500S的结合表位的详细视图。FIXaC500S以表面图surfacerepresentation显示。图18b:该图显示了具有以表面图显示的FIXaC500S的叠加肽X-射线结构的Fab076D-M007-H04。活性中心裂缝用红色椭圆突出显示。图19a:该图显示了带有叠加的Fab076D-M007-H04的酶原FXI的晶体结构odb登录号2F83。图19b:该图显示了同样的视角，但是酶原FXI的催化结构域被Fab076D-M007-H04：FXIaC500S复合结构中FXIaC500S的催化结构域替换。FXI和FXIaC500S的催化结构域都以表面图显示，所有其他结构域都以卡通显示。在与Fab076D-M007-H04的交界面处未正确排序的环在图19中突出显示。图20：在收集自076D-M007-H04给药后的狒狒的血浆样品中确定了体外aPTT凝血时间的增加。图21：在给药2.5mgkg076D-M007-H04静脉推注后的ACT测量，从给药后5分钟到给药后504小时。图22：在给药2.5mgkg076D-M007-H04静脉推注后的ACT测量的头24小时。图23：在给药2.5mgkg076D-M007-H04静脉推注后的aPTT测量，从给药后5分钟到给药后504小时。图24：在给药2.5mgkg076D-M007-H04静脉推注后的aPTT测量的头24小时。图25：在2mm内径的胶原蛋白包被的ePTFE血管移植物上的血小板沉积。图26：如实施例12中所述的在胶原蛋白包被的ePTFE血管移植物上的血小板沉积。图27：如实施例12部分所述的在静脉扩张室和在胶原蛋白包被的移植物和所述硅室之间的连接部分上的血小板沉积。图28：在给药076D-M007-HO4后的狒狒血浆中测量的TAT水平。图29：在单独或在给予浓度为32mgkg的可咀嚼阿司匹林ASA，32mgkg后用0.5mgkg076D-M007-H04和2mgkg076D-M007-H0424小时后处理的狒狒中的出血时间。具体实施方式定义止血：术语止血是指分别将血流阻止arrest在损伤部位以及在伤口愈合过程中恢复血管通畅性vascularpatency的主要机制。在正常止血和病理性血栓形成的过程中，三种机制同时激活：意指活化的血小板与血管壁相互作用的初期止血、纤维蛋白的形成和称为纤维蛋白溶解的过程[ArthurA.Sasahara,JosephLoscalzo2002NewTherapeuticAgentsforThrombosisandThrombolysis2ndEditionMarcelDekkerInc.NewYork,NY,ISBN0-8247-0795-8]。凝血和凝血级联：称为凝血级联的基于蛋白质的系统用于稳定已经形成的凝血块并进一步封闭伤口。所述凝血途径是蛋白水解级联。该途径的每一种酶都以酶原的形式非活化形式存在于血浆中，其在被激活时经历蛋白水解切割以从前体分子中释放出活性因子。凝血级联作为控制激活过程的一系列正向和负向反馈环路而发挥作用。所述途径的最终目的是产生凝血酶，凝血酶能够将可溶的纤维蛋白原转化为形成凝血块的纤维蛋白。可将产生凝血酶的过程分为三个阶段：提供用于产生活性凝血块因子FXa激活的因子-X的可选路径的内源和外源途径，和导致凝血酶形成的最终共同途径[HoffmanM.M.andMonroeD.M.2005Rethinkingthecoagulationcascade.CurrHematolRep.4:391-396；JohneJ,BlumeC,BenzPM,PozgajováM,UllrichM,SchuhK,NieswandtB,WalterU,RennéT.2006PlateletspromotecoagulationfactorXII-mediatedproteolyticcascadesystemsinplasma.BiolChem.387:173-178]。血小板聚集：当发生血管壁破裂时，暴露了一般不与血流直接接触的物质。这些物质主要是胶原蛋白和冯维勒布兰德vonWillebrand因子使得血小板能够粘附在破裂的表面。一旦血小板粘附在所述表面，其便释放将其他血小板吸引到所述受损区域的化学物质，这称为血小板聚集。这两个过程是对止血的第一响应。凝血因子XI和凝血因子XIa所述凝血因子XIFXI在肝脏中合成并作为与高分子量激肽原复合的二硫键连接的二聚体而在血浆中循环。该二聚体的每条多肽链大约80KD。通过血液凝结的接触阶段或者通过血小板表面的凝血酶介导的激活将所述酶原因子XI转化为其活性形式——所述凝血因子XIaFXIa。在所述因子XI的激活过程中，两条链都有一个内部肽键被裂解，形成了活化因子FXIa——由二硫键连接在一起的两条重链和两条轻链组成的丝氨酸蛋白酶。所述丝氨酸蛋白酶FXIa将凝血因子IX转化为IXa，IXa随后激活凝血因子XXa。然后Xa可介导凝血因子II凝血酶的激活。该因子的缺陷导致罗森塔尔综合症也被称为C型血友病——一种具有以下特征凝血异常：由受损处长时间出血、经常或严重鼻出血、尿中微量的血和女性经期大量出血。本文使用的―凝血因子XI‖、―因子XI‖或―FXI‖是指来自任何表达该蛋白的哺乳动物物种的任何FXI。例如，FXI可是显示了参与调节血流、凝血和或血栓形成的凝血因子XI的人类、非人灵长类动物如狒狒、鼠、狗、猫、奶牛、马、猪、兔或任何其他物种。凝血因子XIIa激活凝血因子XI的切割位点是每条肽链中Arg-369和Ile-370之间的内部肽键[FujikawaK,ChungDW,HendricksonLE,DavieEW.1986AminoacidsequenceofhumanfactorXI,abloodcoagulationfactorwithfourtandemrepeatsthatarehighlyhomologouswithplasmaprekallikrein.Biochemistry25:2417-2424]。凝血因子XIa的每条重链369个氨基酸都含有称为苹果结构域appledomain的90-91个氨基酸的四个串联重复序列命名为A1-A4和一段短的连接肽[FujikawaK,ChungDW,HendricksonLE,DavieEW.1986AminoacidsequenceofhumanfactorXI,abloodcoagulationfactorwithfourtandemrepeatsthatarehighlyhomologouswithplasmaprekallikrein.Biochemistry25:2417-2424；SunMF,ZhaoM,GailaniD.1999IdentificationofaminoacidsinthefactorXIapple3domainrequiredforactivationoffactorIX.JBiolChem.274:36373-36378]。所述凝血因子XIa的轻链每条238个氨基酸含有具有丝氨酸蛋白酶的胰蛋白酶家族的典型序列的酶的催化部分[FujikawaK,ChungDW,HendricksonLE,DavieEW.1986AminoacidsequenceofhumanfactorXI,abloodcoagulationfactorwithfourtandemrepeatsthatarehighlyhomologouswithplasmaprekallikrein.Biochemistry25:2417-2424]。活化的因子XIa通过激活因子IX引发凝血内源途径的中间阶段。保守性氨基酸变体可制备保留了本文所述的抗体肽序列的整体分子结构的多肽变体。考虑到各氨基酸的性质，技术人员会认识到一些合理置换。例如，在所涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和或两亲性质的相似性的基础上，可进行氨基酸置换，即，“保守性置换”。例如：a非极性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；b极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；c带正电的碱性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；d带负电的酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。一般在a-d组内进行置换。另外，基于甘氨酸和脯氨酸破坏α螺旋的能力可将它们相互置换。类似地，某些氨基酸，如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸在α螺旋中更常见，而缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苏氨酸在β折叠层中更常见。甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和脯氨酸在转角中较为常见。可在以下组内进行一些优选的置换：i丝氨酸和苏氨酸；ii脯氨酸和甘氨酸；和iii丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。考虑到已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术，熟练的科学家可很容易地构建编码保守性氨基酸变体的DNA。本文使用的两条多肽序列之间的―序列同一性‖，表示所述序列之间相同的氨基酸的百分比。―序列同源性‖表示相同的或代表保守性氨基酸置换的氨基酸的百分比。本发明的优选多肽序列在CDR区域中具有至少60％的序列同一性，更优选地至少70％或80％，还更优选地至少90％，和最优选地至少95％。优选的抗体还在CDR区域中具有至少80％的序列同源性，更优选地90％和最优选地95％。本发明的DNA分子本发明还涉及编码本发明的抗体的DNA分子。这些序列包括，但不限于，SEQIDNOs1到18中所列出的那些DNA分子。本发明中的DNA分子不限于本文所公开的序列，还包括其变体。可参照本发明中的DNA变体在杂交中的物理特性对它们进行描述。技术人员会认识到可通过核酸杂交技术使用DNA鉴定其互补序列和因为DNA是双链的其等价物或同系物。还会认识到，当互补性低于100％时依然能够发生杂交。但是，考虑到条件的适当选择，可基于DNA序列与特定探针的结构相关性使用杂交技术来区分DNA序列。关于此类条件的指导可参见Sambrooketal.,1989[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.1989MolecularCloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,USA]和Ausubeletal.,1995[Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds.1995.CurrentProtocolsinMolecularBiology.NewYork:JohnWileyandSons]。两条多核苷酸序列之间的结构相似性可表示为这两条序列会与彼此杂交的条件的―严格性‖的函数。本文使用的术语―严格性‖是指所述条件不利于杂交的程度。严格条件非常不利于杂交，并且在这样的条件下只有结构上最相关的分子会相互杂交。相反，非严格条件有利于表现出较低程度的结构相关性的分子的杂交。因此，杂交严格性与两条核苷酸序列的结构关系直接相关。下列关系可用于关联杂交和相关性其中Tm是核酸双链体的熔解温度。a.Tm＝69.3+0.41G+C％b.错配碱基对数目中每增加1％，双链DNA的Tm值降低1℃。c.Tmμ2-Tmμ1＝18.5log10μ2μ1其中μ1和μ2是两种溶液的离子强度。杂交严格性是许多因素的函数，包括总DNA浓度、离子强度、温度、探针大小和破坏氢键的试剂的存在。促进杂交的因素包括高DNA浓度、高离子强度、低温、较长的探针大小和不存在破坏氢键的试剂。杂交一般分两个阶段进行：“结合”阶段和“洗涤”阶段。首先，在所述结合阶段中，探针在有利于杂交的条件下结合到靶标上。通常通过改变温度在这一阶段控制严格性。对于高严格性，除非使用短的寡核苷酸探针90％是可凝固的，并在30天后使用γ计数器评估所标记的纤维蛋白在血栓内的整合以使111In衰变。用所沉积的放射性cpm除以原始研究时候采集的样品的可凝固纤维蛋白原放射性cpmmg。使用产生高初始壁剪切速率在100mlmin的夹紧血流下的2120s的20mm长、内径为2mm的胶原蛋白包被的装置进行阻塞研究。使用γ闪烁相机以3分钟的间隔测量所标记的血小板在所述2mm血栓形成移植物上的沉积。通过近端夹紧将流动尽可能长时间的控制在100mlmin，然后当增加的血栓开始阻塞装置时降低流速。将20mlmin的最终血流速度用作阻塞的临界值，因为完全闭塞性血栓和该装置的缺乏血流会导致分流处的阻塞和动物的严重血损失。血样分析。使用微-60自动细胞计数器Horiba-ABXDiagnostics测定血细胞计数。将血液样品收集到终浓度为0.32％的柠檬酸钠中。将所有样品以12,900g离心5分钟，收集血浆并储存在-80℃。使用交叉反应性ELISA测定确定了凝血酶-抗凝血酶复合物TAT，Enzygnost-TAT，Dade-Behring；LOD：2ngmL。这些研究使用的所有ELISA测试试剂盒之前已经显示了对狒狒标志物的敏感性。在中断研究中仅4mm内径的胶原蛋白包被的移植物，将076D-M007-H04以推注形式给予该研究0.5mgkg，静脉推注10秒30分钟，以确定该抗体是否能够中断急性血栓增加。在阻塞研究中仅2mm内径的胶原蛋白包被的移植物，在实验前3小时以推注形式给予076D-M007-H04在0.5mgkg剂量24小时后0.5mgkg或2mgkg，静脉。在预防研究中4mm内径的胶原蛋白包被的移植物，接着是9mm内径的硅室，在实验前1小时以推注形式给予076D-M007-H04在0.5mgkg剂量24小时后0.5mgkg或2mgkg，静脉。止血评估。使用标准模板皮肤出血时间测试评估在狒狒中FXIa抑制对初期止血的效果InternationalTechnidyneCorp。在实验上，这种测试以及类似的测试例如，Simplate出血时间已经在人和非人灵长类动物中显示出对治疗性抗凝血剂、抗血小板试剂和凝血异常的敏感性Gruberetal.[2007]Blood109:3733-3740；Smithetal.[1985]Am.J.Clin.Pathol.83:211-215；Payneetal.[2002]J.Vasc.Surg.35:1204-1209。由相同的专业技术人员进行所有的出血时间测量。为了间接评估止血，还在实验之前、期间和之后的不同时间点进行了aPTT活化部分促凝血活原激酶时间；SynthASil,HemosIL；InstrumentationLaboratoryCompany,Bedford,MA和ACT活化凝血时间，LupoTekKCT；r2Diagnostics,SouthBend,IN的测量。体外aPTT。在启动所述aPTT测定之前，将不同浓度的076D-M007-H04在血浆中孵育10分钟。如图20中所示，在“前”时间点pretimepoint即，给予任何处理之前，在收集自狒狒的血浆样品中测定了aPTT凝血时间。结果表明，076D-M007-H04在来自血栓形成研究中所使用的所有6个实验狒狒的血浆中是抗凝血剂。体内凝血研究。在这些研究中使用了三只狒狒：两只狒狒在被给予32mkg的可咀嚼阿司匹林后被给予076D-M007-H042.5mgkgH04，静脉推注，一只狒狒在被给予0.5mgkg076D-M007-H04静脉推注24小时后被给予2mgkg剂量。在给药后的不同时间点测量了ACT图21和图22和aPTT图23和图24。在分流实验过程中的血小板沉积血栓形成阻塞实验。用于评估076D-M007-H04治疗是否可以防止小血管的阻塞或延长阻塞时间的血栓形成装置由2mm内径的20mm长的胶原蛋白包被的移植物组成。如图25中所示，血小板沉积显示了60分钟或适用时直到移植物阻塞时。1214的对照装置在60分钟内发生了堵塞，25的076D-M007-H040.5mgkg和25的076D-M007-H040.5mgkg+2mgkg装置发生了堵塞。数据为平均值±SEM。血栓形成预防实验。用于评估076D-M007-H04对血栓起始和增加的作用的血栓形成装置由4mm内径的20mm长的胶原蛋白包被的ePTFE移植物组成，该移植物之后是9mm内径的20mm长的硅橡胶室。如图26所示的血小板沉积的斜率指示了抗血小板活性。两种剂量的076D-M007-H040.5mgkg以及0.5mgkg24小时后2mgkg显示出了效力，这可通过如从血栓形成起始后的不同时间点上的血小板沉积速率的降低来证明。已经将所得数据进行归一化以解释实验之间的血小板数目变化。数据为平均值±SEM。如图27中所示，两种剂量的076D-M007-H040.5mgkg以及0.5mgkg24小时后2mgkg显示出了效力，这可通过从血栓形成起始后的不同时间点上的硅室中血小板沉积速率的显著降低来证明。数据为平均值±SEM。凝血酶-抗凝血酶复合物。由于FXI的抑制可通过限制凝血酶介导的血小板活化和纤维蛋白形成和或通过增加溶栓来降低体内血栓形成，因此使用可商购的ELISA试剂盒测定了凝血酶-抗凝血酶TAT的水平。如图28中所示，使用076D-M007-H040.5mgkg以及0.5mgkg24小时后2mgkg对狒狒进行的预处理防止了TAT水平的增加，意味着在缺失FXIa活性的情况下凝血酶生成显著降低。出血时间。使用已被FDA批准的用于儿童和成人的成人Surgicutt装置http:www.itcmedcomproductssurgicutt-bleeding-time-device对初期止血进行了评估。手动记录出血时间BT。观察到伤口的再出血情况30分钟，第二天评估了皮肤的擦伤、瘀斑、血肿和溢血。这些止血评估中的一个或多个已被证明是灵敏的并且能预测几乎所有市售抗血栓形成试剂抗血小板药物、抗凝血剂、溶栓剂的抗止血作用。可单独或在给予可咀嚼的阿司匹林ASA，32mgkg后将076D-M007-H040.5mgkg和24小时后2mgkg给予狒狒。如图29中所示，使用任何076D-M007-H04治疗时的出血时间和基线相比都没有增加。和单独的阿司匹林治疗相比，将076D-M007-H04给予经阿司匹林治疗的动物似乎没有进一步增加出血时间。

权利要求：1.能够结合凝血因子XIaFXIa的人单克隆抗体及其抗原结合片段，其包含可变轻链结构域和可变重链结构域，其中所述可变轻链结构域由氨基酸序列SEQIDNO:19组成，且所述可变重链结构域由氨基酸序列SEQIDNO:20组成。2.能够结合FXIa的人单克隆抗体及其抗原结合片段，其包含CDRH1SEQIDNO:21、CDRH2SEQIDNO:22和CDRH3SEQIDNO:23以及CDRH1SEQIDNO:24、CDRH2SEQIDNO:25和CDRH3SEQIDNO:26。3.能够结合FXIa的人单克隆抗体及其抗原结合片段，其包含可变轻链结构域和可变重链结构域，其中所述可变轻链结构域由氨基酸序列SEQIDNO:27组成，且所述可变重链结构域由氨基酸序列SEQIDNO:20组成。4.能够结合FXIa的人单克隆抗体及其抗原结合片段，其包含CDRH1SEQIDNO:21、CDRH2SEQIDNO:22和CDRH3SEQIDNO:23以及CDRH1SEQIDNO:24、CDRH2SEQIDNO:25和CDRH3SEQIDNO:28。5.包含权利要求1至4中任一项的抗体的药物组合物。6.包含权利要求1至4中任一项的抗体的药物。7.编码权利要求1至4中的抗体中的一种或多种的核酸。8.包含权利要求7的核酸的载体。9.包含权利要求8的载体的宿主细胞。

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