申请/专利权人：武汉大学

申请日：2019-07-09

公开（公告）日：2019-10-11

公开（公告）号：CN110314166A

主分类号：A61K31/56(20060101)

分类号：A61K31/56(20060101);A61P31/14(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.04.29#授权;2019.11.05#实质审查的生效;2019.10.11#公开

摘要：本发明公开了牛磺熊去氧胆酸在抗手足口病毒和水泡口炎病毒药物中的应用。在手足口病毒和水泡口炎病毒吸附侵入宿主细胞阶段，牛磺熊去氧胆酸通过改变病毒自身的活性而抑制手足口病毒和水泡口炎病毒感染宿主细胞。所述手足口病毒为EV71病毒和或CA16病毒。本发明牛磺熊去氧胆酸可用于制备抗手足口病毒和水泡口炎病毒吸附侵入的药物，尤其是EV71和CA16引起的手足口病的药物，本发明发现了TUDCA新的药用价值，为抗病毒、预防和或治疗病毒吸附侵入开创了新思路。

主权项：1.牛磺熊去氧胆酸在抗手足口病毒和水泡口炎病毒药物中的应用。

全文数据：牛磺熊去氧胆酸在抗手足口病毒和水泡口炎病毒药物中的应用技术领域本发明涉及抗病毒药物领域，具体涉及牛磺熊去氧胆酸Tauroursodeoxycholicacid，TUDCA在抗手足口病毒和水泡口炎病毒药物中的应用。背景技术手足口病hand,footandmouthdisease,HFMD是一种常见的儿童传染性疾病，好发于5岁以下的婴幼儿。该病的常见症状是发热和手、足、口等部位的红疹，某些重症表现为无菌性脑炎、肺水肿等，甚至导致死亡。2008年5月，卫生部将HFMD纳入法定报告的丙类传染病。肠道病毒71型EV71和柯萨奇A组16型CA16是引起HFMD的最主要病原体。在实验室病原学诊断结果的手足口病例中，EV71、CA16和其它肠道病毒阳性比例分别为44％、25％和31％。其中，EV71阳性占重症病例74％，占死亡病例93％。目前临床上对HFMD主要是对症及支持治疗，对于重症患者主要通过免疫球蛋白、糖皮质激素、干扰素等广谱抗病毒药物的注射来救治，并没有特效药物。在近些年的药物研发中，人们主要通过化合药物的设计、筛选以及尝试其他抗病毒药物的策略来开发针对EV71的药物。如Zhang等人的发现两种灵芝三萜类的化合物能够与EV71病毒衣壳蛋白的疏水口袋F位点结合，从而阻止病毒的脱衣壳过程；两性霉素B通过破坏附着物来抑制EV71感染宿主细胞时的内化过程；芦平曲韦、白杨素和化合物NK-1.8k等小分子药物，能够显著抑制3C蛋白酶的活性，从而显著降低EV71的复制水平。研究还发现芹菜素和蒽环类化合物伊达比星都可以抑制EV71IRES介导的翻译。但人们对多数药物的研究仍处于体外实验阶段，而且，在应用小分子药物进行治疗的过程中，耐药病毒株的产生值得人们引起注意。腺苷类似物NITD008是能够阻断黄病毒RNA合成的抑制剂，它对EV71同样有效，但研究发现EV713A或3D蛋白的突变可导致病毒对该药物产生抗性。一项来自英国的研究表明两种新型的EV71衣壳结合物NLD和ALD能够快速导致EV71VP1蛋白113位和123位残基发生突变，并产生耐药性。小分子药物芦平曲韦虽然其抗病毒效果在动物模型中展现了较好的保护性，但是在一些EV71感染的病例中却出现了因病毒突变而产生的耐药现象。因此，在临床治疗中，联合使用多种抗EV71病毒的小分子药物能够产生更好的治疗效果。虽然国内已有EV71疫苗上市，但对于EV71以外的病原体如柯萨奇病毒等并无防护作用，而且，由于EV71自身固有的高变异性，估计短时间内还不能完全消除该病毒的危害。因此，在EV71病毒治疗药物的研发过程中，也需要考虑更多新的方向。水泡口炎病毒VesicularStomatitisVirus，VSV为弹状病毒科Rhabdoviridae，自然感染牛、马、猪，症状与口蹄疫、猪水疱病难以区别，家畜的水疱液、水疱皮和淋巴结中含病毒最多。实验感染的宿主范围很广，常用豚鼠和小鼠。人也可受感染出现流感样症状。双翅目昆虫如蚊和白蛉是主要虫媒。VSV基因组为不分节段的单股负链RNA-ssRNA病毒，病毒的RNA无感染性。由于VSV相对简单的结构、较高的复制能力、快速的疾病过程及对人相对安全，所以被广泛的应用于研究RNA病毒感染的模型。中医自古就将熊胆视为药之瑰宝，拥有上千年用药历史。牛磺熊去氧胆酸Tauroursodeoxycholicacid，TUDCA于1902年在熊胆中发现，为熊胆的主要胆汁酸，人体胆汁中中也有低水平的存在。TUDCA化学名称为3α，7β二羟基胆烷酰-N-牛磺酸，是由熊去氧胆酸TUDCA的羧基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的一种亲水性胆盐，可与暴露于溶剂中的蛋白质疏水片段结合，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用。意大利贝思迪大药厂研制的滔罗特taurolite，1991年首次在意大利上市，2007年获准在中国销售，临床上主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎，且无明显的不良反应。TUDCA还可缓解多种神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森疾病和亨廷顿疾病，发挥线粒体稳定剂和细胞抗凋亡剂作用。已有研究发现TUDCA可以抑制流感病毒、埃博拉病毒和乙肝病毒的感染，但并未有TUDCA能够抑制手足口病毒感染和水泡口炎病毒及其机制的报导。发明内容本发明的目的在于提供牛磺熊去氧胆酸TUDCA在抗手足口病毒和水泡口炎病毒VSV药物中的应用，为预防和或治疗引起手足口病和水泡口炎病毒提供了新的有效药物。为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：牛磺熊去氧胆酸在抗手足口病毒和水泡口炎病毒药物中的应用。在手足口病毒和水泡口炎病毒吸附侵入宿主细胞阶段，牛磺熊去氧胆酸通过改变病毒自身的活性而抑制手足口病毒和水泡口炎病毒感染宿主细胞。所述手足口病毒为EV71病毒和或CA16病毒。本发明通过MTT法MTTCellProliferationandCytotoxicityAssayKit测得500μM和1mM浓度TUDCA对RD细胞没有毒性；EV71病毒感染前2小时-2hpi分别在细胞培养液中加入终浓度100，200，500，1000及3000μM的TUDCA，再用EV71MOI＝5感染RD细胞24小时后，用MTT法测得TUDCA对RD细胞的保护作用随着浓度增加而增强，TUDCA抑制EV71感染具有剂量依赖效应。本发明采用MTT法检测不同时间段用TUDCA处理对EV71感染RD细胞的保护作用，以此确定TUDCA抑制EV71感染RD细胞发生阶段：与没有加TUDCA的阴性对照组细胞存活率47.18％相比，在EV71入侵RD细胞阶段即0～2hpi时TUDCA对RD细胞产生最大的保护效果细胞存活率82.67％，而EV71病毒感染前-2～0hpi或在EV71病毒已经进入RD细胞后2～24hpi用TUDCA处理RD细胞没有明显的保护作用细胞存活率分别为39.60％和48.17％。进一步用Westernblot法检测TUDCA不同处理阶段对于RD细胞中EV71衣壳蛋白VP1及其复制酶3D表达水平的影响，同样表明TUDCA在EV71入侵RD细胞阶段对RD细胞产生最大的保护效果，TUDCA在EV71病毒入侵细胞前或已经进入RD细胞后没有明显保护作用。本发明经过实验表明TUDCA对于CA16感染Vero细胞和RD细胞48小时后仍具有保护作用，TUDCA对于CA16感染的Vero细胞和RD细胞的保护作用主要发生在病毒吸附侵入阶段，在病毒进入细胞后也能发挥作用，推测可能是TUDCA还有其它抑制CA16病毒的机制所致；同时实验表明TUDCA对VSV-GFP感染Vero细胞和293T细胞的强烈抑制作用几乎完全抑制病毒感染主要发生在病毒吸附入侵细胞阶段，在病毒入侵前处理细胞无抑制作用，而在病毒进入细胞后也有抑制作用，推测可能是TUDCA还有其它抑制VSV-GFP病毒的机制所致。本发明通过流式细胞技术检测指示剂的内吞效率来衡量TUDCA在病毒吸附侵入宿主细胞阶段对宿主细胞的内吞功能的影响，证实TUDCA在病毒吸附侵入阶段对于病毒感染的抑制不是由于对细胞内吞功能的抑制引起的。同时，TUDCA抑制EV71感染机制的体外结合实验证实，由于TUDCA改变了病毒自身的活性，而抑制手足口病毒吸附侵入宿主细胞，与TUDCA对细胞活性的影响无关。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：TUDCA可用于制备抗预防和或治疗手足口病毒和水泡口炎病毒VSV吸附侵入的药物，尤其是EV71和CA16引起的手足口病的药物，本发明发现了TUDCA新的药用价值，它通过与病毒粒子的作用抑制了病毒对宿主细胞的吸附进入，TUDCA在病毒吸附感染阶段的加入并不影响内吞指示剂pHrodo通过内吞进入细胞，TUDCA对于病毒入侵前的宿主细胞预处理没有作用，在病毒侵入细胞后也会产生一些抑制作用，为抗病毒、预防和或治疗病毒开创了新思路，为预防和或治疗引起手足口病提供了新的有效药物。附图说明图1为本发明实施例1500μM和1mM浓度TUDCA对RD细胞毒性试验结果；TUDCA在500μM和1mM浓度下对RD细胞没有细胞毒性，反而对细胞生长有些促进作用。图2为本发明实施例2TUDCA对EV71感染的RD细胞的保护作用具有剂量效应；TUDCA对EV71感染的RD细胞的保护作用随着TUDCA浓度增加而增强。图3为本发明实施例3TUDCA对EV71感染的抑制作用发生在EV71入侵细胞阶段的MTT检测法结果柱状图；TUDCA在EV71入侵细胞阶段0～2hpi对EV71感染的RD细胞产生最大的保护效果。图4为本发明实施例3TUDCA对EV71感染的抑制作用发生在EV71入侵细胞阶段的Westernblot法结果图Westernblot法检测TUDCA不同处理阶段对于细胞中EV71衣壳蛋白VP1及其复制酶3D表达水平的影响，与没有加TUDCA的对照组左起第3,4泳道相比，TUDCA在-2～9hpi全程处理组对EV71的VP1和3D蛋白复制产生极大抑制左起5,6泳道，在不同感染阶段用TUDCA处理时，TUDCA在病毒吸附入侵细胞时间段0～2hpi对病毒的复制产生最大的抑制效果左起第9,10泳道。图5为本发明实施例4TUDCA对CA16感染Vero细胞保护作用的MTT检测法结果柱状图；TUDCA对于CA16感染Vero细胞48小时具有保护作用。图6为本发明实施例4TUDCA抑制CA16感染Vero细胞发生阶段的MTT检测法结果柱状图；TUDCA对于CA16感染的Vero细胞的保护作用发生在病毒吸附侵入阶段和病毒进入细胞后。图7为本发明实施例4TUDCA抑制CA16感染RD细胞发生阶段的MTT检测法结果柱状图；TUDCA对于CA16感染的RD细胞的保护作用发生在病毒吸附侵入阶段和病毒进入细胞后。图8为本发明实施例5未感染VSV-GFP的Vero细胞阴性对照组的感染效率流式细胞分析结果图。图9为本发明实施例5VSV-GFP感染Vero细胞阳性对照组的感染效率流式细胞分析结果图；阳性对照组感染率为72.1％。图10为本发明实施例5VSV-GFP感染TUDCA全程处理-2～48hpi的Vero细胞的感染效率流式细胞分析结果图；TUDCA全程处理组感染率为0.29％。图11为本发明实施例5VSV-GFP病毒感染TUDCA预处理2小时-2～0hpi的Vero细胞的感染效率流式细胞分析结果图；VSV-GFP病毒感染预处理2小时-2～0hpi的细胞感染率为78.9％。图12为本发明实施例5VSV-GFP病毒感染在病毒吸附进入细胞阶段用TUDCA处理0～2hpi的Vero细胞的感染效率流式细胞分析结果图；VSV-GFP感染在病毒吸附进入细胞阶段用TUDCA处理0～2hpi的细胞的感染率为0.19％。图13为本发明实施例5VSV-GFP病毒吸附进入完成后再用TUDCA处理Vero细胞2～48hpi的病毒感染效率流式细胞分析结果图；在VSV-GFP病毒吸附进入完成后再用TUDCA处理Vero细胞2～48hpi的病毒感染效率为10.6％。图14为本发明实施例5未感染VSV-GFP的293T细胞阴性对照组的感染效率流式细胞分析结果图。图15为本发明实施例5VSV-GFP感染293T细胞阳性对照组的感染效率流式细胞分析结果图；阳性对照组感染率为14.8％。图16为本发明实施例5VSV-GFP感染TUDCA全程处理-2～24hpi的293T细胞的感染效率流式细胞分析结果图；TUDCA全程处理组感染率为0.016％。图17为本发明实施例5VSV-GFP病毒感染TUDCA预处理2小时-2～0hpi的293T细胞的感染效率流式细胞分析结果图；VSV-GFP病毒感染预处理2小时-2～0hpi的细胞感染率为20.2％。图18为本发明实施例5VSV-GFP病毒感染在病毒吸附进入细胞阶段用TUDCA处理0～2hpi的293T细胞的感染效率流式细胞分析结果图；VSV-GFP感染在病毒吸附进入细胞阶段用TUDCA处理0～2hpi的细胞的感染率为0.014％。图19为本发明实施例5VSV-GFP病毒吸附进入完成后再用TUDCA处理Vero细胞2～24hpi的病毒感染效率流式细胞分析结果图；在VSV-GFP病毒吸附进入完成后再用TUDCA处理293T细胞2～24hpi的病毒感染效率为0.79％。图20为本发明实施例6TUDCA预处理的EV71病毒在吸附感染阶段对细胞内吞指示剂pHrodo的流式细胞分析结果图EV71+TUDCA+pHrodo20min；内吞pHrodo的细胞占总细胞百分比为17.9％。图21为本发明实施例6DMSO预处理的EV71病毒在吸附感染阶段对细胞内吞指示剂pHrodo的流式细胞分析结果图EV71+DMSO+pHrodo20min；内吞pHrodo的细胞占总细胞百分比为16.1％。图22为本发明实施例6TUDCA预处理的EV71病毒在吸附感染阶段对细胞内吞指示剂pHrodo的流式细胞分析结果图EV71+TUDCA+pHrodo60min；内吞pHrodo的细胞占总细胞百分比为35.2％。图23为本发明实施例6DMSO预处理的EV71病毒在吸附感染阶段对细胞内吞指示剂pHrodo的流式细胞分析结果图EV71+DMSO+pHrodo60min；内吞pHrodo的细胞占总细胞百分比为31.4％。图24为本发明实施例6TUDCA在CA16病毒吸附感染阶段对细胞内吞指示剂pHrodo的流式细胞分析结果图CA16+TUDCA+pHrodo20min；内吞pHrodo的细胞占总细胞百分比为23.4％。图25为本发明实施例6DMSO在CA16病毒吸附感染阶段对细胞内吞指示剂pHrodo的流式细胞分析结果图CA16+DMSO+pHrodo20min；内吞pHrodo的细胞占总细胞百分比为17.0％。图26为本发明实施例6TUDCA在CA16病毒吸附感染阶段对细胞内吞指示剂pHrodo的流式细胞分析结果图CA16+TUDCA+pHrodo60min；内吞pHrodo的细胞占总细胞百分比为48.1％。图27为本发明实施例6DMSO在CA16病毒吸附感染阶段对细胞内吞指示剂pHrodo的流式细胞分析结果图CA16+DMSO+pHrodo60min；内吞pHrodo的细胞占总细胞百分比为32.3％。图28为本发明实施例7TUDCA抑制EV71感染机制的体外结合实验结果柱状图；TUDCA抑制EV71感染是通过TUDCA改变了EV71病毒自身的活性。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南第三版；D.L.斯佩克特等。本发明中MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒MTTCellProliferationandCytotoxicityAssayKit购自碧云天生物技术公司。本发明中超滤管型号：Μltra-0.530KMilliporeΜFC503096。本发明中“hpi”是指hourpostinfection，即从病毒感染开始之后的时间。【实施例1】TUDCA对RD细胞人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞毒性试验MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒是一种经典的细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒，被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测。MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan甲臜，在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解，然后通过酶标仪可以测定570nm波长附近的吸光度。细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。TUDCA对RD细胞毒性试验步骤如下：1MTT溶液的配制：用试剂盒中5mlMTT溶剂溶解25mgMTT，配制成5mgml的MTT溶液。配制后即可使用，或直接-20℃避光保存，也可以根据需要适当分装后-20℃避光保存。2RD细胞接种96孔板，进行过夜培养后并分别给予终浓度分别为500μM、1mM的TUDCA药物处理，以相同浓度的DMSO二甲基亚砜作为阴性对照，以未加任何药品的RD细胞孔作为空白对照细胞对照，每个浓度均做3个复孔，取均值。3RD细胞培养16小时后，每孔加入10μlMTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4小时。4每孔加入100μl试剂盒中的Formazan溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内再继续约4小时孵育，直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解。5在570nm测定吸光度，记录结果，根据以下公式计算细胞存活率：细胞存活率％＝实验孔OD值对照孔OD值×100％，试验结果见表1，表1实验组细胞存活率％细胞对照组100DMSO500μM对照102.04DMSO1mM对照97.95TUDCA500μM117.00TUDCA1mM125.03由表1中结果可知，TUDCA在500μM和1mM浓度下处理RD细胞16小时，都没有细胞毒性，反而对细胞的生长有一些促进作用。该结果柱状图如附图1。【实施例2】TUDCA对EV71感染细胞的保护作用具有剂量效应实验组中，在病毒感染前2小时-2hpi分别在细胞培养液中加入终浓度100μM、200μM、500μM、1000μM及3000μM的TUDCA；DMSO对照组阴性对照组在病毒感染前2小时-2hpi分别在细胞培养液中加入终浓度100μM、200μM、500μM、1000μM及3000μM的DMSO。之后进行病毒感染，采用EV71MOI＝5感染RD细胞24小时后，用MTT法测算TUDCA对被EV71感染的RD细胞的保护效果，细胞存活率即保护率用百分比表示。每个浓度均做3个复孔，取均值。表2结果显示，与DMSO对照组相比，TUDCA对RD细胞的保护作用随着浓度增加而增强，TUDCA抑制EV71感染具有剂量依赖效应。该结果柱状图如附图2。【实施例3】TUDCA对EV71感染的抑制作用主要发生在EV71入侵细胞的阶段病毒感染分为细胞外吸附侵入细胞内阶段及其后在细胞内的复制装配释放阶段。1.为了确定TUDCA抑制EV71感染发生阶段，分三个时间段分别用1mMTUDCA处理实验样本：1-2～0hpi组：在病毒感染前2小时加入含TUDCA的细胞培养液对细胞进行预处理，但在病毒感染时除去含有TUDCA的培养基，换上不含TUDCA的培养液；20～2hpi组：仅在病毒感染过程中即0～2hpi使用含有TUDCA的感染液，然后除去此感染液，而在这段感染时间之前或之后的细胞培养液都不含有TUDCA；32～24hpi组：0-2hpi的病毒感染液不含TUDCA，但在感染结束后，使用含有TUDCA的培养基直到24hpi收集病毒感染的细胞。以加入1mMDMSO的细胞孔作为阴性对照组，以空白的RD细胞孔作为细胞对照组空白对照组，本实验有3次独立实验，每次3个复孔，取均值。用MTT法检测上述不同时间段用TUDCA处理对EV71感染RD细胞的保护作用，结果见下表3。对3次独立实验的统计结果作柱形图，结果如附图3所示。表3TUDCA分不同时间段处理细胞存活率％细胞对照组100阴性对照组1mMDMSO47.18-2～0hpiTUDCA39.600～2hpiTUDCA82.672～24hpiTUDCA48.17结果如表3和附图3所示，与没有加TUDCA的阴性对照组细胞存活率47.18％相比，以上3组病毒感染阶段分别用1mMTUDCA处理实验样本，在EV71入侵细胞阶段即0～2hpi时TUDCA对细胞产生最大的保护效果细胞存活率82.67％，在病毒已经进入细胞后2～24hpi有轻微保护作用细胞存活率48.17％，而病毒感染前-2～0hpiTUDCA处理细胞不起保护作用细胞存活率39.60％，反而促进了病毒复制，这可能与TUDCA促进细胞活性有关。2.用Westernblot法检测TUDCA不同处理阶段对于细胞中EV71衣壳蛋白VP1及其复制酶3D表达水平的影响，每种处理做2孔重复。结果如附图4所示，与没有加TUDCA的对照组左起第3,4泳道相比，TUDCA在-2～9hpi全程处理组对EV71的VP1和3D蛋白复制产生极大抑制左起5,6泳道。而在不同感染阶段用TUDCA处理时，TUDCA在病毒吸附入侵细胞时间段0～2hpi对病毒的复制产生最大的抑制效果左起第9,10泳道；但在病毒感染前的-2～0hpi时间段左起第7,8泳道，或在病毒进入细胞后的2～9hpi左起第11,12泳道，TUDCA对病毒复制没有明显作用。以上实验结果表明TUDCA在EV71入侵细胞阶段对RD细胞产生最大的保护效果，TUDCA在病毒入侵细胞前或已经进入细胞后没有明显保护作用。【实施例4】TUDCA对CA16感染细胞的保护作用及其发生的阶段1.为了确定TUDCA对CA16感染Vero细胞保护作用，分三个时间段分别用1mMTUDCA处理实验样本：1-2～48hpi组：在病毒感染前2小时加入含TUDCA的细胞培养液对细胞进行预处理，使用含有TUDCA的培养基直到48hpi收集病毒感染的细胞；20～48hpi组：在病毒感染过程中即0～48hpi使用含有TUDCA的感染液，使用含有TUDCA的培养基直到48hpi收集病毒感染的细胞。32～48hpi组：0-2hpi的病毒感染液不含TUDCA，但在感染结束后，使用含有TUDCA的培养基直到48hpi收集病毒感染的细胞。以加入1mMDMSO的细胞孔作为阴性对照组，以空白的Vero细胞孔作为细胞对照组空白对照组，本实验有3次独立实验，每次3个复孔，取均值。用MTT法检测上述不同时间段用TUDCA处理对CA16感染Vero细胞的保护作用，结果见下表4，表4结果如表4和附图5所示，TUDCA对于CA16感染48小时后的Vero细胞具有保护作用，但在病毒已经进入细胞后2～48hpi保护作用降低。2.为了确定TUDCA抑制CA16感染Vero细胞的发生阶段，分三个时间段分别用1mMTUDCA处理实验样本：1-2～0hpi组：在病毒感染前2小时加入含TUDCA的细胞培养液对细胞进行预处理，但在病毒感染时除去含有TUDCA的培养基，换上不含TUDCA的培养液；20～2hpi组：仅在病毒感染过程中即0～2hpi使用含有TUDCA的感染液，然后除去此感染液，而在这段感染时间之前或之后的细胞培养液都不含有TUDCA；32～24hpi组：0-2hpi的病毒感染液不TUDCA，但在感染结束后，使用含有TUDCA的培养基直到24hpi收集病毒感染的细胞。以加入1mMDMSO的细胞孔作为阴性对照组，以空白的Vero细胞孔作为细胞对照组空白对照组，本实验有3次独立实验，每次3个复孔，取均值。用MTT法检测上述不同时间段用TUDCA处理对CA16感染Vero细胞的保护作用，结果见下表5，表5实验组Vero细胞存活率％空白对照组100阴性对照组1mMDMSO50.96-2～0hpiTUDCA42.840～2hpiTUDCA83.932～48hpiTUDCA72.87结果如表5和附图6所示，TUDCA对于CA16感染的Vero细胞的保护作用主要发生在病毒吸附侵入阶段，在病毒进入细胞后也发挥作用，推测可能是TUDCA还有其它抑制病毒复制的机制所致。3.为了确定TUDCA抑制CA16感染RD细胞的发生阶段，分三个时间段分别用1mMTUDCA处理实验样本：1-2～0hpi组:在病毒感染前2小时加入含TUDCA的细胞培养液对细胞进行预处理，但在病毒感染时除去含有TUDCA的培养基，换上不含TUDCA的培养液；20～2hpi组:仅在病毒感染过程中即0～2hpi使用含有TUDCA的感染液，然后除去此感染液，而在这段感染时间之前或之后的细胞培养液都不含有TUDCA；32～24hpi组:0-2hpi的病毒感染液不TUDCA，但在感染结束后，使用含有TUDCA的培养基直到24hpi收集病毒感染的细胞。以加入1mMDMSO的细胞孔作为阴性对照组，以空白的RD细胞孔作为细胞对照组空白对照组，本实验有3次独立实验，每次3个复孔，取均值。用MTT法检测上述不同时间段用TUDCA处理对CA16感染RD细胞的保护作用，结果见下表6，表6实验组RD细胞存活率％空白对照组100阴性对照组1mMDMSO49.01-2～0hpiTUDCA36.830～2hpiTUDCA74.322～48hpiTUDCA70.01结果如表6和附图7所示，TUDCA对于CA16感染的RD细胞的保护作用主要发生在病毒吸附侵入阶段，在病毒进入细胞后也发挥作用，推测可能是TUDCA还有其它抑制CA16病毒复制的机制所致。【实施例5】TUDCA抑制水泡口炎病毒VSV-GFP感染细胞及其发生的阶段用TUDCA在VSV-GFP病毒感染的不同时间阶段处理细胞，用MOI＝5的绿色荧光蛋白greenfluorescentprotein，GFP标记的水泡口炎病毒VSV-GFP分别感染Vero细胞48小时48hpi和293T细胞24小时后24hpi通过流式细胞仪检测带绿色荧光标记的细胞来计算被VSV-GFP感染的细胞百分比感染率％。以溶剂DMSO+病毒为阳性对照组DMSO组，以未感染病毒组为阴性对照组Mock组。1TUDCA处理VSV-GFP感染Vero细胞的感染效率流式细胞分析结果：1.1由图8-图13可知，阳性对照组图9的VSV-GFP感染Vero细胞的感染率是72.1％，TUDCA全程处理组图10的感染率只有0.29％，TUDCA全程处理组与阴性对照组图8相当，表明了TUDCA全程处理对于VSV-GFP感染Vero的具有完全的抑制作用。1.2分不同时间阶段用TUDCA处理Vero细胞分析结果：在病毒感染前2小时-2～0hpi处理细胞时感染率78.9％图11，比阳性对照组的72.1％还要高一些图9，不但表现出对病毒感染无抑制作用还有些促进作用；而用TUDCA在0～2hpi即病毒吸附进入细胞阶段处理时图12，则表现对病毒的完全抑制感染率只有0.19％；在病毒吸附进入完成后，即TUDCA在2～24hpi的处理组图13，对病毒也有表现出的一些抑制作用感染率10.6％。综上所述，TUDCA对VSV-GFP感染Vero细胞的强烈抑制作用几乎完全抑制病毒感染主要发生在病毒吸附入侵细胞阶段图12，感染率只有0.19％,在病毒进入细胞后也有一些抑制作用图13，感染率10.6％，但在病毒入侵前处理细胞无抑制作用，反而有些促进作用图11，感染率78.9％。2TUDCA处理VSV-GFP感染293T细胞的感染效率流式细胞分析结果：由图14-图19可知，可能由于感染时间较短，只有24小时24hpi，流式细胞仪测得的阳性对照组VSV-GFP对293T细胞的感染效率低，只有14.8％图15，但是实验结果仍然表明TUDCA对VSV-GFP感染293T细胞的强烈抑制作用几乎完全抑制病毒感染主要发生在病毒吸附入侵细胞阶段图18，感染率只有0.014％，在病毒进入细胞后也有一些抑制作用图19，感染率0.79％，但在病毒入侵前-2～0hpi处理细胞感染率为20.2％图17，比阳性对照组图15的感染率14.8％还要高些，表明病毒入侵前的TUDCA处理无抑制病毒感染的作用，反而有些促进作用。图8-图13与图14-图19，结论是一致的。【实施例6】TUDCA在病毒吸附侵入宿主细胞阶段不影响宿主细胞的内吞功能由于TUDCA对于病毒感染的抑制主要发生在病毒吸附侵入宿主细胞的阶段，病毒进入细胞后用TUDCA处理细胞只产生较弱的抑制作用，而在病毒入侵前用TUDCA处理细胞不会产生抑制病毒的效果，因此在病毒感染阶段加入细胞内吞指示剂pHrodo，然后通过流式细胞技术检测指示剂的内吞效率来衡量TUDCA在病毒吸附侵入宿主细胞阶段对宿主细胞的内吞功能的影响。具体步骤如下：1实验前一天将成熟的RD细胞用胰酶消化，以2×105个细胞mL均匀的铺在24孔板上。2用两组实验来检测TUDCA对病毒感染RD细胞时的内吞是否有影响。A组：将TUDCA或DMSO与EV71孵育30min后用超滤管超滤，弃掉RD细胞培养基并用PBS润洗一次再加250μLPBS。加入超滤后病毒液感染细胞，同时按40μgmL加入pHrodo指示剂P35368#，Invitrogen；B组：CA16病毒感染RD的同时分别加1mM的TUDCA或者DMSO，并同时加入同上浓度的pHrodo指示剂。3将上述加入pHrodo指示剂后的细胞置于CO2含量为5％的孵箱中，37℃进行孵育20min或60min。20min或60min后，去除孔中指示剂，胰酶消化，并将细胞悬浮于流式固定液PBS+2％FBS+1％PFA+1mMEDTA中，立即进行流式细胞荧光强度检测，选取BECKMANcytoflex流式细胞仪的FITC绿色荧光通道，每个样品计10,000个细胞。本实验的分组情况和结果如下表7，表7结果：如表7和附图20-27所示，从图表中可以看出，用TUDCA预处理EV71或在CA16感染宿主细胞的同时加入TUDCA，在加入内吞指示剂pHrodo后20min或60min通过流式细胞检测都没有发现pHrodo内吞进入细胞的效率受到抑制，反而会有一点升高，由此确定TUDCA在此阶段对于病毒感染的抑制不是由于对细胞内吞功能的抑制引起的。【实施例7】关于TUDCA抑制EV71感染机制的体外结合实验用TUDCA预处理细胞不能阻止EV71的感染，说明TUDCA阻止EV71感染不是由于对细胞的作用引起的。通过以下实验进一步证实TUDCA抑制EV71感染机制是由于TUDCA作用于病毒自身引起的：将EV71与1mM的TUDCA一起孵育后通过超滤作用除去含TUDCA的溶液作为实验组，以EV71与1mM的DMSO一起孵育后通过超滤作用除去含DMSO的溶液作为阴性对照组，以EV71与1mM的PBS一起孵育后通过超滤作用除去含PBS的溶液做空白对照组，通过TCID50测定各组经超滤后的EV71溶液的感染效率。具体步骤如下：1取3只干净的离心管，每管中加入500μlEV71病毒液100μlEV71病毒原液+400μlDMEM细胞培养液，第一管中加入TUDCA至终浓度1mM作为实验组，第二管中加入DMSO至终浓度1mM作为阴性对照组，第三管加等体积的PBS做空白对照组，混匀后37℃孵育30min。2将Μltra-0.5超滤内管插入所提供的一个微量离心管中，把孵育好的病毒液加入超滤内管中，盖上盖子。3将盖好盖子的超滤管放入离心转子中，让盖子的连接带朝着转子的中央；平衡超滤管。44℃、14,000×g离心约30min。5弃掉离心管中的液体，往内管中再加入500μlDMEM，轻轻混匀。6再次4℃、14,000×g离心约30min，以洗掉病毒液中游离的TUDCA。7将内管倒过来插在一个干净的微量离心管中，放在离心机中，让打开的盖子朝着转子的中央；以1,000×g离心2min，收集浓缩液。8采用TCID50法测定上述步骤7得到的EV71浓缩液的感染效率。结果如附图28所示，从图中可以看出，经过TUDCA处理的EV71的感染效率明显下降，这个体外TUDCA+EV71的实验以及实施例3的TUDCA预处理细胞不影响EV71复制实验共同证实：TUDCA抑制EV71感染是由于TUDCA改变了病毒自身的活性，从而抑制手足口病毒吸附侵入宿主细胞，与TUDCA对细胞活性的影响无关。综上，由实施例6-7可知，在手足口病毒和水泡口炎病毒侵入宿主细胞过程中，牛磺熊去氧胆酸TUDCA通过改变病毒自身的活性，从而抑制病毒感染细胞。

权利要求：1.牛磺熊去氧胆酸在抗手足口病毒和水泡口炎病毒药物中的应用。2.如权利要求1所述的牛磺熊去氧胆酸在抗手足口病毒和水泡口炎病毒药物中的应用，其特征在于：在手足口病毒和水泡口炎病毒吸附侵入宿主细胞阶段，牛磺熊去氧胆酸通过改变病毒自身的活性而抑制手足口病毒和水泡口炎病毒感染宿主细胞。3.如权利要求1或2所述的牛磺熊去氧胆酸在抗手足口病毒和水泡口炎病毒药物中的应用，其特征在于：所述手足口病毒为EV71病毒和或CA16病毒。

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