申请/专利权人：中国石油大学(华东)

申请日：2016-12-30

公开（公告）日：2020-02-11

公开（公告）号：CN106591198B

主分类号：C12N1/20(20060101)

分类号：C12N1/20(20060101);C02F3/34(20060101);C12R1/01(20060101);C02F101/34(20060101);C02F101/32(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.02.11#授权;2017.05.24#实质审查的生效;2017.04.26#公开

摘要：本发明提供了一株陶厄氏细菌Thauerasp.K11及其在降解含酚类化合物污泥废水中的应用，属于环境保护技术领域，能够在具备降解多种芳香族化合物能力的同时，还具备反硝化的能力，从而有效应用在污水尤其是石化废水的处理中。该菌株于2016年7月19日保藏在中国典型培养物保藏中心中国武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCCM2016399。本发明能够应用于含酚类化合物污水、尤其是石化废水的处理中。

主权项：1.一株陶厄氏细菌Thauerasp.K11在降解含多种酚类化合物污泥废水中的应用，其特征在于，所述细菌菌株于2016年7月19日保藏在中国典型培养物保藏中心中国武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCCM2016399，所述酚类化合物选自苯酚、邻甲苯酚、间甲苯酚、对甲苯酚、2,3-二甲基苯酚、2,4-二甲基苯酚、2,5-二甲基苯酚、2,6-二甲基苯酚、3,4-二甲基苯酚、3,5-二甲基苯酚和3-乙基苯酚中的一种或多种。

全文数据：陶厄氏细菌Thauerasp.K11及其在降解含酚类化合物污泥废水中的应用技术领域[0001]本发明属于环境保护技术领域，尤其涉及一株陶厄氏细菌Thauerasp.Kll及其降解含酚类化合物污泥废水中的应用。背景技术[0002]在含酚类物质的污水处理尤其是石化废水的处理过程中，多需要微生物的参与。目前，所报道的酚类降解细菌绝大多数营异养生长，且为好氧或兼性好氧菌。研究表明，酚类的降解主要发生在有氧存在的环境下，影响其降解的限速步骤的最重要的一步是苯环的打开。在大多芳香族化合物的生物降解过程中，均生成中心代谢中间产物邻苯二酚，微生物在好氧条件下，降解途径的第一步是将苯胺氧化成邻苯二酚。而邻苯二酚降解可以通过两种代谢途径，即邻位和间位代谢途径，分别由邻苯二酚1、2_双加氧酶或邻苯二酚2、3_双加氧酶催化。在污水生物处理过程中，常常要改变环境条件溶氧，pH等来满足不同污染物的降解要求。如常见的A20厌氧-缺氧-好氧，Anaerobic-Anoxic-Oxic工艺，就是通过改变污水的溶氧，即厌氧-缺氧-好氧达到污水中氮和磷等污染物的溶氧进行脱除的。类似这样的工艺过程虽然比传统的活性污泥法的效果好，但却增加了污水处理的成本。因此，开发一种可具有广泛环境适应性的高效污染物降解菌对于本领域将产生重要意义。[0003]陶厄氏细菌属（Thauera是贝塔变形菌纲下的一类革兰氏阴性菌，于1993年由Macy等人第一次定义了该菌株。目前分离到的陶厄氏细菌属细菌60余种，大部分具有反硝化、降解芳香族化合物的能力，可作为活性污泥中优势菌群广泛应用在污水处理中。另外有报道该菌属的部分细菌具有脱氮和分泌胞外多聚物的能力，在工厂或者生活污水生物处理系统的脱氮、反硝化、降低C0D以及重金属离子的吸附作用中具有重要意义。然而，目前为止，尚没有发现一株陶厄氏细菌在具备降解多种酚类化合物能力的同时，还具备反硝化的能力，从而可有效应用在污水尤其是石化废水的处理中。发明内容[0004]本发明提供了一株陶厄氏细菌ThaueraSP.K11及其在降解含酚类化合物污泥废水中的应用，能够在具备降解多种芳香族化合物能力的同时，还具备反硝化的能力，从而有效应用在污水尤其是石化废水的处理中。[0005]本发明的一方面提供了一株陶厄氏细菌Thauerasp.Kll，所述细菌菌株于2016年7月19日保藏在中国典型培养物保藏中心（中国武汉，武汉大学），保藏编号为：CCTCCΜ2016399。[0006]作为优选，所述陶厄氏细菌Thauerasp.Kll分离自石化污水中，菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐，革兰氏染色呈阴性，通过16SrRNA测序鉴定为陶厄氏细菌，16SrRNA序列分析结果为序列表中〈4001所示序列。[0007]本发明的另一方面提供了一种如上述技术方案所述的陶厄氏细菌Thauerasp.ΚΙ1在降解含多种酚类化合物污泥废水中的应用。[0008]作为优选，所述酚类化合物选自苯酚、邻甲苯酚、间甲苯酚、对甲苯酚、2，3-二甲基苯酚、2,4_二甲基苯酚、2,5_二甲基苯酚、2,6_二甲基苯酚、3,4_二甲基苯酚、3,5_二甲基苯酚和3-乙基苯酚中的一种或多种。[0009]作为优选，将所述陶厄氏细菌ThaueraSP.K11投放至含有酚类化合物的污泥废水中，实现所述细菌降解酚类化合物的作用。[0010]本发明的再一方面提供了一种以上述技术方案所述的陶厄氏细菌Thauerasp.Kll为活性成分的降解剂。[0011]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：[0012]本发明通过对陶厄氏细菌Thauerasp.Kll保藏编号为：CCTCCM2016399以及其对含酚类化合物的污泥废水、尤其是污泥石化废水中的降解研究，发现了陶厄氏细菌Thauerasp.Kll的用途，该菌株在高浓度含酚类化合物污水、尤其是石化废水中可以有效地降解多种酚类化合物，有效地去除了污水中的石油类和挥发性酚类污染物，在C0D为500mgL的污泥石化废水中，对苯酚、邻甲苯酚、间甲苯酚、对甲苯酚、2，4-二甲基苯酚、2，5-二甲基苯酚、2,6_二甲基苯酚、3,4_二甲基苯酚、3-乙基苯酚的去除率在76%以上，尤其是对苯酚、间甲苯酚、2,4_二甲基苯酚、3,4_二甲基苯酚的降解能力可达到100%以上。本发明将推动降解酚类污染物的细菌在污水、尤其是石化废水处理及其相关领域中的应用。附图说明[0013]图1为本发明实施例所提供的陶厄氏细菌Thauerasp.Kll的透射电镜照片；[0014]图2为本发明实施例所提供的陶厄氏细菌Thauerasp.Kll的16SrRNA序列系统进化树；[0015]图3为本发明实施例所提供的陶厄氏细菌Thauerasp.ΚΙ1在42小时内的增殖曲线；[0016]图4为本发明实施例所提供的陶厄氏细菌Thauerasp.Kll在气相色谱法分析中对甲基苯酚降解示意图。具体实施方式[0017]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0018]下述实施例中所用的各培养基配方如下：[0019]1种子培养基：[0020]种子培养基为LB培养基，其组成为：[0021]5g酵母粉，10g胰蛋白胨，10g氯化钠個体添加15gL琼脂）；[0022]1L去离子水，pH7.0，121°C条件下灭菌20分钟。[0023]2基础培养基：[0024]基础培养基为无机盐培养基MS，其组成为：[0025]K2HPO4·3H202.28gL，NaH2P〇4·2H200.47gL，（NH42S〇4l.32gL，MgS〇4.7H200.20gL最后加），lmVL微量元素母液，调至pH值为7.0，微量元素母液:CaCl22.63gL，FeS〇4·7H200.72gL，ZnS〇4·7H200.46gL，MnS〇4·H2O0.22gL;[0026]1L去离子水，调pH至6.8，121°C条件下灭菌20分钟。[0027]3苯酚降解途径检测培养基：[0028]苯酚降解途径的检测培养基为:无机盐培养基MS+苯酚[0029]实施例1[0030]菌株Thauerasp.Kll的培养与鉴定[0031]菌种培养和纯化:配制固体种子培养基;将菌体用无菌生理盐水进行稀释后涂布到上述固体种子LB培养基上，置于30°C的恒温箱中培养2-5天，用接种环挑取单菌落，得到纯菌。[0032]1形态特征[0033]菌株Thauerasp.Kll的菌落在LB固体培养基上呈圆形，乳白色，边缘整齐，革兰氏染色呈阴性，菌体短杆状，大小约为0·4-0·5μηι宽，1·0-1·5μηι长，如图1所示。[0034]⑵菌株1防rRNA鉴定[0035]使用细菌16SrRNA通用引物27F和1492R作为扩增引物，采取PCR方法扩增菌株Thauerasp.Kll的16SrRNA片段，电泳检测后，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，获得测序结果，并用美国国立生物技术信息中心NCBI的BLAST程序对该菌的16SrRNA序列和GenBank已收录的序列进行核苷酸同源性比对。如图2所示，发现与之序列相似性最大的是已知标准菌株ThaueraaromaticaDSM6984TX77118，相似度为97.49%。111为本发明实施例所采用的Thauerasp.Kll菌株。该菌株的16SrRNA序列GenBank数据库登录号为KX953213。[0036]3菌株生理生化特征[0037]对菌株Thauerasp.Kll进行了生理生化特征鉴定，结果如表1所示。[0038]表1Thauerasp.Kll的生理生化特征[0041]注:+，阳性;-，阴性;W，弱阳性[0042]实施例2[0043]苯酚含量测定方法[0044]利用酸类物质在pH=10.0±0.2的介质中，在铁氰化钾存在下，与4-氨基安替比林反应生成橙红色的吲哚酚安替比林染料，其水溶液在510nm波长处有最大吸收峰的特性，使用分光光度计测定其不同浓度下的吸光值，绘制出苯酚含量与吸光度的标准曲线，并得到拟合的计算公式。[0045]①苯酸标准液:称取0.5g无色苯酸溶于蒸馏水，定容至500ml，配成浓度为lgL苯酚溶液；[0046]②氨缓冲溶液:称取20gNH4C1白色固体溶于100ml的氨水中配成pH~10的氨缓冲溶液；[0047]③4-氨基安替比林溶液:称取2g4-氨基安替比林固体粉末溶于蒸馏水，定容至l〇〇ml，配成质量浓度为20%的浅黄色溶液；[0048]④铁氰化钾溶液:称取8g铁氰化钾红色颗粒溶于92ml的蒸馏水中，配成质量浓度为8%的铁氰化钾溶液。[0049]用去离子水和①-④所属溶液配制体积为lml的苯酚浓度梯度检测液。其中苯酚的含量分别为：〇yg、〇·lyg、〇·2yg、0·3yg、0·5yg、1·Oyg和2·Oyg;氨缓冲溶液：均为10μ1;4-氨基安替比林溶液:均为20μ1;铁氰化钾溶液:均为20μ1;不足lml的部分用去离子水补足。各溶液混匀，静置10分钟后，使用紫外分光光度计在波长510nm处测定吸光值。经绘制苯酚含量与吸光度的标准曲线后，得到拟合度高R2=〇.9987的计算公式:苯酚含量=5X吸光度值-0.3093.8269，如图3所示。[0050]细菌增殖测定方法：[0051]根据生物类实验惯例，细菌的增殖状态通过细菌培养液在波长为600nm时的吸光度0D600进行表征。[0052]①调整仪器吸光度:在分光光度计的光度模式下，将波长调整为600nm;[0053]②仪器调零:将空白培养基装入1cm比色皿，装入光路，调整吸光值为零；[0054]③0D值测定:将待测样品装入干净的培养基，读取吸光度数值。[0055]实施例3[0056]酚类化合物含量测定方法-气相色谱定量分析[0057]色谱定量分析的依据是根据被测物质的量与它在色谱图上的峰面积或峰高成正比。常用色谱分析方法有百分比法、归一化方法、内标法、外标法和标准加入法。我们测定酚类化合物含量采用内标法，内标法的优点是定量精度高。[0058]利用酚类化合物在气相色谱柱中不同的分离时间，可以把酚类化合物分离。具体操作方法是用待测组分的纯物质配成标准溶液，然后在等体积的这些标准溶液中加人浓度相同的内标物，混合后进行色谱分析。[0059]色谱条件:选用HP-5柱子。分流进样，分流进样比设定为20:1;进样口温度320°C;FID检测器温度320°C;程序升温，初始温度为60°C，恒温lmin，20°Cmin升温到320°C，恒温3min;空气流量为400mlmin，H2流量为40mlmin，进样量lul。[0000]经过气相色谱检测，菌株Thauerasp.Kll对酸类化合物降解效果见下表。[0061]表2Thauerasp.Kll对酸类化合物降解性能[0063]由表2降解试验可知，以500mgL上述物质计，Thauerasp.Kll对苯酸、邻甲苯酸、间甲苯酚、对甲苯酚、2，4_二甲基苯酚、2，5_二甲基苯酚、2,6_二甲基苯酚、3,4_二甲基苯酚、3-乙基苯酚的降解能力最好，可达到76%以上，尤其是对苯酚、间甲苯酚、2，4-二甲基苯酚、3,4_二甲基苯酚的降解能力可达到100%以上;其次，对邻甲苯酚、2,5_二甲基苯酚、3-乙基苯酚的降解能力可达到80%以上；对对甲苯酚、2，6_二甲基苯酚的降解能力可达到70%以上；再次是对2,3-二甲基苯酚、3,5-二甲基苯酚的降解能力可达到57%以上。以1000mgL上述物质计，Thauerasp.ΚΙ1对大部分物质的降解率可达到50%及以上程度。[0064]实施例4[0065]Thauerasp.Kll酸降解途径检测[0066]在以500mgL苯酸为唯一碳源的无机盐培养基中，30°C转速150rpm下，培养24小时后将菌液取出；培养液在l〇〇〇〇rmin，4°C离心10分钟，沉淀物以冰冷的O.lmol几磷酸缓冲液PH7.5清洗两次，然后重悬。将悬浮液在冰水浴条件下超声波破碎:循环99次，每次35，振荡35,功率120W。悬浮液以2000rmin，4°C离心30分钟，离心后用50mM磷酸缓冲溶液PH7.0清洗菌种2次;将菌种在磷酸缓冲溶液中超声破碎15分钟;之后再高速离心，得到粗酶提取液;分别移取2.9ml缓冲溶液、0.lml0.01molL的邻苯二酚溶液及0.lml的粗酶提取液于试管中摇匀，放入37°C的恒温水浴中。[0067]在零时刻加入酶，并同时将试管放入沸水中煮沸3min，之后分别将试管在l-18min内每隔一分钟取出，并煮沸3min，直至酶失活，反应终止;然后，分别将其放入紫外分光光度计中连续200nm-500nm扫描其光谱吸收特征。[0068]邻苯二酚存在两种分解方式，分别是：[0069]11，2-双加氧酶起作用底物后，产物为内酯，在波长为在260nm处有吸收峰。[0070]22,3-双加氧酶起作用底物后，产物为2-HMSA2-羟基粘康酸半醛），在波长为在375nm处有吸收峰。[0071]结果显示:在375nm处，1分钟时就有波峰出现，此后峰值越来越高，如图4所示。说明此酶分解邻苯二酚是从苯环两羟基的间位断开的，发现菌株Thauerasp.ΚΙ1是通过邻苯二酚2、3-双加氧酶催化酚进行降解。[0072]实施例5[0073]现场微生物多样性测定和水质检测[0074]对石化污水处理厂曝气池中的活性污泥进行三点采样。污泥样品经3000rmin离心15min后倒掉上清液、沉淀，立即保存于-80°C冰箱中。在48h内提取基因组DNA采用美国OMEGA公司的E.Z.N.A.TMSoilDNAKit试剂盒）。送上海美吉生物进行高通量测序Miseq，引物对515F907R。在相似度为97%的水平上，对微生物的0TUoperationaltaxonomicunit进行多样性分析。发现三点采样的活性污泥中Thauerasp.Kll数目和总的0TU数目分别为：586541848~14%;489636516~13%和512032298~16%。表明，Thauerasp.Kll为此石化污水处理厂活性污泥中的优势菌群。采用中国环境科学出版社《水和废水监测分析方法》第四版进行污水处理厂进出水水质分析，结果如下：[0075]进水：[0076]COD:1224·6mgL，氨氮：67·3mgL，石油类：301·2mgL，悬浮物：778·6mgL，pH:7.68,挥发酚:31.3mgL，硫化物:47·7mgL。[0077]出水：[0078]COD:117.3mgL，氨氮：15.2mgL，石油类:4.6mgL，悬浮物：57.lmgL，pH:7.48,挥发酸:未检出，硫化物:0.〇29mgL。[0079]表明，在此石化污水处理厂中，Thauerasp.Kll菌株作为优势菌群对于活性污泥中的石油类和挥发酚有很好的降解效果，从而可证明菌株K11在处理石化废水中有较好的开发利用前景。

权利要求：1.一株陶厄氏细菌Thauerasp.ΚΙ1，其特征在于，所述细菌菌株于2016年7月19日保藏在中国典型培养物保藏中心（中国武汉，武汉大学），保藏编号为:CCTCCΜ2016399。2.根据权利要求1所述的陶厄氏细菌Thauerasp.Kll，其特征在于，所述陶厄氏细菌Thauerasp.Kll分离自石化污水中，菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐，革兰氏染色呈阴性，通过16SrRNA测序鉴定为陶厄氏细菌，16SrRNA序列分析结果为序列表中〈4001所示序列。3.-种如权利要求1或2所述的陶厄氏细菌Thauerasp.Kll在降解含多种酸类化合物污泥废水中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述酚类化合物选自苯酚、邻甲苯酚、间甲苯酚、对甲苯酚、2,3_二甲基苯酚、2,4_二甲基苯酚、2,5_二甲基苯酚、2,6_二甲基苯酚、3，4-二甲基苯酚、3,5_二甲基苯酚和3-乙基苯酚中的一种或多种。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述陶厄氏细菌Thauerasp.Kll投放至含有酚类化合物的污泥废水中，实现所述细菌降解酚类化合物的作用。6.-种以权利要求1所述的陶厄氏细菌Thauerasp.ΚΙ1为活性成分的降解剂。

百度查询： 中国石油大学(华东) 陶厄氏细菌Thauera sp.K11及其在降解含酚类化合物污泥废水中的应用

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