申请/专利权人：武汉瀚海新酶生物科技有限公司

申请日：2019-09-19

公开（公告）日：2019-12-03

公开（公告）号：CN110527673A

主分类号：C12N9/04(20060101)

分类号：C12N9/04(20060101);C12N15/70(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2023.10.27#发明专利申请公布后的驳回;2020.07.21#实质审查的生效;2019.12.03#公开

摘要：本发明公开了一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，具体包括以下步骤：S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建，S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入，S3、菌的培养，S4、菌体破碎过滤处理，S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备，S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化，本发明涉及生物工程技术领域。该葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，可实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，来提高葡萄糖脱氢酶的纯度，很好的达到了通过采用层析和分离透析两种提纯方法共同协作，来使葡萄糖脱氢酶的纯度得到很好提高的目的，大大提升了提纯效果，很好的降低了提纯得到的葡萄糖脱氢蛋白酶中杂质蛋白的含量，十分有利于葡萄糖脱氢酶在其他领域的应用。

主权项：1.一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建：选取来自乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶基因为模板，提取土曲霉基因组，设计引物，进行PCR反应，克隆葡萄糖脱氢酶基因；S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入：将步骤S1扩增后的葡萄糖脱氢酶基因插入到表达载体的多克隆位点上，将构建成的质粒转化到大肠杆菌中；S3、菌的培养：然后将该步骤S2中得到的转化体用培养瓶，培养在400-450mL培养基中，在温度为36-37℃下通过震荡设备培养8-12h，然后接种在5-7L的培养基中，培养开始后2-3小时后，添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度达到0.3mmolL，然后再培养10-15小时，通过离心设备分离菌体并收集菌体；S4、菌体破碎过滤处理：之后用0.5-0.85％的NaCl溶液洗2-3次，将该菌体悬浮在碳酸氢钠缓冲液中，然后用破碎设备破碎后，离心分离2-3次，未破碎的菌体和沉淀物通过离心过滤设备除去；S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备：之后将步骤S4分离后的上清液进行超离心分离，得到作为水溶液级分的上清液，然后将该级分在缓冲液中2-4℃透析8-12h，从而得到葡萄糖脱氢酶的粗纯化物；S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化：将步骤S5制备的粗纯化物在加入柱前，先在0.1-0.2μm过滤器上过滤，然后使用CM-5PW柱，使用缓冲液及NaCl进行阳离子交换层析，然后将层析洗脱出的葡萄糖脱氢酶蛋白质进行集中收集，之后对收集的蛋白质转移至透析离心设备中，通过密度梯度离心对葡萄糖脱氢蛋白酶进行充分纯化沉淀分离，最后对再次纯化的葡萄糖脱氢蛋白酶进行收集即可。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用

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