申请/专利权人：上海风劲生物医药科技有限公司

申请日：2016-06-23

公开（公告）日：2020-01-10

公开（公告）号：CN107537025B

主分类号：A61K38/18(20060101)

分类号：A61K38/18(20060101);A61K48/00(20060101);A61P1/00(20060101);A61P35/00(20060101);A61P1/12(20060101);A61P1/16(20060101);A61P1/18(20060101);A61P3/04(20060101);A61P3/10(20060101);A61P3/00(20060101);A61P25/00(20060101);A61P37/02(20060101);A61P25/16(20060101);A61P25/22(20060101);A61P25/24(20060101);C12Q1/6883(20180101);G01N33/50(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.01.10#授权;2018.02.02#实质审查的生效;2018.01.05#公开

摘要：本发明涉及Metrnl蛋白或基因在调节抗菌肽表达中的应用。本发明采用免疫组化和定量PCR显示了人体和小鼠胃肠道组织中Metrnl高表达，首次建立了Metrnl肠道上皮细胞特异性敲除小鼠模型，基于该模型证实肠道上皮细胞缺乏Metrnl引起肠道抗菌肽表达下调。因此，Metrnl蛋白或基因及其增效剂可用于制备治疗或改善抗菌肽不足或失衡疾病的试剂，制备调节抗菌肽表达的试剂，并用于抗菌肽相关疾病药物的开发。

主权项：1.Metrnl蛋白或基因及其增效剂的用途，其特征在于，用于制备调节个体肠道抗菌肽表达的药物，所述抗菌肽为Reg3g、Reg3b或lactotransferrin。

全文数据：MetrnI蛋白或基因在调节抗菌肽表达中的应用技术领域[0001]本发明涉及分子生物学和生物医药领域，具体地说，涉及Metrnl蛋白或基因在调节抗菌肽表达中的应用背景技术[0002]Metrnl蛋白共由311个氨基酸组成，由metrnl基因编码，大小为30kDa左右。人Metrnl蛋白的氨基酸序列见NP_001004431.1。[0003]中国专利CN200980137344.4,发明名称“生长因子METRNL的治疗用途”，公开了METRNL是一种具有神经元保护和或神经发生作用的神经生存和生长因子，可用于治疗神经系统的疾病、疾患或损害。中国专利ZL201310525184.9,公开了Metrnl蛋白在制备降血糖药物或保健食品中的应用。中国专利ZL201310525181.5，公开了Metrnl蛋白在制备降血脂药物或保健食品中的应用。[0004]抗菌肽是体内产生的一类具有抗菌活性的多肽物质，分子量多在2000-7000道尔顿左右，常由20-60个氨基酸残基组成。由于这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，故被称之为抗菌肽。随着人们研究工作的开展，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用。然而，抗菌肽的功能并不限于此，最近研究表明，抗菌肽还参与免疫炎症反应，参与代谢调节，参与神经发育，并可能与受伤后神经肌肉恢复等相关。目前，抗菌肽常作为动物饲料添加剂或耐药“超级菌”感染的临床治疗。但是其应用还可能包括治疗炎症免疫性疾病，调节肠道菌群失调，治疗神经系统性疾病等等。[0005]肠道内数以亿计的微生物及其代谢产物在人体能量代谢、营养物质吸收、先天和获得性免疫、胃肠道功能等方面发挥着重要作用，一旦宿主与肠道微生物之间共栖共生的稳态被打破，就会诱发多种人类疾病。目前已经认识到肠道微生物与人类健康和疾病的密切关系，而肠道分泌的抗菌肽具有维持菌群稳定、促血管生成和免疫调节等多种生理功能。[0006]目前关于Metrnl蛋白和基因的功能研究报道极少，现有文献尚无Metrnl调节肠道抗菌肽表达的相关报道。发明内容[0007]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供Metrnl蛋白或基因及其增效剂的用途。[0008]本发明的另一目的是，提供一种筛选治疗或改善抗菌肽不足或相关疾病的物质的方法。[0009]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：[0010]Metrnl蛋白或基因及其增效剂的用途，用于制备调节抗菌肽表达的药物。[0011]Metrnl蛋白或基因及其增效剂的用途，用于制备治疗或改善抗菌肽不足或相关疾病的药物。[0012]Metrnl蛋白或基因及其增效剂的用途，用于制备治疗或改善肠道微生物失调或相关疾病的药物。[0013]Metrnl蛋白或基因及其增效剂的用途，其特征在于，用于：[0014]a制备提高肠道抗菌肽表达的试剂;或[0015]b制备治疗调节肠道菌群失调的试剂。[0016]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：[0017]—种筛选治疗或改善抗菌肽不足或相关疾病的物质的方法，包括以下步骤：[0018]a将候选物质与含有Metrnl蛋白或基因的体系接触，[0019]b观察候选物质对于Metrnl蛋白或基因表达及活性的影响，其中，若所述候选物质能够促进Metrnl基因表达或提高Metrnl蛋白活性，则所述候选物质是治疗或改善抗菌肽不足或相关疾病的潜在物质。[0020]作为一种优选实施方式，所述的增效剂可选自激动剂、上调剂或稳定剂等。[0021]作为一种优选实施方式，所述抗菌肽包括但不限于Reg3g、Reg3b或Iactotransferrin0[0022]作为一种优选实施方式，所述Metrnl蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。[0023]所述相关疾病包括消化系统疾病、内分泌系统疾病、心血管系统疾病、神经系统疾病、免疫系统疾病。[0024]所述消化系统疾病包括炎症性肠病（IBD、结直肠肿瘤、肠易激综合征IBS、乳糜泻、肝硬化、非酒精性脂肪性肝病NAFLD、胆石症、急性胰腺炎等。[0025]所述内分泌系统疾病包括肥胖、糖尿病、脂质代谢紊乱、代谢综合征等。[0026]所述神经系统疾病包括自闭症、多发性硬化、帕金森病、焦虑和抑郁症等。[0027]本发明优点在于：[0028]本发明采用免疫组化和定量PCR显示了人体和小鼠胃肠道组织中Metrnl高表达，首次建立了Metrnl肠道上皮细胞特异性敲除小鼠模型，基于该模型证实肠道上皮细胞缺乏Metrnl引起肠道抗菌肽表达下调。因此，Metrnl蛋白或基因及其增效剂可用于制备治疗或改善抗菌肽不足或失衡疾病的试剂，制备调节抗菌肽表达的试剂，并用于抗菌肽相关疾病药物的开发。附图说明[0029]附图1为人、大鼠、小鼠Metrnl氨基酸序列全长比对图。[0030]附图2为免疫组化检测Metrnl蛋白在人不同组织中的表达情况。[0031]附图3为定量PCR检测Metrnl在小鼠不同组织中的表达情况。[0032]附图4为Metrnl肠上皮细胞特异性敲除小鼠的培育流程。[0033]附图5为Metrnl肠上皮细胞特异性敲除小鼠的基因型鉴定。[0034]附图6为定量PCR验证Metrnl肠上皮细胞特异性敲除小鼠Metrnlv_。[0035]附图7为免疫组化验证Metrnl肠上皮细胞特异性敲除小鼠Metrnl7一）。[0036]附图8为Metrnl对肠道抗菌肽表达的调控作用。具体实施方式[0037]下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。[0038]Metrnl蛋白及基因[0039]本文中，术语“Metrnl蛋白”、“Metrnl多肽”可互换使用。人、大鼠、小鼠Metrnl氨基酸序列全长比对图见图1。可参考文献:CNSNeurosciTher.2014Apr;204:344-354〇[0040]在本文中，所用的Metrnl蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离纯化自哺乳动物。此外，所述Metrnl蛋白也可以是人工制备的，比如根据常规基因工程技术来制备得到。任何合适的Metrn1蛋白均可适用于本发明。所述Metrn1蛋白包括全长的Metrn1蛋白或其生物活性片段。优选地，可以与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列基本相同。[0041]经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的Metrnl蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。Metrnl蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述氨基酸替代的序列并不影响其活性或保留了其部分活性。适当替换氨基酸是本领域内的公知技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变已知分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必需氨基酸区域改变单个氨基酸并不会改变生物活性。[0042]任何一种Metrnl蛋白的生物活性片段均可以应用到本发明中。在这里，Metrnl蛋白的生物活性片段的含义是指一种多肽，其仍然能保持全长的Metrnl蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%、60%至99%或者100%的全长Metrnl蛋白的活性。[0043]本发明也可以采用经修饰或改良的全部或部分氨基酸的Metrn1蛋白，比如，可以为了促进半衰期、有效性、代谢和或蛋白的效力而加以修饰或改良的Metrnl蛋白。所述经过修饰或改良的Metrn1蛋白可以是一种Metrn1蛋白的共辄物，或其可被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的Metrn1蛋白或基因可以与天然Metrnl蛋白或基因有一定的不同点，但也能够具有类似生物活性，且不会带来其它不良反应或毒性。也就是说，任何不影响Metrnl蛋白的生物活性或者说是基因的生物学功能的变化形式都可用于本发明中。[0044]Metrnl增效剂及其用途[0045]所述的“Metrnl增效剂”包括了激动剂、上调剂、稳定剂等，是指任何可提高Metrnl的活性、提高Metrn1的稳定性、上调Metrn1的表达、增加Metrn1有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子等。所述的生物分子可以是核酸水平包括DNA、RNA的，蛋白水平的，也可以是上调Metrnl表达的病毒产品等。[0046]实施例IMetrnl在人与小鼠各种组织中表达分布研究[0047]1实验材料[0048]人体多种器官组织芯片：购于上海芯超生物科技有限公司，共包括19种人体器官组织，分别是：肾上腺、脑、小脑、大肠、小肠、胃、肾、肝、肺、胰、卵巢、睾丸、前列腺、子宫、甲状腺、骨骼肌、皮肤、心脏、脾。[0049]C57小鼠：购于上海南方模式生物科技发展有限公司。[0050]一抗Metrnl:购于Sigma公司。[0051]二抗羊抗兔:购于武汉博士德生物工程有限公司。[0052]Trizol试剂：购于Invitrogen公司。[0053]Metrnl引物：由上海生工生物工程有限公司合成。[0054]2实验方法[0055]2.1免疫组化染色观察Metrnl在人各种组织中的表达分布[0056]组织芯片60°C拷片后脱錯水化，使用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶;在梓檬酸缓存液中高温高压处理技术进行抗原修复;使用山羊血清37°C封闭15min;分别在标本上滴加抗Metrnl—抗，4°C过夜孵育；漂洗后滴加生物素化的二抗，37°C孵育40min;漂洗后滴加SAB复合物，37°C孵育40min，漂洗后进行DAB显色观察。[0057]2.2实时定量PCR检测Metrnl在小鼠各种组织中的表达分布[0058]取C57小鼠多种组织，包括:肌肉、肝脏、脂肪、小肠、胃、结肠、心脏、脾脏、脑、肺、睾丸、血液、肾脏，用Triz〇1提取RNA，并逆转录为cDNA，运用Metrn1上下游引物：CTGGAGCAGGGAGGCTTATTTSEQIDN0·2;GGACAACAAAGTCACTGGTACAGSEQIDN0·3，进行定量PCR检测，观察小鼠各组织中Metrnl的表达分布。[0059]3实验结果[0060]如图2所示，免疫组化的结果显示，在检测的多种人体组织中，Metrnl在胃肠道与皮肤的表达是最高的。[0061]如图3所示，定量PCR的结果显示，在检测的小鼠多种组织中，Metrnl在胃肠道的表达也是最高的。[0062]实施例2Metrnl肠道上皮特异性敲除小鼠的构建和鉴定[0063]1实验材料[0064]Villin-Cre小鼠：购自TheJacksonLaboratory，B6.Cg-TgVill_Cre1000GumJJAXstocknumber:021504〇[0065]鼠尾基因组提取试剂盒:购于Zymo公司。[0066]2实验方法[0067]2.IMetrnl肠道上皮特异性敲除小鼠培育[0068]2·1·IMetrnllcixP1〇xM、鼠培育[0069]MetrnllcixivicixlVh鼠为实验室早期构建，已用于培育多种组织特异性敲除小鼠，具体培育方法可参见参考文献diabetes.2015Dec;6412:4011-22。[0070]2.1·2Metrnl1cixP1cixPViIlin-Cre小鼠的培育[0071]将Metrnl1cixP1cixP小鼠与ViIlin-Cre小鼠杂交，得到的MetrnllcixPwtViIlin-Cre小鼠，再与MetrnllQx[V1°xP小鼠进行回交，得到的MetrnllQx[V1°xPViIlin-Cre即为Metrnl肠道上皮细胞特异性敲除小鼠Metrnl+，培育流程见图4。[0072]2.2Metrn1肠道上皮特异性敲除小鼠的基因型鉴定[0073]使用鼠尾基因组提取试剂盒提取小鼠鼠尾基因组DNA，使用Villin-Cre以及Metrnl-flox基因上下游引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳，分别在IOObp以及243bp同时出现目的条带才能确定为Metrnl肠道上皮特异性敲除小鼠。[0074]Villin-Cre以及Metrnl-flox基因引物序列为：[0075]Villin-Cre上游引物：GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATCSEQIDN0.4，[0076]Villin-Cre下游引物：GTGAAACAGCATTGCTGTCACTTSEQIDN0.5，[0077]Metrnl-flox上游引物：TGAGGGTTGGAGGCTCCTAGCSEQIDN0.6，[0078]Metrnl-flox下游引物：GGATGAGCGTTTGAGCACAGCSEQIDNO.7〇[0079]2.3Metrnl肠道上皮特异性敲除小鼠验证一）[0080]取Metrnl肠道上皮特异性敲除小鼠（Metrnl——及同窝对照小鼠（WT肠道、肝脏、白色脂肪、棕色脂肪等组织，提取RNA，定量PCR检测Metrnl表达情况具体操作同实施例1中的记载）。[0081]2.4Metrnl肠道上皮特异性敲除小鼠表型验证二）[0082]取Metrnl肠道上皮特异性敲除小鼠（Metrnl——及同窝对照小鼠（WT的肠道组织，免疫组织化学检测Metrnl蛋白的表达情况具体操作同实施例1中的记载）。[0083]3实验结果[0084]3.IMetrnl肠道上皮特异性敲除小鼠的基因型鉴定结果[0085]结果见图5,可见在IOObp以及243bp同时出现目的条带，确定Metrnl肠道上皮特异性敲除小鼠模型构建成功。[0086]3.2Metrnl肠道上皮特异性敲除小鼠表型验证结果一）[0087]结果见图6，Metrnl肠道上皮特异性敲除小鼠肠道Metrnl的表达与同窝对照小鼠WT相比，Metrnl的表达下降了96%。[0088]3.3Metrnl肠道上皮特异性敲除小鼠表型验证结果二）[0089]如图7所示，可见与同窝野生型小鼠肠道上皮明显的Metrnl染色相比，Metrnlv一肠上皮无明显的Metrnl表达，进一步证明Metrnl肠道上皮特异性敲除小鼠模型构建成功。[0090]实施例3Metrnl肠道上皮特异性敲除抑制了抗菌肽的表达[0091]1实验材料[0092]Metrnl肠道上皮特异性敲除Metrnlv—培育过程见实施例2。[0093]Trizol试剂：购于Invitrogen公司。[0094]2实验方法[0095]取Metrnl肠道上皮特异性敲除小鼠的肠道组织，Trizol法提取RNA，并逆转录为cDNA后，定量PCR检测粘蛋白2Mucin2、绒毛蛋白（villinl、以及各种抗菌肽的表达情况所用引物见表1。[0096]表1定量PCR检测引物[0099]SAA3,serumamyloidA~3；Reg3g,regeneratingislet-derived3gamma；Reg3b,regeneratingislet-derived3beta；S100A8,SlOOcalciumbindingproteinA8.[0100]3实验结果[0101]如图8所示，粘蛋白2Mucin2和绒毛蛋白（vi11ini表达没有变化，而很多抗菌肽的表达下调，特别是regeneratingislet-derived3gammaReg3g，lactotransferrin，以及regeneratingislet-derived3betaReg3b。不同的抗菌肽可以抑制不同的肠道菌群，从而维持肠道免疫炎症稳态，所以Metrnl具有调节肠道菌群的功能。[0102]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.Metrnl蛋白或基因及其增效剂的用途，其特征在于，用于制备调节抗菌肽表达的药物。2.Metrnl蛋白或基因及其增效剂的用途，其特征在于，用于制备治疗或改善抗菌肽不足或相关疾病的药物。3.Metrnl蛋白或基因及其增效剂的用途，其特征在于，用于制备治疗或改善肠道微生物失调或相关疾病的药物。4.Metrnl蛋白或基因及其增效剂的用途，其特征在于，用于：a制备提尚肠道抗菌妝表达的试剂;或b制备调节肠道菌群的功能的试剂。5.—种筛选治疗或改善肠道抗菌肽不足或相关疾病的物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：a将候选物质与含有Metrnl蛋白或基因的体系接触，b观察候选物质对于Metrnl蛋白或基因表达及活性的影响，其中，若所述候选物质能够促进Metrnl基因表达或提高Metrnl蛋白活性，则所述候选物质是治疗或改善肠道抗菌肽不足或相关疾病的潜在物质。6.根据权利要求1-4任一所述的用途，其特征在于，所述的增效剂选自激动剂、上调剂或稳定剂。7.根据权利要求1-4任一所述的用途、权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗菌肽包括但不限于Reg3g、Reg3b或lactotransferrin〇8.根据权利要求1-4任一所述的用途、权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Metrnl蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。9.根据权利要求2-3所述的用途，其特征在于，所述相关疾病包括消化系统疾病、内分泌系统疾病、心血管系统疾病、神经系统疾病、免疫系统疾病。

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