申请/专利权人：四川省农业科学院作物研究所

申请日：2016-11-10

公开（公告）日：2020-01-10

公开（公告）号：CN106434709B

主分类号：C12N15/54(20060101)

分类号：C12N15/54(20060101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.01.10#授权;2017.03.22#实质审查的生效;2017.02.22#公开

摘要：本发明公开了一种水稻抗褐飞虱基因Bph3等位突变基因Bph3p及其基因标记应用，其具有Seq.ID.No.1、Seq.ID.No.2所示的核苷酸序列。本发明采用精细定位和基因克隆测序的方法，分离到一个水稻抗褐飞虱基因Bph3的等位基因Bph3p；通过田间鉴定和构建导入系方法，验证了Bph3p具有持久广谱褐飞虱抗性。本发明获得的抗飞虱基因分子标记，能够清晰地区分水稻植株中有无Bph3和Bph3p基因，以及是具有Bph3还是Bph3p基因，从而实现了水稻稻飞虱抗性的分子选择，避免了人工接虫鉴定的繁琐工作，缩短了抗稻飞虱育种年限，提高了育种效率。

主权项：1.一种水稻抗褐飞虱基因Bph3的等位变异体Bph3p，其特征在于：所述等位变异体Bph3p的核苷酸序列如SEQIDNo.1。

全文数据：一种水稻抗褐飞虱基因Bph3的等位变异及其基因标记应用技术领域[0001]本发明涉及分子生物学和农业领域，具体涉及一种水稻抗褐飞虱基因Bph3的等位变异及其基因标记应用。背景技术[0002]稻飞虱是我国和许多亚洲国家水稻主要病虫害之一，其不仅能通过刺吸方式直接为害水稻，还能传播水稻草状丛矮病GrassStunt和齿叶矮缩病RaggdeStunt。稻飞虱，昆虫纲同翅目（Homoptera飞虱科Delphacidae害虫。俗名火蠓虫。以刺吸植株汁液为害水稻等作物。常见种类有褐飞虱（NilaparvatalugensSt.M、白背飞虱（Sogatellafurcifera和灰飞虱（Laodelphaxstriatellus，其中以褐飞虱危害最为严重。当稻飞虱为害严重时，稻株成片枯黄，倒伏，俗称"虱烧"。一直以来，化学防治在控制褐飞虱为害中起到很重要的作用，但是大量的使用化学药剂不仅污染环境，也将很多益虫杀死，破坏生态平衡，而且导致稻飞虱抗药性增加，致使褐飞虱为害加重。[0003]实践证明，利用水稻品种自身的抗虫特性是一种对环境友好、经济有效的防治手段。因此，研究与利用水稻抗稻飞虱基因是水稻飞虱防治的重要措施。[0004]1967年，Pathak等率先鉴定出了一批抗褐飞虱资源材料。1968年，抗飞虱育种和基因定位计划开始实施。1971年，Athwal等率先鉴定出抗褐飞虱基因Bphl和bph2;迄今为止，已鉴定出抗褐飞虱主效基因至少有30个。Du等（DuB.，W.Zhang，B.Liu,etal.IdentificationandcharacterizationofBphl4，ageneconferringresistancetobrownplanthopperinrice.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2009,10652:22163-22168.率先利用图位克隆的方法获得抗褐飞虱基因Bphl4,并通过互补实验和RNAi干扰验证了该基因的功能，并对该基因进行了功能分析。研究结果表明BphH编码一个包含1323个氨基酸的蛋白，该蛋白包含一个CC-NB-LRR结构域。随后，BPH26Tamura，Y·，etal·，Map-basedcloningandcharacterizationofabrownplanthopperresistancegeneBPH26fromOryzasativaL.ssp.indicacultivarADR52.SciRep，2014.4:p.5872、Bph3Liu，Y.，etal.，Ageneclusterencodinglectinreceptorkinasesconfersbroad-spectrumanddurableinsectresistanceinrice.NatBiotechnol,2015.333:p.301-305BPH29Wang,Y.,etal.,Map-basedcloningandcharacterizationofBPH29，aB3domain-containingrecessivegeneconferringbrownplanthopperresistanceinrice.JExpBot,2015.6619:p.6035-45分别被克隆出来。其中BPH26和BPH29为隐性抗褐飞虱基因，而Bph3为一个显性广谱抗稻飞風基因D[0005]Lakshinarayana等（1977在RathuHeenati中鉴定出了一个新的显性抗虫基因，命名为Bph3Jidhu等（1978对20个抗虫品种进行遗传分析，发现有7个品种含有Bph3,有10个品种含有bph4,剩下的3个品种同时含有Bph3和bphHeda等（1981运用三体定位法把Bph3和bph4定位在7号染色体上。随后黄朝锋利用RHX七丝软占的F2作图群体对水稻抗褐飞虱基因Bph3进行分子定位，将Bph3基因定位在第4染色体长臂上PSM323和PSM194两标记之间。但是Jairin等（JairinJ.,K.Phengrat,S.Teangdeerith,etal.Mappingofabroad-spectrumbrownplanthopperresistancegene,Bph3,onricechromosome6.Molecularbreeding,2007，19I:35-44.分别以IR71033-121-15KDML105的F2群体，RathuHeenatiKDML105构建的BC3F2群体和PTB33RD6构建的BC1F2群体为研究材料，利用SSR标记将Bph3定位于第6染色体RM589-RM588之间，遗传距离分别是0.8cM和0.6cM。Jairin等（JairinJ.,S.Teangdeerith,P.Leelagud,etal.Detectionofbrownplanthopperresistancegenesfromdifferentricemappingpopulationsinthesamegenomiclocation·Sci.Asia,2007，33:347-352用RathuHeenatiKDML105的BC3F3群体将Bph3定位在6号染色体SSR标记RM19291与RM8072之间的190kB的区域。万建民等利用水稻抗虫品种RathuHeenati罕）与感虫品种02428«杂交获得的F2各单株的基因型和F2:3各家系的抗褐飞虱的抗性级别进行遗传连锁分析，获得抗虫品种RathuHeenati抗褐飞虱主基因Bph3，将其定位在第4染色体分子标记A4和RM16533之间（万建民等，水稻品种抗褐飞虱主基因Bph3的分子标记方法，专利授权号:ZL200810243722.4。[0006]最后，Liu，Y·，etal·Liu，Y·，etal.,Ageneclusterencodinglectinreceptorkinasesconfersbroad-spectrumanddurableinsectresistanceinrice.NatBiotechnol,2015.333:p.301-305将Bph3从水稻品种RathuHeenati克隆出来，发现Bph3是由三个编码凝集素受体激酶基因组成的一个基因簇，对褐飞虱和白背飞虱都有广谱持久的抗性。发明内容[0007]本发明的目的是提供一个水稻抗褐飞虱基因Bph3的等位变异及其基因标记应用。[0008]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一个水稻抗褐飞虱基因Bph3的等位变异体Bph3p，其特征在于:所述等位变异体Bph3%^]核苷酸序列如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示。本发明采用精细定位和候选基因克隆测序的方法，分离到水稻抗褐飞虱基因Bph3p，通过分子标记选择和构建近等基因系方法，证实了该基因的功能。[0009]SEQIDNo.1序列全长5587bp，与抗褐飞虱品种RathuHeenati的等位基因片段SEQIDNo.3相比较，在第263bp处有一个9bp碱基的插入片段；[0010]SEQIDNo.2序列全长4237bp，与抗褐飞虱品种RathuHeenati的等位基因片段SEQIDΝο·4相比较，在第1505bp处有一个17bp碱基的插入片段，而第1539bp处碱基由Bph3基因的G突变为T，该插入片段和点突变均处于启动子区域，应当理解，本发明Bph3p基因为Bph3基因自然变异，而非人工改变，致使本发明Bph3p基因与Bph3基因存在实质性的差异，为Bph3基因的一个具有褐飞虱抗性的等位基因。[0011]本发明另一个目的是提供一种抗褐飞虱基因Bph3^^水稻选育和抗褐飞虱选育中的应用，所提供的三个分子标记不仅能地鉴定Bph3p#在与否，而且能够很好地区分Bph3lPBph3。通过检测这些分子标记，可以预测水稻植株的稻飞虱抗性，加快抗稻飞虱育种速度，简化选育手段。[0012]本领域技术人员应当理解，根据本发明公开的序列来设计或产生的分子标记可用于抗褐飞虱水稻选育育种。[0013]本发明通过如下步骤获得并验证Bph3p基因及其分子标记：[0014]l、Bph3pS因的初步定位[0015]用抗虫品种SD和感虫品种TNl见图1杂交构建SDXTN1F2:3家系，以及（SDXTNlXG46A三交群体分析SD褐飞虱抗性遗传特征。结果显示，SDXTN1F2:3抗虫家系数:抗感分离家系数:感虫家系数=70:131:72，经乂2检验，符合1:2:1的比例卜2=0.361乂0.05,22=5.99，表明SD的抗虫性受一个显性基因控制;三交群体单苗鉴定结果显示，抗虫单株数:感虫单株数=122:153，经乂2检验，符合1:1的分离比以2=3.28乂0.05，12=3.84，进一步验证了SD抗褐飞虱特性由一个显性基因控制。利用SDXTN1的F2:3隐性群体，采用SSR标记、INDEL标记和SNP标记将SD抗褐飞虱基因定位在第4染色体短臂上的分子标记SN8与SNll之间，该基因与两个标记的遗传距尚均是2.8〇]\1，与分子标记1?]\116489、!1313、3戀共分尚（见图2。并暂定名为"Bph-SD"。（见黄俊;水稻品种SD抗褐飞虱的遗传分析及初步定位；四川农业大学;2014年硕士论文）[0016]表1.F2:3隐性群体中交换单株基因型鉴定结果[0018]A表示与抗虫亲本SD相同带型，B表示与感虫亲本TNl相同带型，H表示杂合带型。其中RM16428、RM16489、RM16514是SSR标记，HST3是InDel标记，SN1、SN7、SN8、SN9、SN11、SN13、SN15是SNP标记，1-22为交换单株编号。[0019]2、Bph3p基因精细定位与确认[0020]选取4株表型为褐飞虱抗性，基因型为初步定位区段杂合型而两端为感虫亲本TNl相同带型内单株的种子共4000粒，发芽移栽种植，分蘖期取叶片分析基因型，对在定位区段发生交换的单株，鉴定F2:3家系褐飞虱抗性。同时，利用生物信息学方法，分析在SN8与SNll之间的SNP和InDel位点，并设计SNP和InDel引物。最终将抗性基因精细定位在SNP标记Inl和In2之间（见图3,4，即6939507bp~6969271bp之间；该区段包含5个基因，分别是L0C_804812540、1^0：_804812550、11：_804812560、1^0：_804812570和1^0：_804812580，其中1^0：_804812540、1!：_804812560和11：_804812580被注释为表达的类似受体蛋白激酶，于是对这3个基因进行了克隆测序分析。此时发现与Liu，Y.，etal.Liu，Y.，etal.，Ageneclusterencodinglectinreceptorkinasesconfersbroad-spectrumanddurableinsectresistanceinrice.NatBiotechnol，2015.333:p.301_305报道的Bph3为同一位点。于是将来自水稻品种SD、Ptb33和RathuHeenati的Bph3基因序列进行比对分析，发现来自SD和Ptb33的SEQIDNo.lL0C_s04gl2560序列全长5587bp，与抗褐飞虱品种RathuHeenati的等位基因片段SEQIDNo.3L0C_s04gl2560相比较，在第263bp处有一个9bp碱基的插入片段;来自SD和Ptb33的SEQIDNo.2L0C_s04gl2580序列全长4237bp，与抗褐飞虱品种RathuHeenati的等位基因片段SEQIDNo.4L0C_s04gl2580相比较，在第1505bp处有一个17bp碱基的插入片段，而第1539bp处碱基由Bph3基因的G突变为T。因此，将SD和Ptb33在该位点的抗褐飞虱基因命名为"Bph3p"[0021]3、区分抗褐飞虱基因Bph3与其等位基因Bph3p的分子标记[0022]根据序列来自SD和Ptb33的SEQIDNo.2L0C_s04gl2580与抗褐飞虱品种RathuHeenati的等位基因片段SEQID吣.411：_8〇4812580在第1505&口处有一个17&口碱基的插入缺失片段，设计了InDel标记InDel80。该引物在含有Bph3基因的植株DNA为模板时，可以扩增出一条432bp的条带来;在含有Bph3p基因的植株DNA为模板时，可以扩增出一条449bp的条带。其反应条件均为：PCR反应总体系50μ1:cDNA模板2μ1，10Xbuffer5yl，10mMdNTP2yI，1〇μΜ引物各3μ1，高保真Taq酶1U。反应程序:预变性94°C4min;然后35个循环，变性95°C20s，58cC40s,72cC30s;再72cC延伸7min。[0023]本发明的有益技术效果是：本发明基因Bph3PSBph3基因自然变异，而非人工改变，为Bph3基因的一个具有褐飞虱抗性的等位基因，这丰富了褐飞虱抗性基因资源。[0024]本发明所设计的基因引物，为抗褐飞虱分子育种提供了精确地选择工具，将会极大地减少抗褐飞虱田间鉴定工作量和缩短抗褐飞虱育种年限。附图说明[0025]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0026]图1水稻品种SD和TNl植株褐飞虱抗性鉴定；[0027]图2本发明中Bph3p基因的初步定位；[0028]图3本发明中Bph3pS因精细定位；[0029]图4本发明中分子标记Inl在分离群体中的扩增效果；[0030]图5本发明中分子标记Inl在分离群体中的扩增效果；[0031]图6本发明中分子标记InDel80区分Bph3^Bph3的扩增效果；[0032]图7本发明中Bph3pS因在改良材料中褐飞虱抗性表现。具体实施方式[0033]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0034]实施例1[0035]l、Bph3p基因的定位[0036]利用72个SDXTNl的F2:3隐性群体，采用SSR标记、INDEL标记和SNP标记将SD抗褐飞虱基因定位在第4染色体短臂上的分子标记SN8与SNll之间，该基因与两个标记的遗传距离均是2.8cM，与分子标记RM16489、HST3、SN9共分离。并暂定名为"Bph-SD"。（见黄俊;水稻品种SD抗褐飞虱的遗传分析及初步定位；四川农业大学;2014年硕士论文）rnm7l志〇鸟班女出右姚珀扯宜田开U士电[0039]A表示与抗虫亲本SD相同带型，B表示与感虫亲本TNl相同带型，H表示杂合带型。其中RM16428、RM16489、RM16514是SSR标记，HST3是InDel标记，SN1、SN7、SN8、SN9、SN11、SN13、SN15是SNP标记，1-22为交换单株编号。[0040]选取4株表型为褐飞虱抗性，基因型为初步定位区段杂合型而两端为感虫亲本TNl相同带型内单株的种子共4000粒，发芽移栽种植，分蘖期取叶片分析基因型，对在定位区段发生交换的单株，鉴定F2:3家系褐飞虱抗性。同时，利用生物信息学方法，分析在SN8与SNll之间的SNP和InDel位点，并设计SNP和InDel引物。发现SD褐飞虱抗性与InDel标记Inl和In2存在100%的连锁。[0041]2、Bph3pS因及其分子标记应用[0042]本例中利用InDel标记Inl和In2,来选择具有抗褐飞虱功能的水稻，标记Inl扩增片段为355bp，In2扩增片段为189bp。提取抗褐飞虱品种SD和Ptb33、感褐飞虱品种及其杂交或回交后代单株，利用InDel标记Inl和In2,按照PCR反应体系:PCR反应总体系50μ1:cDNA模板2μ1，10Xbuffer5yl，10mMdNTP2yl，ΙΟμΜ引物各3μ1，高保真Taq酶1U。反应程序:预变性94°C4min;然后35个循环，变性951€2〇8,581€4〇8,721€3〇8;再72°：延伸71^11。将？0?产物通过1.2%的琼脂糖凝胶电泳，可分离出与抗褐飞虱亲本SD和Ptb33-致的条带来，Inl扩增片段为355bp，见图4;In2扩增片段为189bp，见图5。均含有这两个带型的植株，即为选择出来的含有Bph3或Bph3p基因的抗褐飞虱单株。利用基因标记InDel80可将水稻单株是含有Bph3，还是Bph3p基因或是杂合完全区分开见图6。通过接虫鉴定可以对分子选择效果进行确认图7，在通过对水稻植株农艺性状加以选择，便可培育抗褐飞虱水稻新品系或新品种。[0043]本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语包括技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。[0044]最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解:依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

权利要求：1.一种水稻抗褐飞虱基因Bph3的等位变异体Bph3p，其特征在于:所述等位变异体Bph3p的核苷酸序列如SEQIDNo.l或SEQIDNo.2所示。2.-种与Bph3或Bph3p共分离的InDel分子标记Inl，其特征如下：后引物序列：5-〇厶1'1^^厶：11^60^〇厶0：1'-3。3.-种与Bph3或Bph3p共分离的InDel分子标记In2，其特征如下：前引物序列:5'-TATAGCCCTTGGAGAACG-3';后引物序列：5'-GATCATGTCAGGAGAACCC-3'。4.一种可区分抗褐飞虱基因Bph3或Bph3p的基因InDel分子标记InDel80,其特征如下：前引物序列:5'-AGCAAGGATCATGTCAGGAG-3';后引物序列:5'-AGCAGGTAAGAGGAGGAGTT-3'。5.-种水稻抗褐飞虱基因Bph3p在水稻选育和抗稻飞虱选育中的应用。

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