申请/专利权人：山东理工大学

申请日：2018-05-09

公开（公告）日：2020-01-10

公开（公告）号：CN108593743B

主分类号：G01N27/327(20060101)

分类号：G01N27/327(20060101);G01N33/574(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.01.10#授权;2018.10.26#实质审查的生效;2018.09.28#公开

摘要：本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用。本发明利用双金属Pd@Pt纳米粒子负载氨基功能化MoSe2作为催化材料，与检测抗体孵化后作为标记物，同时利用金纳米棒负载氨基功能化石墨烯作为电极修饰材料，成功构建了夹心型免疫传感器，从而实现了对肿瘤标志物NSE、SCCA的检测，具备灵敏度高，特异性强，检测限低等优势，对肿瘤的早期检测具有重要的科学意义和应用价值。

主权项：1.一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；（2）取6µL、1.0~3.0mgmL的金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）将6µL、8.0~12.0µgmL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；（4）继续将3µL、0.5~2.0mgmL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；（5）滴加6µL、10fgmL~100ngmL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；（6）将6µL、1.5~3.5mgmL检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液滴至电极表面，置于4°C冰箱中孵化40min，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干，制得一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器；所述金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备，其特征在于，步骤如下：（1）金纳米棒溶液的制备将95~105μL、质量分数为1%的氯金酸和350~370mg十六烷基三甲基溴化铵加入到10mL超纯水中，超声震荡15~20min；磁力搅拌下快速加入50~70μL、0.1molL新制备的硼氢化钠溶液，搅拌2~4min，得到棕黄色的金纳米种子溶液；将380~420μL、质量分数为1%的氯金酸和700~780mg十六烷基三甲基溴化铵及15~25μL、0.1molL硝酸银溶液加入到20mL超纯水中，超声震荡25~45min；加入90~120μL、0.1molL新配制的抗坏血酸溶液，溶液由黄色变无色，加入20μL金纳米种子溶液，震荡30~40s，静置24h，超纯水离心洗涤3次，再分散于10mL超纯水中，得到金纳米棒溶液；（2）氧化石墨烯的制备将1~2g石墨薄片和0.5~1g硝酸钠依次加入装有23mL浓硫酸的烧瓶中，在冰浴中搅拌30min；搅拌下加入3~4g高锰酸钾，加高锰酸钾的过程中保持反应温度低于20°C，然后升温至35°C并保持30min，然后升温至90°C~95°C并保持15min，后缓慢加入50mL超纯水；再依次加入140mL超纯水和10~15mL、质量分数为30%的H2O2溶液，溶液变成亮黄色；离心分离，分别用1molL的HCl溶液和超纯水洗涤，在50°C真空干燥箱中干燥24h，制得氧化石墨烯；（3）金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备在50mL的烧杯中加入40~50mg氧化石墨烯和10~15mL乙二醇，超声震荡30min，加入0.3~0.4mL、质量分数为25%的氨水，超声震荡5min，将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，180°C反应10~14h，冷却至室温，无水乙醇离心洗涤，在30°C的真空干燥箱中干燥12h，制得氨基化石墨烯；将20~30mg氨基功能化石墨烯加至10mL上述步骤（1）制备的金纳米棒溶液中，震荡12h，制得金纳米棒负载氨基化石墨烯。

全文数据：一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用技术领域[0001]本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，涉及一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用Pd@PtM〇Se2S检测抗体标记物，实现了对肿瘤标志物NSE、SCCA的灵敏检测。背景技术[0002]癌症是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率的疾病。虽然恶性肿瘤的治疗技术在不断进步，但迄今为止，恶性肿瘤的早期发现、早期诊断和早期治疗仍然是治疗恶性肿瘤最有效的手段。肿瘤标志物是肿瘤细胞本身存在或分泌的特异性物质，绝大多数存在于恶性肿瘤中，血清中肿瘤标志物的检测对肿瘤预警及早期诊断具有重要的科学意义和应用前景。因此，降低肿瘤死亡率的主要途径是实现早期对肿瘤标志物的灵敏检测。目前临床血清肿瘤标志物的免疫检测方法主要有放射免疫法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫法等，但无法避免放射污染、耗时、灵敏度不够等缺点。因此，发明一种特异性强，灵敏度高，检测速度快，操作简便的免疫传感器十分重要。[0003]电化学免疫传感器主要利用抗原与抗体间高度特异性结合的特性，将免疫分析法和电化学传感器相结合，具有分析灵敏度高、特异性强、使用简便及成本低等独特优势，已广泛用于各种肿瘤标志物的检测，同时在环境监测、食品安全控制、生物监测、临床检验等领域发挥重要作用。[0004]金纳米棒负载氨基功能化石墨烯具有大的比表面积和良好的生物相容性，可以显著提高捕获Abi的固载量;石墨烯良好的电子传递能力可以增强电极的导电性。Pd@PtMoSe2能够提供良好的催化作用，MoSe2具有较大的比表面积能够提高Pd@PtNPs的负载量从而提高捕获Abs的固载量，同时减少贵金属的团聚作用。本发明采用金纳米棒负载氨基功能化石墨烯作为基底材料，Pd@PtM〇Se2作为催化材料与检测抗体进行孵化作为标记物，构建了用于肿瘤标志物检测的夹心型电化学免疫传感器。发明内容[0005]本发明提供了一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用，实现了对肿瘤标志物的灵敏检测。[0006]本发明的目的之一是提供一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法。[0007]本发明的目的之二是将所制备的铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器应用于肿瘤标志物NSE、SCCA的高灵敏、特异性检测。[0008]本发明的技术方案，包括以下步骤。[0009]1•—种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，步骤如下：1将直径为4mm的玻碳电极用Al2〇3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；2取6yL、1.0〜3_0mgmL的金纳米棒负载氨基化石墨稀分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；3将6yL、8.0〜12.0ygmL的肿瘤标志物捕获抗体Abi滴加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；4继续将3yL、0.5〜2.0mgmL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；5滴加6uL、0_lpgmL〜100ngmL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；6将6yL、l_5〜3.5mgmL检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液滴至电极表面，置于4°C冰箱中孵化40min，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干，制得一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器。[0010]2•所述金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备，步骤如下：1金纳米棒溶液的制备将95〜1〇5此、质量分数为1%的氯金酸和350〜370mg十六烷基三甲基溴化铵加入到10mL超纯水中，超声震荡I5〜20min;磁力搅拌下快速加入50〜70uL、0.1molL新制备的硼氢化钠溶液，搅拌2〜4min，得到棕黄色的金纳米种子溶液；将380〜4加此、质量分数为1%的氯金酸和7〇0〜7洲mg十六烷基三甲基溴化铵及15〜25yL、0.1molL硝酸银溶液加入到20mL超纯水中，超声震荡25〜45min;加入90〜12〇此、0.1molL新配制的抗坏血酸溶液，溶液由黄色变无色，加入20yL金纳米种子溶液，震荡30〜40s，静置24h，超纯水离心洗涤3次，再分散于10mL超纯水中，得到金纳米棒溶液；2氧化石墨烯的制备将1〜2g石墨薄片和0.5〜1g硝酸钠依次加入装有23mL浓硫酸的烧瓶中，在冰浴中搅拌30min;搅拌下加入3〜4g高锰酸钾，加高锰酸钾的过程中保持反应温度低于20°C，然后升温至35°C并保持30min，然后升温至90°C〜95°C并保持15min，后缓慢加入50mL超纯水;再依次加入140mL超纯水和10〜15mL、质量分数为30%的H2〇2溶液，溶液变成亮黄色；离心分离，分别用1molL的HC1溶液和超纯水洗涤，在50°C真空干燥箱中干燥24h，制得氧化石墨烯；3金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备在50mL的烧杯中加入40〜50mg氧化石墨烯和10〜15mL乙二醇，超声震荡30min，加入0.3〜0.4mL、质量分数为25%的氨水，超声震荡5min，将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，180°C反应10〜14h，冷却至室温，无水乙醇离心洗涤，在30°C的真空千燥箱中干燥12h，制得氨基化石墨烯；将20〜30mg氨基功能化石墨烯加至10mL上述步骤1制备的金纳米棒溶液中，震荡12h，制得金纳米棒负载氨基化石墨烯。[0011]3.所述检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液的制备，步骤如下：1功能化PdNPs分散液的制备依次取90〜110mg聚乙烯吡咯烷酮，550〜650mg溴化钾和60〜7〇mg抗坏血酸溶于8mL超纯水中，加热至80°C保持10min;在磁力搅拌下加入50〜70mg四氯化钯酸钠，反应3h后，依次用超纯水和丙酮尚心洗漆3次，制得PdNPs，重新分散在lomL超纯水中制得PdNPs分散液；分别取180〜200mg十六烷基三甲基溴化铵和25〜30mg溴水杨酸溶于1〇mL超纯水中；加入1_0〜2.0mL的PdNPs分散液，超声震荡5〜9min，离心，用超纯水离心洗漆三次，重新分散在10mL超纯水中，得到功能化PdNPs分散液；2Pd@PtNPs分散液的制备将250〜270liL、质量分数为1%是氯铀酸溶于5mL超纯水中，加入1mL功能化PdNPs分散液，超声震荡1〜2min，快速加入1mL、〇.〇lm〇lL的抗坏血酸溶液，快速震荡i〇〜15s，静置8〜10h，超纯水离心洗涤，重新分散于1〇mL超纯水中，制得pd@ptNPs分散液；3氨基化MoSe2的制备将150〜170mg硒粉加入到5mL、质量分数为85%水合肼中，磁力搅拌2〜3h，制得溶液A;将2〇0〜280mg钼酸钠加入到20mL超纯水中，制得溶液B;将A、B两溶液混合，磁力搅拌30min，转移到聚四氟乙烯高压釜中，200。：加热Mh，冷却至室温，无水乙醇和超纯水离心洗涤3次，在60°C的真空千燥箱中干燥16〜24h，制得MoSe2;将100ragMoSe2和160二200UL3-氨丙基三乙氧基硅烷依次加入到10mL无水乙醇中，70°C回流60〜70min，离心分离，超纯水离心洗涤，60°C真空干燥12h，得到氨基化MoSe2；4Pd@PtMoSe2的制备将25〜35mg氨基化MoSe2加至10mLPdOPtNPs分散液中，震荡10〜14h，离心分离，在40°C的真空干燥箱中干燥12〜18h，制得Pd@PtM〇Se2，5检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液的制备将4〜8mg的Pd@PtMoSe2加至1mL超纯水中，超声分散，再加入1〇〇此、80〜120ugmL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液和900uL、50ramolL的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，4°C恒温振荡培养箱中振荡，孵化12h，离心分离，将所得沉淀重新分散至1mL、50mmolL的pH为7•0的磷酸盐缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液，4°C下保存备用。[0012]4.肿瘤标志物的检测，包括以下步骤：1使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL、50mmolL的pH5.00〜9.00磷酸盐缓冲溶液中进行测试；2用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4V，取样间隔0.1s，运行时间400s；3当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmolL的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中注入10UL、5molL的双氧水溶液，记录电流变化。[0013]上述所述肿瘤标志物选自下列之一:NSE、SCCA。[0014]本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。[0015]本发明的有益成果1金纳米棒负载氨基功能化石墨烯，具有大的比表面积和良好的生物相容性，可以结合更多抗体，并且提升电极表面的电子传输能力，提高导电性。Pd@Pt为核壳型纳米复合材料，具有良好的催化性能和生物相容性，Pd@PtM〇Se2具有大的比表面积能有效吸附并固载抗体，并具有更好的催化性能。采用金纳米棒负载氨基化石墨烯作为基底材料，Pd@PtMoSe2作为检测抗体标记物构建的夹心型免疫传感器，提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；2—种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器实现了对肿瘤标志物NSE的检测，其线性范围15fgmL〜90ngmL，检测限低至5•OfgmL，对肿瘤标志物SCCA的检测，其线性范围l5fgmL〜9〇ngmL，检测限低至5.0fgmL，表明一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器可以达到准确测定的目的。具体实施方式[0016]现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。[0017]实施例i一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，步骤如下：1将直径为4mm的玻碳电极用Al2〇3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；2取6yL、1.0mgmL的金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液滴涂到电极表面，室温下晾千，超纯水冲洗电极表面，晾干；3将6uL、8.0ygmL的肿瘤标志物捕获抗体Abi滴加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；4继续将3yL、0.5mgmL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；5滴加6yL、10fgmL〜100ngmL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；6将6yL、1.5mgmL检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液滴至电极表面，置于4°C冰箱中孵化40min，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干，制得一种钼钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器。[0018]实施例2—种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，步骤如下：⑴将直径为4mm的玻碳电极用Als〇3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；2取6uL、2_0mgmL的金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；3将6yL、10.0ygmL的肿瘤标志物捕获抗体Ab^加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；4继续将3yL、1.0mgmL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；5滴加6yL、0_lpgmL〜100ngmL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4。:冰箱中晾干；6将6yL、2.5mgmL检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液滴至电极表面，置于4°C冰箱中孵化40min，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干，制得一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器。[0019]实施例3—种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，步骤如下：1将直径为4mm的玻碳电极用Al2〇3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；2取6WL、3.0mgmL的金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；⑶将6yL、l2.0ugmL的肿瘤标志物捕获抗体Abdf加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；4继续将3yL、2.0mgmL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；5滴加6yL、0.1pgmL〜100ngmL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；6将6yL、3.5mgmL检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液滴至电极表面，置于4°C冰箱中孵化40min，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干，制得一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器。[0020]实施例4所述金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备，步骤如下：1金纳米棒溶液的制备将95uL、质量分数为1%的氯金酸和350mg十六烷基三甲基溴化铵加入到1〇mL超纯水中，超声震荡15min;磁力搅拌下快速加入50uL、0.1molL新制备的硼氢化钠溶液，搅拌2min，得到棕黄色的金纳米种子溶液；将380uL、质量分数为1%的氯金酸和700mg十六烷基三甲基溴化铵及15uL、0.1molL硝酸银溶液加入到20mL超纯水中，超声震荡25min;加入90uL、0.1molL新配制的抗坏血酸溶液，溶液由黄色变无色，加入2〇UL金纳米种子溶液，震荡30s，静置24h，超纯水离心洗涤3次，再分散于10mL超纯水中，得到金纳米棒溶液；2氧化石墨烯的制备将1g石墨薄片和〇_5g硝酸钠依次加入装有23mL浓硫酸的烧瓶中，在冰浴中搅拌30min;搅拌下加入3g高锰酸钾，加高锰酸钾的过程中保持反应温度低于20°C，然后升温至35°C并保持30min，然后升温至90°C并保持15min，后缓慢加入50mL超纯水;再依次加入140mL超纯水和10mL、质量分数为30%的H202溶液，溶液变成亮黄色；离心分离，分别用1molL的HC1溶液和超纯水洗涤，在50°C真空干燥箱中干燥24h，制得氧化石墨烯；3金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备在50mL的烧杯中加入40mg氧化石墨烯和10mL乙二醇，超声震荡30min，加入0.3mL、质量分数为25%的氨水，超声震荡5min，将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，180°C反应10h，冷却至室温，无水乙醇离心洗涤，在30°C的真空干燥箱中干燥12h，制得氨基化石墨燦；将20mg氨基功能化石墨烯加至1〇mL上述步骤1制备的金纳米棒溶液中，震荡12h，制得金纳米棒负载氨基化石墨烯。[0021]实施例5所述金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备，步骤如下：1金纳米棒溶液的制备将100此、质量分数为1%的氯金酸和3e〇mg十六烷基三甲基溴化铵加入到1〇mL超纯水中，超声震荡I8min;磁力搅拌下快速加入6〇yL、0.1molL新制备的硼氢化钠溶液，搅拌3min，得到棕黄色的金纳米种子溶液；将400uL、质量分数为1%的氯金酸和740mg十六焼基三甲基溴化按及20此、0.1molL硝酸银溶液加入到20mL超纯水中，超声震荡35min;加入105yL、0.1molL新配制的抗坏血酸溶液，溶液由黄色变无色，加入20此金纳米种子溶液，震荡35s，静置24h，超纯水离心洗涤3次，再分散于10mL超纯水中，得到金纳米棒溶液；2氧化石墨烯的制备将1.5g石墨薄片和0.75g硝酸钠依次加入装有23mL浓硫酸的烧瓶中，在冰浴中搅拌3〇min;搅拌下加入3.5g高锰酸钾，加高锰酸钾的过程中保持反应温度低于20°C，然后升温至35°C并保持3〇min，然后升温至93°C并保持15min，后缓慢加入50mL超纯水;再依次加入140mL超纯水和12mL、质量分数为30%的H2〇2溶液，溶液变成亮黄色;离心分离，分别用1molL的HC1溶液和超纯水洗涤，在50°C真空干燥箱中干燥24h，制得氧化石墨烯；3金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备在5〇mL的烧杯中加入45mg氧化石墨烯和12.5mL乙二醇，超声震荡30min，加入0.35mL、质量分数为25%的氨水，超声震荡5min，将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，180°C反应I2h，冷却至室温，无水乙醇离心洗涤，在30°C的真空干燥箱中干燥12h，制得氨基化石墨條；将25mg氨基功能化石墨稀加至10mL上述步骤1制备的金纳米棒溶液中，震荡12h，制得金纳米棒负载氨基化石墨烯。[0022]实施例6所述金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备，步骤如下：1金纳米棒溶液的制备将1〇5此、质量分数为1%的氯金酸和370mg十六烷基三甲基溴化铵加入到10mL超纯水中，超声震荡20min;磁力搅拌下快速加入70uL、0_lmolL新制备的硼氢化钠溶液，搅拌4min，得到棕黄色的金纳米种子溶液；将420此、质量分数为1%的氯金酸和780mg十六烷基三甲基溴化铵及25uL、0.1molL硝酸银溶液加入到20mL超纯水中，超声震荡45min;加入120uL、0.1molL新配制的抗坏血酸溶液，溶液由黄色变无色，加入20uL金纳米种子溶液，震荡40s，静置24h，超纯水离心洗涤3次，再分散于10mL超纯水中，得到金纳米棒溶液；2氧化石墨烯的制备将2g石墨薄片和1g硝酸钠依次加入装有23mL浓硫酸的烧瓶中，在冰浴中撹拌30min;搅拌下加入4g高锰酸钾，加高锰酸钾的过程中保持反应温度低于20°c，然后升温至35°C并保持30min，然后升温至95°C并保持I5min，后缓慢加入5〇mL超纯水;再依次加入140mL超纯水和15mL、质量分数为30%的Hs〇2溶液，溶液变成亮黄色；离心分离，分别用1molL的HC1溶液和超纯水洗涤，在50°C真空干燥箱中干燥24h，制得氧化石墨烯；3金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备在50mL的烧杯中加入50mg氧化石墨烯和15mL乙二醇，超声震荡30min，加入〇.4mL、质量分数为烈％的氨水，超声震荡5min，将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，18〇%反应14h，冷却至室温，无水乙醇离心洗涤，在30。：的真空干燥箱中干燥12h，制得氨基化石墨條；将3〇mg氨基功能化石墨燦加至1〇mL上述步骤1制备的金纳米棒溶液中，震荡uh，制得金纳米棒负载氨基化石墨烯。^[0023]实施例7所述检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液的制备，步骤如下：1功能化PdNPs分散液的制备依次取90mg聚乙烯吡咯烷酮，550mg溴化钾和60mg抗坏血酸溶于8mL超纯水中，加热至80°C保持10min;在磁力搅拌下加入50mg四氯化钯酸钠，反应3h后，依次用超纯水和丙酮离心洗涤3次，制得PdNPs，重新分散在1〇mL超纯水中制得PdNPs分散液；分别取180mg十六烷基三甲基溴化铵和25mg溴水杨酸溶于1〇mL超纯水中；加入1.0mL的PdNPs分散液，超声震荡5min，离心，用超纯水离心洗涤三次，重新分散在10mL超纯水中，得到功能化PdNPs分散液；2Pd@PtNPs分散液的制备将250UL、质量分数为1%是氯铂酸溶于5mL超纯水中，加入1mL功能化PdNPs分散液，超声震荡1min，快速加入1mL、0.01molL的抗坏血酸溶液，快速震荡1〇s，静置8h，超纯水离心洗涤，重新分散于10mL超纯水中，制得Pd@PtNPs分散液；3氨基化MoSe2的制备将150mg砸粉加入到5mL、质量分数为85%水合肼中，磁力搅拌2h，制得溶液A;将200mg钼酸钠@入到20mL超纯水中，制得溶液B;将A、B两溶液混合，磁力搅拌30min，转移到聚四氟乙烯高压釜中，200°C加热24h，冷却至室温，无水乙醇和超纯水离心洗涤3次，在60。C的真空干燥箱中干燥16h，制得MoSe2;将100mgMoSe2和160yL3-氨丙基三乙氧基娃烧依次加入到10mL无水乙醇中，70°c回流㈤min，离心分离，超纯水离心洗涤，60°C真空干燥12h，得到氨基化MoSe2;4Pd@PtMoSe2的制备将25mg氨基化MoSe2加至10mLPdOPtNPs分散液中，震荡10h，离心分离，在40°C的真空干燥箱中干燥12h，制得Pd@PtMoSe2，5检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液的制备将4mg的Pd@PtMoSe2加至1mL超纯水中，超声分散，再加入1〇〇此、80ugmL的肿瘤标志物检测抗体Ah溶液和900yL、50mm〇lL的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，4°C恒温振荡培养箱中振荡，孵化12h，离心分离，将所得沉淀重新分散至imL、50nmoiL的pH为7.〇的磷酸盐缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液，4°C下保存备用。[0024]实施例8所述检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液的制备，步骤如下：1功能化PdNPs分散液的制备依次取100mg聚乙烯吡咯烷酮，600mg溴化钾和65mg抗坏血酸溶于8mL超纯水中，加热至80°C保持10min;在磁力搅拌下加入㈤mg四氯化钯酸钠，反应3h后，依次用超纯水和丙酮离心洗涤3次，制得PdNPs，重新分散在1〇mL超纯水中制得PdNPs分散液；分别取190mg十六烷基三甲基溴化铵和27mg溴水杨酸溶于10mL超纯水中；加入1.5mL的PdNPs分散液，超声震荡7min，离心，用超纯水离心洗涤三次，重新分散在10mL超纯水中，得到功能化PdNPs分散液；2Pd@PtNPs分散液的制备将26〇iiL、质量分数为1%是氯铂酸溶于5mL超纯水中，加入1mL功能化PdNPs分散液，超声^荡1_5min，快速加入1mL、0.01molL的抗坏血酸溶液，快速震荡12s，静置9h，超纯水离心洗涤，重新分散于10mL超纯水中，制得Pd@PtNPs分散液；3氨基化MoSe2的制备将160mg硒粉加入到5mL、质量分数为85%水合肼中，磁力搅拌2.5h，制得溶液A;将240mg钼酸钠加入到20mL超纯水中，制得溶液B;将A、B两溶液混合，磁力搅拌30min，转移到聚四氟乙烯高压釜中，200°C加热24h，冷却至室温，无水乙醇和超纯水离心洗涤3次，在60°C的真空干燥箱中干燥20h，制得MoSe2;将100m^MoSe^和1洲uL3-氨丙基三乙氧基硅烷依次加入到10mL无水乙醇中，7〇°c回流65min，离心分离，超纯水离心洗涤，60°C真空干燥12h，得到氨基化MoSe2;4Pd@PtMoSe2的制备将30mg氨基化MoSe2加至10mLPd@PtNPs分散液中，震荡12h，离心分离，在40°C的真空干燥箱中干燥16h，制得Pd@PtMoSe2，5检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液的制备将6mg的Pd@PtMoSe2加至1mL超纯水中，超声分散，再加入1〇〇此、100ygmL的肿瘤标志物检测抗体Ah溶液和9〇〇yL、50mm〇lL的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，4°C恒温振荡培养箱中振荡，孵化I2h，离心分离，将所得沉淀重新分散至imL、50mmolL的pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液，4°C下保存备用。[0025]实施例9所述检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2_Ab2溶液的制备，步骤如下：1功能化PdNPs分散液的制备依次取110mg聚乙烯吡咯烷酮，650mg溴化钾和70mg抗坏血酸溶于8mL超纯水中，加热至80jC保持10min;在磁力搅拌下加入70mg四氯化钯酸钠，反应3h后，依次用超纯水和丙酮离心洗涤3次，制得PdNPs，重新分散在1〇mL超纯水中制得PdNPs分散液；分别取200mg十六烷基三甲基溴化铵和30mg溴水杨酸溶于10mL超纯水中；加入2.0mL的PdNPs分散液，超声震荡9min，离心，用超纯水离心洗涤三次，重新分散在10mL超纯水中，得到功能化PdNPs分散液；2Pd@PtNPs分散液的制备将27〇yL、质量分数为1%是氯铂酸溶于5mL超纯水中，加入1mL功能化PdNPs分散液，超f震荡2min，快速加入1mL、0.01molL的抗坏血酸溶液，快速震荡15s，静置10h，超纯水禺心洗潘，重新分散于10mL超纯水中，制得Pd@PtNPs分散液；3氨基化MoSe2的制备将170mg砸粉加入到5mL、质量分数为85%水合肼中，磁力搅拌3h，制得溶液A;将280mg钼酸钠@入到20mL超纯水中，制得溶液B;将A、B两溶液混合，磁力搅拌30min，转移到聚四氟乙烯高压釜中，200°C加热24h，冷却至室温，无水乙醇和超纯水离心洗涤3次，在60。C的真空干燥箱中干燥24h，制得MoSe2;将100mgMoSe2和00uL3-氨丙基三乙氧基硅烷依次加入到1〇mL无水乙醇中，70°C回流7〇min，离心分离，超纯水离心洗涤，60°C真空干燥12h，得到氨基化MoSe2;4Pd@PtMoSe2的制备将35mg氨基化MoSe2加至10mLPd@PtNPs分散液中，震荡14h，离心分离，在40°C的真空千燥箱中干燥18h，制得Pd@PtMoSe2，5检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液的制备将8mg的Pd@PtMoSe2加至1mL超纯水中，超声分散，再加入1〇〇此、120ygmL的肿瘤标志物检测抗体Ah溶液和900uL、50mrnolL的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，4°C恒温振物1口齐相屮诹物，h，禺七、分呙，将所得沉淀重新分散至imU5〇圓〇1凡的邱为7.〇的磷fe盐缓冲洛液中，制得检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2_Ab2溶液，4°C下保存备用。[0026]实施例10肿瘤标志物NSE的检测，包括以下步骤：1使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL、5〇mmolL的pH5.00〜9.00磷酸盐缓冲溶液中进行测试；2用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-〇•4V,取样间隔〇.1s，运行时间400s；3当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmolL的pH=7_0的磷酸盐缓冲溶液中注入10此、5molL的双氧水溶液，记录电流变化；、4采用标准曲线法，测定肿瘤标志物NSE的线性范围为l5fgmL〜9〇ngmL，检测限为5fgmL〇[0027]实施例11肿瘤标志物SCCA的检测_按照实施例10的方法对样品中SCCA进行检测，其线性范围为I5fgmL〜90ngmL’检测限为5.0fgmL。

权利要求：1.一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：1将直径为4mm的玻碳电极用AI2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；2取6yL、1.0〜3.0mgmL的金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾千；3将6yL、8.0〜12.0ygmL的肿瘤标志物捕获抗体Abjf加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；4继续将3yL、0.5〜2.0mgmL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；5滴加6yL、10fgmL〜100ngmL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；6将6yL、1.5〜3.5mgmL检测抗体孵化物Pd@PtM〇Se2-Ab2溶液滴至电极表面，置于4°C冰箱中孵化40min，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干，制得一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器。2.如权利要求1所述的一种铀钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，所述金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备，其特征在于，步骤如下：1金纳米棒溶液的制备将95〜105此、质量分数为1%的氯金酸和350〜3了0mg十六烷基三甲基溴化铵加入到10mL超纯水中，超声震荡I5〜20min;磁力搅拌下快速加入5〇〜70uL、0.1molL新制备的硼氢化钠溶液，搅拌2〜4min，得到棕黄色的金纳米种子溶液；将38〇〜似0yL、质量分数为1%的氯金酸和700〜78〇mg十六烷基三甲基溴化铵及15〜25yL、0.1molL硝酸银溶液加入到20mL超纯水中，超声震荡25〜45min;加入90〜120此、0.1molL新配制的抗坏血酸溶液，溶液由黄色变无色，加入20uL金纳米种子溶液，震荡30〜40s，静置24h，超纯水离心洗涤3次，再分散于10mL超纯水中，得到金纳米棒溶液；2氧化石墨烯的制备将1〜2g石墨薄片和0.5〜1g硝酸钠依次加入装有23mL浓硫酸的烧瓶中，在冰浴中搅拌30min;搅拌下加入3〜4g高锰酸钾，加高锰酸钾的过程中保持反应温度低于20°C，然后升温至35°C并保持3〇min，然后升温至90°C〜95°C并保持15min，后缓慢加入50mL超纯水;再依次加入140mL超纯水和10〜15mL、质量分数为30%的H202溶液，溶液变成亮黄色；离心分离，分别用1molL的HC1溶液和超纯水洗涤，在50°C真空干燥箱中干燥24h，制得氧化石墨烯；3金纳米棒负载氨基化石墨烯分散液的制备在50mL的烧杯中加入40〜50mg氧化石墨烯和10〜15mL乙二醇，超声震荡30min，加入0.3〜0.4mL、质量分数为25%的氨水，超声震荡5min，将溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，180°C反应10〜14h，冷却至室温，无水乙醇离心洗涤，在30°C的真空干燥箱中干燥12h，制得氨基化石墨烯；将20〜3〇mg氨基功能化石墨烯加至10mL上述步骤（1制备的金纳米棒溶液中，震荡12h，制得金纳米棒负载氨基化石墨烯。3.如权利要求1所述的一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法，所述检测抗体孵化物Pd@PtM〇Se2-Ab2溶液的制备，其特征在于，步骤如下：1功能化PdNPs分散液的制备依次取90〜110mg聚乙烯吡咯烷酮，550〜650mg溴化钾和60〜70mg抗坏血酸溶于8mL超纯水中，加热至80°C保持10min;在磁力搅拌下加入50〜70mg四氯化钯酸钠，反应3h后，依次用超纯水和丙酮离心洗涤3次，制得PdNPs，重新分散在10mL超纯水中制得PdNPs分散液；分别取180〜2〇0mg十六烷基三甲基溴化铵和25〜30mg溴水杨酸溶于1〇mL超纯水中；加入1.0〜2.0mL的PdNPs分散液，超声震荡5〜9min，离心，用超纯水离心洗涤三次，重新分散在10mL超纯水中，得到功能化PdNPs分散液；2Pd@PtNPs分散液的制备将250〜270此、质量分数为1%是氯铂酸溶于5mL超纯水中，加入1mL功能化PdNPs分散液，超声震荡1〜2min，快速加入1mL、0.01molL的抗坏血酸溶液，快速震荡10〜15s，静置8〜10h，超纯水离心洗涤，重新分散于1〇mL超纯水中，制得Pd@PtNPs分散液；3氨基化MoSe2的制备将150〜17〇mg硒粉加入到5mL、质量分数为85%水合肼中，磁力搅拌2〜3h，制得溶液A;将200〜280mg钼酸钠加入到2〇mL超纯水中，制得溶液B;将A、B两溶液混合，磁力搅拌30min，转移到聚四氟乙烯高压釜中，200°C加热24h，冷却至室温，无水乙醇和超纯水离心洗涤3次，在60°C的真空千燥箱中干燥16〜24h，制得MoSe2;将100mgMoSe2和160〜200yL3-氨丙基三乙氧基硅烷依次加入到1〇mL无水乙醇中，70°C回流60〜70min，离心分离，超纯水离心洗涤，60°C真空干燥12h，得到氨基化MoSe2；4Pd@PtMoSe2的制备将25〜35mg氨基化MoSe2加至10mLPd@PtNPs分散液中，震荡10〜14h，离心分离，在40°C的真空千燥箱中干燥12〜18h，制得Pd@PtM〇Se2，5检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液的制备将4〜8mg的Pd@PtMoSe2加至1mL超纯水中，超声分散，再加入1〇〇此、80〜120ygmL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液和9〇〇yL、50mmolL的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，4°：恒温振荡培养箱中振荡，孵化12h，离心分离，将所得沉淀重新分散至丨mL、50mmolL的pH为7•0的磷酸盐缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物Pd@PtMoSe2-Ab2溶液，4°C下保存备用。4.如权利要求1所述的制备方法制备的一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器，用于肿瘤标志物的检测，包括以下步骤：1使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL、50mraolL的pH5.00〜9.00磷酸盐缓冲溶液中进行测试；2用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4v，取样间隔〇.1s，运行时间400s;3当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmolL的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中注入10yL、5molL的双氧水溶液，记录电流变化。5.如权利要求1、2、3、4所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述肿瘤标志物选自下列之一:糖分解烯醇酶NSE、鳞状细胞癌抗原SCCA。

百度查询： 山东理工大学 一种铂钯复合二硒化钼标记的夹心型免疫传感器的制备方法及应用

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