申请/专利权人：北京致成生物医学科技有限公司

申请日：2017-02-24

公开（公告）日：2019-09-06

公开（公告）号：CN110205322A

主分类号：C12N15/12(20060101)

分类号：C12N15/12(20060101);C12Q1/6886(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.12.08#授权;2019.10.08#实质审查的生效;2019.09.06#公开

摘要：本发明公开了一种乳腺癌治病基因SEC63的新突变SNP位点，所述新突变SNP位点为人类第6号染色体第108250679位碱基由C到T的SNP位点突变，所述位点突变为SEC63：NM_007214:exon2:c.C164T:p.R55K。本发明研究了易感SNP突变在乳腺癌辅助诊断的应用前景，阐述SNP对于乳腺癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明通过SNP基因型诊断制剂和诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

主权项：1.一种乳腺癌治病基因SEC63的新突变SNP位点，其特征在于，所述新突变SNP位点为人类第6号染色体第108250679位碱基由C到T的SNP位点突变，所述位点突变为SEC63：NM_007214:exon2:c.C164T:p.R55K。

全文数据：一种乳腺癌治病基因SEC63的新突变SNP位点及其应用技术领域本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种乳腺癌治病基因SEC63的新突变SNP位点及其应用；此案为分案申请，母案申请号为2017101015991，申请日为2017年2月24日，发明名称为一种乳腺癌治病基因新突变及其应用。背景技术乳腺癌是一种全身性疾病、其发生和发展是一个涉及多因素、多环节的复杂过程，包括癌基因的激活以及抑癌基因的失活等。因此，基因突变在乳腺癌的发生、发展过程中起着非常重要的作用。乳腺癌是一个多因素遗传变异性疾病，只有不足10％是由于单基因缺陷引起的。随着高通量基因技术的发展，越来越多与乳腺癌相关基因被发现，这些基因上潜在的遗传变异单核苷酸多态和拷贝数变异可能引起乳腺癌药物治疗效果的差异。由于遗传变异的存在使抗肿瘤药物的代谢途径以及药物作用的目标基因可能受到影响，进而影响疗效以及预后。SNPsinglenucleotidepolymorphism,SNP，即单核苷酸多态性是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。单核苷酸多态性为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。目前对于不同分型乳腺癌预后、疗效的预测性研究主要集中在SNP水平。SNP赋予个体对环境暴露、药物治疗等的不同反应，从而产生不同的表型，因此SNP可能是导致个体疾病发生发展差异的重要遗传基础。利用疾病易感的SNP谱诊断疾病，具有快速、灵敏、准确等特点，因而应用前景广阔。近年来，利用SNP诊断疾病的发生发展已成为临床和科研工作者的研究热点。然而，目前还没有将SNP应用于乳腺癌诊断的报道，若能筛选出乳腺癌易感的SNP作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，必将有力地推动我国乳腺癌早期诊断的现状，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟新的途径。发明内容本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种乳腺癌治病基因新突变。本发明的第二个目的是提供所述新突变在乳腺癌检测、诊断、治疗或预后中的应用。本发明的第三个目的是提供一种检测乳腺癌易感SNP位点基因型的生物制剂。本发明的第四个目的是提供乳腺癌辅助诊断试剂盒。发明人通过分离和研究乳腺癌患者及与其年龄匹配的健康女性对照外周血DNA中的单核苷酸多态性，寻找一组与乳腺癌高度相关的高特异性和敏感性的SNP，并研制出可便于临床应用的乳腺癌辅助诊断试剂盒，为乳腺癌的筛查和诊断提供数据支持。本发明的目的是通过下列技术方案实现的：本发明首先提供了一种乳腺癌治病基因新突变，所述新突变包括以下四个乳腺癌易感SNP位点，具体信息如表1所示。表1四个易感SNP位点信息进一步地，本发明提供了表1所述的新突变SNP位点在乳腺癌检测、诊断、治疗或预后中的应用。更进一步地，本发明提供了一种检测乳腺癌易感SNP位点基因型的生物制剂，所述生物制剂包括用于扩增表1所述SNP位点的引物对，或是包括用于扩增表1所述SNP位点的引物对和限制性内切酶。优选的，扩增所述SNP位点的引物对是按照PrimerPremier5.0引物设计软件或NCBI数据库提供的在线引物设计软件设计的引物对，在一优选实施例中本发明选用如SEQIDNO：1-8所示的四个乳腺癌易感SNP位点引物对。本发明选用的引物对特异性强，扩增效果好，扩增的序列亦可作为乳腺癌诊断、预测、评估等分子手段的生物标志物。再进一步地，本发明提供了一种乳腺癌辅助诊断的试剂盒，其包括表1所述SNP位点基因型的试剂。优选的，所述的试剂包括用于扩增表1所述SNP位点的引物对，或是包括用于扩增所述SNP位点的引物对和限制性内切酶。优选的，扩增所述SNP位点的引物对是按照PrimerPremier5.0引物设计软件或NCBI数据库提供的在线引物设计软件设计的引物对，在一优选实施例中本发明选用如SEQIDNO：1-8所示的四个乳腺癌易感SNP位点引物对，本发明选用的引物对特异性强，扩增效果好。优选的，所述试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂，如dNTPs、Taq酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等；还可以含有标准品和或对照品。本发明有益效果：本发明研究了易感SNP突变在乳腺癌辅助诊断的应用前景，阐述SNP对于乳腺癌进展的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明通过SNP基因型诊断制剂和诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明的技术方案具体包括：采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料；基因型检测：选择乳腺癌病例、与乳腺癌病例年龄匹配的健康女性对照，利用外显子测序，找出与乳腺癌相关的SNP；对筛选出的阳性关联SNP，进一步采用基因分型进行检测，验证其应用于临床诊断的可重复性；乳腺癌辅助诊断试剂盒的研制：根据乳腺癌病例和健康女性对照中基因型分布频率有显著差异的SNP开发SNP辅助诊断试剂盒。数据分析中各数值表示如下：1、ljb23_sift：SIFT分值version2.3，表示该变异对蛋白序列的影响，包含三个值，一是SIFT初始分值，二是转换后的值1-SIFT，三是T或者D。当该变异同时影响多个蛋白序列时，对每条蛋白序列有一个SIFT值，取最小值。SIFT分值越小越“有害”，表明该SNP导致蛋白结构或功能改变的可能性大；D:Deleterioussift0.05；2、ljb23_pp2hvar：利用PolyPhen2基于HumanVar数据库预测该变异对蛋白序列的影响，用于单基因遗传病。该列包含两个值，第一个是PolyPhen2分值，数值越大越“有害”，表明该SNP导致蛋白结构或功能改变的可能性大；第二个是D或P或BD:Probablydamaging＝0.909,P:possiblydamaging0.447＝0.957,P:possiblydamaging0.4532nM，以保证文库质量。3、上机测序库检合格，根据文库的有效浓度及数据产出需求进行IlluminaHiseq平台测序。4、数据分析与处理经过数据筛选、深度加工和生物信息学序列比对，最终确定“乳腺癌病例”组和“健康女性对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的53个SNP位点为优选敏感级位点。其中，本发明筛选了四个易感SNP位点，其变异对蛋白影响值如表2所示：表2SNP突变位点变异对蛋白影响值基因ljb23_siftljb23_pp2hvarljb23_pp2hdivljb23_mtMOGAT30.03,0.97,D0.003,B0.002,B0.878,0.122,NRBM12B0,1.00,D0.003,B0.002,B1.000,0.000,NSEC630.91,0.09,T0.005,B0.007,B1.000,1.000,DTFR20.31,0.69,T0.001,B0.001,B1.000,1.000,D该位点经过生物信息学分析，可以确认为乳腺癌候选标志物。实施例4利用危险度评分方法进一步分析SNP与乳腺癌的发病风险本发明人通过对2组样品“乳腺癌病例组”和“健康女性对照组”基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全外显子扫描样本中单个SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评价诊断的灵敏性和特异性，进而诊断这些SNP对乳腺癌发病的判断能力。对所有SNP标志物的联合分析发现，本发明所列出的四个易感SNP突变，其灵敏度和特异度都达到60％以上。因此，本发明人证明了该位点标志物能够很好地将健康女性对照和乳腺癌患者区分。实施例5单个SNP的基因分型1、取5例乳腺癌患者和5例健康女性对照DNA样本同实施例2；2、PCR扩增利用NCBI网站提供的在线引物设计软件https:www.ncbi.nlm.nih.govtoolsprimer-blastindex.cgi？LINK_LOC＝BlastHomeAd对4个易感SNP位点设计单个SNP的特异性扩增引物如表3所示。表3引物序列PCR反应体系如表4所示。PCR扩增程序为：95℃预变性10min，94℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸30min，于4℃保存，过夜需放置-20℃冷冻。表4反应体系组分加入量2×mix25μL上游引物10uM3.0μL下游引物10uM3.0μL模板5μL加入灭菌蒸馏水至50μL3、测序PCR扩增结束后，取5μL扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳，电泳30min，染色20min，然后将凝胶块置于凝胶成像仪中观察，根据比对Marker的片段大小情况，初步判断扩增片段是否正确。进而对符合要求的扩增产物进行纯化：采用Mag-BindOligonucleotidePurificationKit试剂盒，并按试剂盒要求进行操作。上样测序：采用ABI公司BigDye3.1SequencingKit试剂盒，并按试剂盒要求进行操作；用ABI公司3730型测序仪进行测序。4、结果分析通过Chromas序列分析软件，将测序结果与标准序列进行比对，寻找SNP位点，通过分析SNP位点处碱基的类型，就可以得到SNP位点的基因型。结果显示上述4个SNP位点为真实存在的变异。从而进一步确认所述4个SNP位点可用于乳腺癌的检测、治疗、诊断、预后评估等辅助诊断。实施例6用于乳腺癌辅助诊断SNP试剂盒的制作基于实施例5得到的引物组，组装本发明所述的用于乳腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增所述4个SNP位点的特异性引物，所述试剂盒还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照如确定基因型的标准品和空白对照等。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其他组织样品，通过最精简和特异的引物对检测SNP，再通过SNP谱辅助判断乳腺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表北京致成生物医学科技有限公司一种乳腺癌治病基因SEC63的新突变SNP位点及其应用P1902538SIPOSequenceListing1.0116DNA人工序列ArtificialSequence1ctgaggcacggtgggc16220DNA人工序列ArtificialSequence2ggcctagatgaaggtgaggc20320DNA人工序列ArtificialSequence3cacctgaggaggactggaga20420DNA人工序列ArtificialSequence4aaatgctcctggggtgactg20520DNA人工序列ArtificialSequence5ggcgacatactacctctggc20620DNA人工序列ArtificialSequence6tgctactgtggctccaggat20720DNA人工序列ArtificialSequence7agccaaacctcattccctgg20820DNA人工序列ArtificialSequence8ccctggtggaaatccaggtc20

权利要求：1.一种乳腺癌治病基因SEC63的新突变SNP位点，其特征在于，所述新突变SNP位点为人类第6号染色体第108250679位碱基由C到T的SNP位点突变，所述位点突变为SEC63：NM_007214:exon2:c.C164T:p.R55K。2.如权利要求1所述的新突变SNP位点在制备乳腺癌检测、诊断、治疗或预后产品中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为生物制剂，所述生物制剂包括用于扩增基因SEC63新突变SNP位点的引物对，或是包括用于扩增基因SEC63新突变SNP位点的引物对和限制性内切酶。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，扩增基因SEC63新突变SNP位点的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：5-6所示。5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒，其包括检测基因SEC63新突变SNP位点基因型的试剂。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增所述SNP位点的引物对，或是包括用于扩增所述SNP位点的引物对和限制性内切酶。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO：5-6所示。8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。

百度查询： 北京致成生物医学科技有限公司 一种乳腺癌治病基因SEC63的新突变SNP位点及其应用

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD