申请/专利权人：南阳师范学院

申请日：2018-04-10

公开（公告）日：2019-10-15

公开（公告）号：CN108440258B

主分类号：C07C43/23(20060101)

分类号：C07C43/23(20060101);C07C41/38(20060101);C07C41/36(20060101);A61P3/06(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2021.03.19#未缴年费专利权终止;2018.09.18#实质审查的生效;2018.08.24#公开

摘要：本发明公开了一种地稍瓜中新的菲类化合物的提取方法及医疗用途。本发明的技术方案要点为：将地稍瓜粉碎，用乙醇回流提取并浓缩，提取物用有机溶剂萃取然后进行活性筛选，将活性部位经硅胶柱、凝胶柱和半制备HPLC进行分离和纯化得到新的菲类化合物。本发明所得新的菲类化合物对猪胰腺脂肪酶具有明显的抑制作用。本发明选取药食两用植物—地稍瓜作为研究对象，该植物资源丰富，营养价值高，具有潜在的开发价值，本发明涉及的新菲类化合物结构新颖，具有较好的降血脂活性。

主权项：1.地稍瓜中新的菲类化合物的提取方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）将干燥地稍瓜粉碎，用80-90%乙醇回流提取3-4次，每次2-3h，于45-50℃的真空低温下回收溶剂干燥至无醇味，得到地稍瓜总浸膏；（2）将步骤（1）所得地稍瓜总浸膏混悬于水中，所述地稍瓜总浸膏与水的体积比为1:（1-3），静置18-24h，过滤得到上清液，然后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯依次进行萃取，得到各自萃取物；（3）对步骤（2）中得到的3种萃取物分别进行降血脂活性筛选，得氯仿萃取物；（4）将氯仿萃取物进行湿法上柱，所述湿法上柱的硅胶为100-200目，用石油醚-乙酸乙酯溶剂系统在体积比为18:1-2:1的范围内进行梯度洗脱，分别得到A、B、C、D4个馏分；（5）将步骤（4）所得馏分C用100%甲醇溶解，上SephadexLH-20凝胶柱，用95%乙腈洗脱，得到亚馏分C-1；（6）将步骤（5）所得亚馏分C-1再次湿法上柱，所述湿法上柱的硅胶为200-300目，用石油醚-丙酮溶剂系统在体积比为12:1-5:1的范围内进行梯度洗脱，得到C-1-1、C-1-2、C-1-33个次馏分；（7）将步骤（6）所得次馏分C-1-2用100%甲醇溶解，上ToyopearlHW-40柱，用90%甲醇洗脱，得到小馏分C-1-2-1；（8）将步骤（7）所得小馏分C-1-2-1经半制备HPLC反复的分离、纯化，最终得到单体化合物Ⅰ，其中，所述半制备HPLC的条件为色谱柱：C18柱，流动相：95-100%甲醇，吸收波长：205nm，化合物Ⅰ的结构式如下： 。

全文数据：地稍瓜中菲类化合物的提取方法及其医疗用途技术领域本发明属于医药技术领域，具体涉及地稍瓜中新的菲类化合物的提取方法及其医疗用途。背景技术地稍瓜（Cynanchumthesiodes），别名地稍花、女青、地瓜飘，为萝藦科鹅绒藤属植物。它主要分布在我国东北、华北、西北及江苏、河南、湖北等省，资源非常丰富。地稍瓜具有补肺气、清热降火、生津止渴、消炎止痛、通乳等功效。在民间有直接采食嫩果实的习惯，或把嫩果实凉拌食用，是药、食两用的野生蔬菜。现代研究发现，地稍瓜中含有三萜类、甾体类、黄酮类、酚酸类等化学成分。然而，目前关于地稍瓜药理作用的研究报道相对较少。为进一步开发利用地稍瓜这一丰富自然资源，挖掘其活性成分。本发明选取地稍瓜作为研究对象，对其化学成分进行系统研究，从中分离得到一种新菲类化合物，并对该化合物进行了降血脂活性筛选。迄今为止，尚未发现与该化合物制备方法和降血脂活性的参考文献或专利报道。发明内容本发明的目的在于克服上述问题，提供一种从地稍瓜中分离提取到的具有降血脂作用的菲类化合物，并采用光谱、质谱技术鉴定其结构，其化学结构如下：地稍瓜中新的菲类化合物的提取、分离方法，具体步骤如下：（1）将干燥地稍瓜粉碎，用80-90%乙醇回流提取3-4次，每次2-3h，于45-50℃的真空低温下回收溶剂干燥至无醇味，得到地稍瓜总浸膏；（2）将步骤（1）所得地稍瓜总浸膏混悬于水中，所述地稍瓜总浸膏与水的体积比为1:（1-3），静置18-24h，过滤得到上清液，然后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯依次进行萃取，得到各自萃取物；（3）根据生物活性指导分离的方法，对步骤（2）中得到的3种萃取物分别进行降血脂活性筛选，结果表明氯仿萃取物对猪胰腺脂肪酶具有明显的抑制作用；（4）将氯仿萃取物进行湿法上柱，所述湿法上柱的硅胶为100-200目，用石油醚-乙酸乙酯溶剂系统在体积比为18:1-2:1的范围内进行梯度洗脱，分别得到A、B、C、D4个馏分；（5）将步骤（4）所得馏分C用100%甲醇溶解，上SephadexLH-20凝胶柱，用95%乙腈洗脱，得到亚馏分C-1；（6）将步骤（5）所得亚馏分C-1再次湿法上柱，所述湿法上柱的硅胶为200-300目，用石油醚-丙酮溶剂系统在体积比为12:1-5:1的范围内进行梯度洗脱，得到C-1-1、C-1-2、C-1-33个次馏分；（7）将步骤（6）所得次馏分C-1-2用100%甲醇溶解，上ToyopearlHW-40柱，用90%甲醇洗脱，得到小馏分C-1-2-1；（8）将步骤（7）所得小馏分C-1-2-1经半制备HPLC反复的分离、纯化，最终得到单体化合物Ⅰ，其中，所述半制备HPLC的条件为色谱柱：C18柱，流动相：95-100%甲醇，吸收波长：205nm。本发明还提供了上述所得菲类化合物在降血脂方面的医疗用途。本发明的有益效果是：本发明选取药食两用植物—地稍瓜作为研究对象，该植物资源丰富，营养价值高，具有潜在的开发价值。本发明涉及的新菲类化合物结构新颖，具有较好的降血脂活性。附图说明图1为本发明所得化合物Ⅰ的提取、分离流程图；图2为本发明所得化合物Ⅰ的偶联相关图。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围之内。实施例1化合物Ⅰ的提取与分离（1）将15.0kg的干燥地稍瓜粉碎，用85%乙醇回流提取3次，每次3h，45℃真空低温下回收溶剂干燥至无醇味，得到1.45kg地稍瓜总浸膏；（2）将步骤（1）所得地稍瓜总浸膏混悬于水中（VV=1:2），静置20h，过滤得到上清液，然后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯依次进行萃取，蒸干溶剂分别得到50.8g石油醚萃取物、94.3g氯仿萃取物、186.7g乙酸乙酯萃取物；（3）根据生物活性指导分离的方法，对步骤（2）中得到的3种萃取物分别进行降血脂活性筛选，结果表明氯仿萃取物对猪胰腺脂肪酶具有明显的抑制作用；（4）将氯仿萃取物（活性部位）进行湿法上柱（硅胶，100-200目）,用石油醚-乙酸乙酯（体积比分别为15:1、9:1、6:1和3:1）溶剂系统进行梯度洗脱，分别得到A（11.7g）、B（24.6g）、C（33.2g）、D（12.8g）等4个馏分；（5）将步骤（4）所得馏分C用100%甲醇溶解，上SephadexLH-20凝胶柱，用95%乙腈洗脱，得到亚馏分C-1（28.5g）；（6）将步骤（5）所得亚馏分C-1再次湿法上柱（硅胶，200-300目），用石油醚-丙酮（体积比分别为10:1、8:1、6:1）溶剂系统进行梯度洗脱，得到C-1-1（6.5g）、C-1-2（11.4g）、C-1-3（8.5g）3个次馏分；（7）将步骤（6）所得次馏分C-1-2用100%甲醇溶解，上ToyopearlHW-40柱，用90%甲醇洗脱，得到小馏分C-1-2-1（9.2g）；（8）将步骤（7）所得小馏分C-1-2-1经半制备HPLC反复的分离、纯化，最终得到单体化合物Ⅰ（9.65mg），所述半制备HPLC的条件为色谱柱：C18柱，流动相：95-100%甲醇，吸收波长：205nm。实施例2化合物Ⅰ的提取与分离（1）将12.0kg的干燥地稍瓜粉碎，用80%乙醇回流提取3次，每次2h，45℃真空低温下回收溶剂干燥至无醇味，得到1.22kg地稍瓜总浸膏；（2）将步骤（1）所得地稍瓜总浸膏混悬于水中（VV=1:1），静置18h，过滤得到上清液，然后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯依次进行萃取，蒸干溶剂分别得到44.3g石油醚萃取物、86.5g氯仿萃取物、166.5g乙酸乙酯萃取物；（3）根据生物活性指导分离的方法，对步骤（2）中得到的3种萃取物分别进行降血脂活性筛选，结果表明氯仿萃取物对猪胰腺脂肪酶具有明显的抑制作用；（4）将氯仿萃取物（活性部位）进行湿法上柱（硅胶，100-200目）,用石油醚-乙酸乙酯（体积比分别为12:1、8:1、5:1、2:1）溶剂系统进行梯度洗脱，分别得到A（10.8g）、B（22.6g）、C（31.8g）、D（11.5g）等4个馏分；（5）将步骤（4）所得馏分C用100%甲醇溶解，上SephadexLH-20凝胶柱，用95%乙腈洗脱，得到亚馏分C-1（25.6g）；（6）将步骤（5）所得亚馏分C-1再次湿法上柱（硅胶，200-300目），用石油醚-丙酮（体积比分别为9:1、7:1、5:1）溶剂系统进行梯度洗脱，得到C-1-1（6.2g）、C-1-2（10.8g）、C-1-3（7.4g）3个次馏分；（7）将步骤（6）所得次馏分C-1-2用100%甲醇溶解，上ToyopearlHW-40柱，用90%甲醇洗脱，得到小馏分C-1-2-1（8.8g）；（8）将步骤（7）所得小馏分C-1-2-1经半制备HPLC反复的分离、纯化，最终得到单体化合物Ⅰ（8.83mg），所述半制备HPLC的条件为色谱柱：C18柱，流动相：95-100%甲醇，吸收波长：205nm。实施例3化合物Ⅰ的提取与分离（1）将18.0kg的干燥地稍瓜粉碎，用90%乙醇回流提取4次，每次3h，50℃真空低温下回收溶剂干燥至无醇味，得到1.76kg地稍瓜总浸膏；（2）将步骤（1）所得地稍瓜总浸膏混悬于水中（VV=1:3），静置24h，过滤得到上清液，然后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯依次进行萃取，蒸干溶剂分别得到53.4g石油醚萃取物、102.6g氯仿萃取物、198.5g乙酸乙酯萃取物；（3）根据生物活性指导分离的方法，对步骤（2）中得到的3种萃取物分别进行降血脂活性筛选，结果表明氯仿萃取物对猪胰腺脂肪酶具有明显的抑制作用；（4）将氯仿萃取物（活性部位）进行湿法上柱（硅胶，100-200目）,用石油醚-乙酸乙酯（体积比分别为18:1、12:1、7:1、4:1）溶剂系统进行梯度洗脱，分别得到A（12.5g）、B（25.8g）、C（40.5g）、D（11.7g）等4个馏分；（5）将步骤（4）所得馏分C用100%甲醇溶解，上SephadexLH-20凝胶柱，用95%乙腈洗脱，得到亚馏分C-1（32.6g）；（6）将步骤（5）所得亚馏分C-1再次湿法上柱（硅胶，200-300目），用石油醚-丙酮（体积比分别为12:1、9:1、7:1）溶剂系统进行梯度洗脱，得到C-1-1（7.7g）、C-1-2（12.7g）、C-1-3（8.6g）3个次馏分；（7）将步骤（6）所得次馏分C-1-2用100%甲醇溶解，上ToyopearlHW-40柱，用90%甲醇洗脱，得到小馏分C-1-2-1（11.5g）；（8）将步骤（7）所得小馏分C-1-2-1经半制备HPLC反复的分离、纯化，最终得到单体化合物Ⅰ（10.65mg），所述半制备HPLC的条件为色谱柱：C18柱，流动相：95-100%甲醇，吸收波长：205nm。实施例4化合物Ⅰ的鉴定本发明化合物Ⅰ为无色粉末（甲醇），HR-ESI-MSmz437.2653[M+Na]+提示其分子组成为C26H22O5calcd.forC26H22O5Na，437.2647。化合物Ⅰ的UVMeOHλmax:205，260，310nm；IRνmax:3387.1，2985.6，2878.3，1614.7，1435.8cm-1；1HNMR（CD3COCD3，400MHz）和13CNMR（CD3COCD3，100MHz）数据见表1。根据化合物Ⅰ的波谱数据和HMBC、2DNOESY、1H-1HCOSY等偶联相关图（见图2），最终鉴定化合物Ⅰ为一个新菲类化合物。表1化合物Ⅰ的1HNMR、13CNMR和HMBC相关数据实施例5化合物Ⅰ的降脂活性1.实验方法（1）取氯化钙0.292g，用40mL0.2molL的三羟甲基氨基甲烷溶液进行溶解，用1.0molL盐酸溶液调节其pH值为8.1，加水稀释至100mL，配得三羟甲基氨基甲烷缓冲液；（2）用三羟甲基氨基甲烷缓冲液将化合物Ⅰ配置成不同浓度的样品液；取10mg猪胰腺脂肪酶用三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制成1mgmL的酶溶液；将4-甲基伞形酮油酸酯用三羟甲基氨基甲烷缓冲液配置成浓度为0.1mmolL的底物溶液；同时，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液配制0.1mmolL的柠檬酸钠溶液，用1.0molL盐酸溶液调节其pH值为4.2备用；（3）取步骤（2）中30μL的各样品液加入到30μL酶溶液中，充分混匀；再加入60μL底物溶液，在25℃孵育20min，用110μL柠檬酸钠溶液终止反应，待测样品的终浓度分别为640、320、160、80、40、20μgmL。（4）将各样品液、酶溶液和底物溶液混合作为样品组，各样品液与底物溶液混合作为背景组，酶溶液和底物溶液混合作为对照组，底物溶液作为空白对照组；分别在320nm激发光和450nm发射光测定其吸光值，根据公式计算化合物的脂肪酶抑制率，见表2。脂肪酶抑制率计算公式如下：脂肪酶抑制率%=1-样品组-背景组对照组-空白对照组×100%。2.结果实验数据表明，本发明涉及的新菲类化合物对猪胰腺脂肪酶具有明显的抑制作用，其脂肪酶抑制率高达91.52%。因此，本发明的化合物Ⅰ具有显著的降血脂活性。实验结果见表2。表2化合物Ⅰ的降脂活性结果

权利要求：1.地稍瓜中新的菲类化合物的提取方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）将干燥地稍瓜粉碎，用80-90%乙醇回流提取3-4次，每次2-3h，于45-50℃的真空低温下回收溶剂干燥至无醇味，得到地稍瓜总浸膏；（2）将步骤（1）所得地稍瓜总浸膏混悬于水中，所述地稍瓜总浸膏与水的体积比为1:（1-3），静置18-24h，过滤得到上清液，然后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯依次进行萃取，得到各自萃取物；（3）对步骤（2）中得到的3种萃取物分别进行降血脂活性筛选，得氯仿萃取物；（4）将氯仿萃取物进行湿法上柱，所述湿法上柱的硅胶为100-200目，用石油醚-乙酸乙酯溶剂系统在体积比为18:1-2:1的范围内进行梯度洗脱，分别得到A、B、C、D4个馏分；（5）将步骤（4）所得馏分C用100%甲醇溶解，上SephadexLH-20凝胶柱，用95%乙腈洗脱，得到亚馏分C-1；（6）将步骤（5）所得亚馏分C-1再次湿法上柱，所述湿法上柱的硅胶为200-300目，用石油醚-丙酮溶剂系统在体积比为12:1-5:1的范围内进行梯度洗脱，得到C-1-1、C-1-2、C-1-33个次馏分；（7）将步骤（6）所得次馏分C-1-2用100%甲醇溶解，上ToyopearlHW-40柱，用90%甲醇洗脱，得到小馏分C-1-2-1；（8）将步骤（7）所得小馏分C-1-2-1经半制备HPLC反复的分离、纯化，最终得到单体化合物Ⅰ，其中，所述半制备HPLC的条件为色谱柱：C18柱，流动相：95-100%甲醇，吸收波长：205nm，化合物Ⅰ的结构式如下：。2.权利要求1所述方法提取的地稍瓜中新的菲类化合物在制备降血脂药物方面的用途。

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