申请/专利权人：中南大学湘雅二医院

申请日：2018-12-06

公开（公告）日：2020-02-14

公开（公告）号：CN109369797B

主分类号：C07K14/54(20060101)

分类号：C07K14/54(20060101);C12N15/85(20060101);C12N5/078(20100101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.02.14#授权;2019.03.19#实质审查的生效;2019.02.22#公开

摘要：本发明提供了一种重组人IL‑21蛋白及其制备和应用。将人IL‑21碱基序列进行优化，删去非编码序列及编码序列上的分泌肽段，将IL‑21编码序列与真核表达载体连接进行表达。本发明采用人源的HEK293F人胚肾细胞作为宿主细胞进行蛋白表达，并创新性的采用悬浮培养及转染，提高重组蛋白表达效率。表达的重组蛋白折叠及翻译后修饰都与生理蛋白极其相似，最大程度的保持人IL‑21蛋白的空间结构和生理功能。该IL‑21蛋白具有高纯度、高免疫原性，与商品化IL‑21蛋白相比，具有更强的刺激Tfh细胞分化的能力。可用于免疫治疗和诊断，研究免疫细胞等方面。同时本发明创新性的发现细胞因子IL‑21对外泌体的分泌具有重要作用，可作为外泌体及抗肿瘤研究的新方向。

主权项：1.一种重组人IL-21蛋白的制备方法，其特征在于，提取Tfh细胞的总mRNA并逆转录为cDNA作为PCR扩增模板，设计引物扩增人IL-21基因，引入酶切位点；对载体质粒及目的片段双酶切，经连接酶构建重组质粒；构建成功的重组质粒转染入HEK293F细胞，之后大批量悬浮培养HEK293F细胞，收集培养基上清内蛋白进行纯化获得重组人IL-21蛋白；所述的重组人IL-21蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。

全文数据：一种重组人IL-21蛋白及其制备和应用技术领域本发明属于人IL-21蛋白表达、制备和应用技术领域，具体涉及一种重组人IL-21蛋白及其制备和应用方法。背景技术IL-21是一种重要的自身炎症因子，在多种自身免疫性疾病中均有明显增高，其蛋白制品可广泛应用但不局限于IL-21自身抗体检测，抗IL-21抗体的研制，信号通路的研究，在疾病中作用的研究，新型治疗方法的开发等。外源蛋白的表达往往与多种因素相关，包括复制、转录和翻译的效率，蛋白质的折叠等。尤其是蛋白质的折叠及翻译后修饰很大程度上决定了蛋白质的生理功能和免疫原性。目前常用的表达系统有原核表达系统和真核表达系统，原核表达系统如：大肠杆菌，真核表达系统常用酵母细胞，昆虫细胞，哺乳动物细胞等；哺乳动物细胞常用中国仓鼠卵巢细胞CHO，NSO细胞，SP20细胞，Cos-7细胞，PER.C6细胞。上述这些细胞系并不是人源细胞，没有人源细胞的特殊辅助因子、分子伴侣和翻译后修饰，可能会使蛋白错误折叠，许多经过真核表达系统获得的蛋白没有生理功能或生理功能远低于天然蛋白。本发明将人IL-21碱基序列进行优化，设计引物，采用cDNA为模板删去非编码序列及编码序列上的分泌肽段，将IL-21编码序列与真核表达载体进行连接，提高重组人IL-21蛋白的表达及分泌效率。同时，本发明采用人源的HEK293F人胚肾细胞作为宿主细胞进行蛋白表达，并创新性的采用悬浮培养及转染，提高重组蛋白表达效率。本发明表达的重组蛋白折叠及翻译后修饰都与生理蛋白极其相似，最大程度的保持人IL-21蛋白的空间结构和生理功能。近几年研究热点之一的外泌体是由细胞分泌的微小囊泡直径30-150nm，存在于所有体液之中。这些外泌体囊泡包含独特的RNA和蛋白质，并具有许多生物学功能，例如参与细胞间的交流和信号传递，但人们对外泌体的功能和调控途径仍然知之甚少。本发明创新性的发现重组人IL-21蛋白对人外周血单个核细胞释放外泌体具有重要作用，并存在显著的高浓度抑制现象，该发现尚未有相关文献报道。首次提出IL-21对细胞释放外泌体具有显著的调控作用，本发明认为IL-21对外泌体的影响可作为一个新的研究方向。发明内容本发明的首要目的是提供一种与人IL-21细胞因子空间结构接近并且具有IL-21生理功能的重组蛋白及其制备方法。一种重组人IL-21蛋白的制备方法，提取Tfh细胞的总mRNA并逆转录为cDNA作为PCR扩增模板，设计引物扩增人IL-21基因，引入酶切位点；对载体质粒及目的片段双酶切，经连接酶构建重组质粒；构建成功的重组质粒转染入HEK293F细胞，之后大批量悬浮培养HEK293F细胞，收集培养基上清内蛋白进行纯化获得重组人IL-21蛋白。上述的制备方法中扩增人IL-21基因的引物包括但不限于以下序列所示：上游引物：5’-CGGATCCCCTGGTCCACAAATCAAGCTCC-3’,下游引物：5’-CCTCGAGGGGAATCTTCACTTCCGTGTGTTCTA-3’。上述的制备方法中分别在上游引物引入BamHI内切酶位点，下游引物引入XhoI内切酶位点。上述的制备方法中所述的载体质粒包括：pSecTag2。上述的制备方法中所述的重组人IL-21蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。上述的制备方法中，收集培养基上清内蛋白用His纯化柱进行初步纯化，并进行免疫印迹及考马斯亮蓝染色验证，根据考马斯亮蓝染色结果选择合适大小的分子筛进行再次纯化及脱盐浓缩，得到纯度在90％以上的重组人IL-21蛋白。进一步的，本发明采用如下详细的技术方案：取正常人外周血，密度梯度离心法无菌分离PBMC，采用Miltenyi公司的MACSCD4+Tkit进行磁珠分选，获得T细胞后进行体外诱导分化，5天后收集Tfh细胞，提取总mRNA并逆转录为cDNA作为PCR扩增模板，设计引物扩增人IL-21基因，分别在上游引入BamHI内切酶位点，下游引入XhoI内切酶位点。对载体质粒pSecTag2及目的片段同样用BamHI及XhoI双酶切进行处理，经T4DNA连接酶构建重组质粒。将重组质粒转化入DH5α菌，挑取单个克隆菌落，进行菌液PCR及双酶切验证，选择含有目的片段的重组质粒送铂尚公司测序鉴定。构建成功的重组真核表达载体pSecTag2-IL21经过Lipofectamine2000转染入HEK293F细胞，将培养基上清和细胞分别进行免疫印迹WesternBlot鉴定。之后大批量悬浮培养HEK293F细胞并转染IL-21重组表达质粒，收集培养基上清内蛋白用GE公司的His纯化柱进行初步纯化，并进行免疫印迹WesternBlot及考马斯亮蓝染色验证。根据考马斯亮蓝染色结果选择合适大小的分子筛Millipore公司进行再次纯化及脱盐浓缩，经考马斯亮蓝染色验证，得到纯度在90％以上的重组人IL-21蛋白。通过细胞诱导分化实验，流式细胞学检测验证重组蛋白功能。通过在正常人PBMCs的培养基中加入梯度浓度的重组人IL-21蛋白并以商业化IL-21蛋白作为对照，超高速离心法提取外泌体，通过检测外泌体蛋白浓度评价外泌体分泌量。本发明的次要目的是提供上述重组人IL-21蛋白的应用，包括：所述的重组人IL-21蛋白在抑制外周血单个核细胞分泌外泌体中的研究应用。所述的重组人IL-21蛋白在制备抑制外周血单个核细胞分泌外泌体制剂中的应用。本发明提供的承载人生理IL-21序列的真核细胞表达载体，是可在HEK293F人源细胞等真核细胞中高表达的真核表达载体，并探索出一套该表达载体表达纯化重组IL-21蛋白的技术。本发明制备出来的新型人源细胞表达的重组人IL-21蛋白，与现有原核表达的人IL-21蛋白相比空间结构更接近天然蛋白，并且活性更强，具有优异的诱导Tfh细胞分化的生理功能。该重组人IL-21蛋白可用于免疫治疗和诊断，例如制备高特异性的单克隆抗体、ELISA试剂盒检测自身抗体等，可用于免疫细胞的研究，诱导Tfh等免疫细胞增殖分化或作为细胞因子研究信号通路。本发明首次发现该重组人IL-21蛋白作用于正常人外周血单个核细胞可引起外泌体分泌显著减少，创新性的提出细胞因子新的作用方向，可用于外泌体研究。附图说明图1：本发明重组表达载体构建流程图；图2：本发明扩增出来的IL-21蛋白的核酸序列及质粒双酶切电泳结果；图3：本发明重组表达载体菌液PCR及双酶切验证结果；3-1菌液PCR验证结果，3-2重组质粒双酶切验证结果；图4：本发明重组IL-21蛋白真核表达的鉴定及不同培养方式对比，4-1重组蛋白在293F细胞培养基上清表达结果，4-2重组蛋白在293F细胞贴壁培养及悬浮培养表达结果；图5：本发明重组蛋白初次纯化后考马斯亮蓝染色及免疫印迹结果，5-1各滤过液的考马斯亮蓝染色结果，5-2洗脱液的考马斯亮蓝染色结果，5-3免疫印迹结果；图6：本发明重组蛋白再次纯化后考马斯亮蓝染色；图7：本发明重组蛋白功能，7-1重组蛋白诱导分化流式结果，7-2重组蛋白诱导分化统计结果，7-3重组蛋白调控外泌体分泌统计结果。具体实施方式以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售产品。实施例11载体pSecTag2-IL21的构建1.1密度梯度离心法获得PBMC经知情同意后，抽取正常人静脉血，约60ml，分装在3支50ml无菌离心管中，每管20ml，加入20Uml肝素，颠倒混匀，每管血中加入20ml常温PBS，充分混匀；取50ml的无菌离心管，每管加入10-15mldensitylymphocyteisolationsterilesolution无菌淋巴细胞分离液GE公司17-1440-03，用移液管沿管壁缓慢将外周血加于淋巴细胞分离液上；2000rpm加速减速均为0，18℃，离心30min，吸取以单个核细胞为主的白色云雾层，置入另一离心管中；吸取30mlPBS至离心管中，充分混匀，4℃，1600rpm离心15min；同上述步骤用PBS洗细胞两次，得到PBMC，进行细胞计数。1.2外周血CD4+T细胞的分离纯化使用Miltenyi公司的CD4+TCellisolationKitII,human细胞分选试剂Miltenyi公司130-094-131从PBMCs中分离CD4+T细胞：每107个细胞加入40μl预冷的buffer1000mlPBS中加入0.58gEDTA，5gBSA，混匀并过滤除菌重悬PBMC细胞；10μlCD4+TcellBiotin-AntibodyCocktailII，充分吹打混匀，避免产生气泡；放置4℃，避光孵育5min；30μl预冷的buffer充分混匀；20μlCD4+TcellMicroBeadCocktailII，充分吹打混匀，避免产生气泡；放置4℃，避光孵育10min；将LS分离柱放置在分选器上，将3ml预冷的buffer加入LS分离柱中，使分离磁珠润湿，润柱液丢弃；用移液枪将孵育好的细胞悬液加入分离柱；等分离柱中液体滴完后，再用预冷的3mlbuffer洗涤装了细胞的离心管和分离柱，每次3ml共3次；收集流出的液体，1000rpm，4℃，离心10min，细胞计数。1.3诱导CD4+T细胞向Tfh细胞分化取24孔培养板，提前加入0.5ml含5μgmlAnti-CD3抗体的PBS溶液，将24孔板放入细胞培养箱37℃孵育4-6h；用含10％FBS四季青公司11011-8611和青链霉素双抗碧云天公司C0222的RPMI-1640细胞培养基gibco公司C11875500，重悬CD4+T细胞；取出包被Anti-CD3抗体后的24孔板，用移液器弃去孔板中的PBS；取5×105个mlCD4+T细胞加入孔板中，每孔1ml培养液；向24孔板中加入相应抗体和细胞因子，诱导CD4+T细胞向Tfh细胞分化，各成分及终浓度为：诱导分化5天后收集细胞进行后续实验。1.4总RNA提取收集细胞离心后弃上清，用PBS将细胞洗涤两遍，每管细胞中加入TRIzo试剂Thermofisher公司155960261ml，充分吹打混匀，室温下静置5min，吹打，使细胞完全裂解，移至新的1.5mlEP管中；加入200μl4℃预冷的氯仿，剧烈震荡混匀；4℃，12000rpm，离心15min；将上层水相移至另一新的1.5mLEP管内；加入等量的4℃预冷的异丙醇，上下轻柔颠倒混匀，-20℃放置3-4h；4℃，12000rpm，离心30min；弃上清，加入4℃预冷的75％无酶乙醇1ml，轻柔上下颠倒洗涤RNA沉淀，4℃，7500rpm，离心5min，重复洗涤一次；弃上清，用移液枪将液体吸干，室温干燥RNA约5min，加入20μl无酶水，充分溶解RNA沉淀，测量浓度和OD值，置于-80℃冰箱保存。1.5cDNA的制备冰上溶解RNA样本。进行基因组DNA去除反应，用PrimeScriptRTreagentKitWithgDNAEraser试剂Takara公司RR047A，取无酶200μlPCR反应管，置于冰上，按下表依次加入：轻弹管壁充分混匀，简短离心，42℃孵育2min，4℃孵育5min。将反应管置于冰上，按照下表进行逆转录，用PremixExTaqTMTliRNaseHPlus试剂盒Takara公司RR420A反应液配置：混匀，简短离心后放入PCR仪上；37℃孵育15min，85℃孵育5s，4℃维持；收集cDNA保存于-20℃。1.6PCR扩增目的基因对IL-21碱基序列进行优化，通过设计引物并进行PCR扩增去除非编码序列及编码序列中的分泌段。扩增人IL-21基因的引物序列为擎科公司合成：上游引物：5’-CGGATCCCCTGGTCCACAAATCAAGCTCC-3’BamHI,下游引物：5’-CCTCGAGGGGAATCTTCACTTCCGTGTGTTCTA-3’，互补序列为：5’-GGAGCTCCCCTTAGAAGTGAAGGCACACAAGAT-3’XhoI。上游引入BamHI内切酶位点，下游引入XhoI内切酶位点。以cDNA为模板，按照下表配置PCR反应体系：PCR反应条件为：1.94℃5min2.94℃30s3.57.1℃30s4.72℃1min2-4重复35个循环5.72℃5min6.4℃维持1.7胶回收目的片段采用生工公司SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒B518131-0050，通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的片段与其他杂带分开，用干净的手术刀将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入EP管中，称重；每100mg琼脂糖加入300ulBufferB2，50℃水浴5-10min，至胶块完全溶化，加入BufferB2体积13的异丙醇，混匀，移入吸附柱，10000rpm离心30s，加入300ulBufferB2，10000rpm离心30s，加入500ulWashSolution，10000rpm离心30s，重复洗涤一次，空柱离心10000rpm离心30s，加入30ulElutionBuffer室温静置1-2min，10000rpm离心30s，DNA至于-20℃保存。1.8重组表达载体的构建载体质粒选择pSecTag2A以下简称pSecTag2invitrogen公司，catalognumberV900-20，可用氨苄青霉素进行筛选。上述胶回收产物经过BamHI及XhoI内切酶均为Takara公司1010S，1094S处理之后与同样用BamHI及XhoI双酶切的载体pSecTag2经T4DNALigaseTakara2011A连接，通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将含粘性末端片段与被切下来的片段分开，用干净的手术刀将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入EP管中，称重，电泳结果如图2所示。酶切加样体系如下：加样物IL-21DNA体积pSecTag2体积BamHI1ul1ulXhoI1ul1ul10xKBuffer2ul2ulDNA6.3ul3.2ulH2O9.7ul12.8ul总计20ul20ul反应条件：37℃水浴4小时。分别进行1％琼脂糖凝胶电泳及胶回收。将上述回收产物按3molIL-21：1molpSecTag2进行连接，连接加样体系如下：加样物体积pSecTag212.6ulIL-213.4ulT4Ligase酶2ul10xBuffer2ul总计20ul反应条件：16℃水浴过夜。1.9重组表达载体的筛选将冻存的TOP10感受态细胞天根公司CB104从-80℃冰箱取出，冰上融化，取3管感受态细胞，1管做未转化对照，1管做转化空质粒对照，1管加入重组质粒。将5ul重组质粒加入感受态细胞中，轻柔吹打混匀，冰上放置30min，在精确的42℃水浴中热击90s，迅速移到冰盒中冷却5min，向每管转化细菌中加入室温的800ulLB-培养基。摇床中37℃振荡培养150rpm，30-60min。室温3000rpm，离心5min，弃上清，轻柔重悬细菌，涂布于Amp+LB培养板，设空白平皿、未转化平皿、转化空质粒平皿、转化重组质粒平皿。37℃培养箱过夜培养，第二天挑取单个克隆菌落，在30ulLB培养基中混匀，取5ul进行菌液PCR，余下放入小管Amp+LB液体培养基中，37℃摇菌4-5h。菌液PCR，反应体系如下：PCR反应条件同上，挑选序号1#-13#的单克隆菌落进行菌液PCR，结果如图3-1所示，序号为2#，6#，10#的单克隆菌落可见目的片段即菌液PCR阳性。选择菌液PCR阳性的单克隆菌在Amp+LB液体培养基中进行小量摇菌并保种。1.10重组表达载体的鉴定采用生工公司SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒B518191-0050进行小量质粒提取。取过夜培养菌液20ml，室温8000g，离心5min，弃上清，在沉淀中加入250ulBufferP1，彻底悬浮菌体，加入250ulBufferP2，颠倒混匀，室温静置5min，加入350ulBufferP3，颠倒混匀，离心机最大转速离心20min，将上清全部小心移入吸附柱，8000g，离心30s，加入500ul去蛋白液BufferDW1，8000g，离心30s，加入500ulWashSolution，8000g，离心30s，重复洗涤一次，空柱离心8000g，30s，在吸附膜中央加入60ulElutionBuffer，室温静置1min，8000g，离心1min，测浓度及A260280。小量抽提的重组质粒和空质粒均经过BamHI及XhoI内切酶处理，反应条件同前所述，双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果如图3-2所示，2#及10#重组质粒双酶切后含有目的片段。选择含有目的片段的重组质粒送公司测序，测序结果见序列表中SEQNO.6，结果表明优化的重组表达载体pSecTag2-IL21构建成功。重组表达载体pSecTag2-IL21的构建流程图见图1所示。实施例22重组IL-21蛋白的表达、纯化、鉴定2.1重组IL-21蛋白的表达真核表达载体选择人胚肾细胞HEK293F医学表观基因组学湖南省重点实验室保种。饲养条件为FreeStyleTMF17ExpressionMedium无血清培基Thermofisher公司A1383504，37℃，5％二氧化碳细胞培养箱，细胞摇床转速在200-300rpm，每天更换一定量的新鲜Freestyle无血清培养基使细胞密度在0.5-1.5x106个ml。每2-3天传代一次，直至培养两天后细胞密度能达到1.0-1.2x106个ml，活力95％以上，可用于转染，细胞计数后调整细胞密度为1.0x106个ml。重组质粒过滤除菌，转染用LipofectamineTM2000以下简称lipo2000invitrogen公司CatalogNumber：11668。待转染的HEK293F细胞1.0x106个ml，根据下表用Opti-MEMTMReducedSerumMedium无血清培养基Thermofisher公司31985070稀释LipofectamineTM2000和重组质粒DNA，室温下静置5分钟。混合LipofectamineTM2000和DNA的稀释液，轻轻混匀并在室温下静置15分钟。将待转染的细胞培养瓶从细胞摇床中取出，加入转染混合液后放回细胞摇床，于37℃5％二氧化碳细胞培养箱中培养48-72小时。2.2重组IL-21蛋白表达的鉴定经过48-72小时悬浮培养后分别收集培养上清及细胞进行免疫印迹WesternBlot鉴定。直接收集培养基上清备用，收集细胞至1.5mLEP管，加入PBS缓冲液，将细胞冲洗两遍，离心去除PBS，配制含PMSF的RIPA细胞总蛋白裂解工作液RIPA:PMSF＝100:2每管加入50-100ul，充分吹打混匀，置于冰上孵育30min，使细胞充分裂解，打开Bioruptor超声破碎仪，于低档超声破碎细胞；12000rpm，4℃，离心10min，吸取上清至1.5mLEP管。提取总蛋白的浓度使用Thermo公司的BCA试剂盒进行定量。计算并配制蛋白上样缓冲液，取等体积细胞培养上清配制上样缓冲液并使得从细胞中提取的总蛋白量在各管之间保持一致。配制12％SDS-PAGE并安装入电泳槽，加入1×SDS-PAGE电泳液，取配好的蛋白上样缓冲液进行上样。电泳条件为80V恒压，电泳20-30min，蛋白条带跑至浓缩胶与分离胶交界处时，将电泳条件改为120V恒压，30-60min。将SDS-PAGE和PVDF膜安装入转膜夹置于湿转仪中，加入转膜缓冲液，350mA恒流，转膜90min。转膜结束后，将PVDF膜置于5％的脱脂牛奶，脱色摇床上室温封闭1小时。分别用兔抗IL-21多克隆抗体abcam公司ab5978、兔抗His-tag单克隆抗体CellSignalingTechnology公司12698T、鼠抗β-Actin金斯瑞公司A007301:1000稀释作为一抗，4℃孵育过夜；辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG金斯瑞公司A00098、A001601:5000稀释作为二抗，室温孵育1h；化学发光显色，如图4-1结果显示，4-1表示未转染细胞的培养基上清中无IL-21分泌，而转染细胞的培养基上清中有大量IL-21分泌，HEK293F真核表达的蛋白为IL-21重组蛋白，且IL-21重组蛋白分泌至培养基上清。2.3重组IL-21蛋白大规模表达条件优化为优化重组IL-21蛋白大规模表达条件，对HEK293F细胞培养及转染条件进行优化。选取状态良好的HEK293F细胞以相同细胞数及培养基体积转至6孔板中继续培养，设置贴壁培养组：HEK293F细胞0.8x106个ml重悬于2.5ml含10％FBS的DMEMbasicgibco公司C11995500完全培养基中重新铺板，于37℃5％二氧化碳细胞培养箱中培养；设置悬浮培养组：HEK293F细胞0.8x106个ml重悬于2.5mlFreeStyle无血清培基中重新铺板，于37℃5％二氧化碳细胞培养箱中培养，细胞摇床转速在200-300rpm；24小时后观察贴壁培养细胞汇合度达85-90％，悬浮培养细胞呈单个无抱团现象即按下表进行转染：重组质粒过滤除菌，转染用LipofectamineTM2000，根据上表分别用250ulOpti无血清培养基稀释LipofectamineTM2000和重组质粒DNA，室温下静置5分钟，混合LipofectamineTM2000和DNA的稀释液，轻轻混匀并在室温下静置15分钟。将贴壁培养HEK293F细胞的6孔板用Opti无血清培养基洗涤2次，用2.5ml新鲜Opti无血清培养基铺板，加入500ul转染混合液，轻摇混匀，37℃5％二氧化碳细胞培养箱中培养4-6小时，将培养基吸出，换为3ml含10％FBS的DMEM完全培基，继续培养48-72小时。将悬浮培养HEK293F细胞的6孔板从细胞摇床中取出，加入500ul转染混合液，轻摇混匀，放入37℃5％二氧化碳细胞培养箱中继续培养48-72小时，细胞摇床转速为200rpm。分别收集细胞培养上清及细胞沉淀，用2.2中所述方法提取细胞内蛋白，取相同体积细胞培养上清及相同质量细胞总蛋白配制蛋白上样缓冲液，用12％SDS-PAGE胶进行电泳及转膜，具体操作如2.2所述。分别用兔抗IL-21多克隆抗体、兔抗His-tag单克隆抗体、羊抗GAPDH金斯瑞公司A001921:1000稀释作为一抗，4℃孵育过夜；辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗兔IgG、驴抗羊IgG金斯瑞公司A001781:5000稀释作为二抗，室温孵育1h。化学发光显色如图4-2结果所示，重组人IL-21蛋白在悬浮培养体系中的表达量远大于贴壁培养体系，并且悬浮培养体系中分泌至培养基上清的重组IL-21及细胞中重组IL-21均有较高表达量。当DNA:Lipo2000为1:2.5时悬浮培养上清中分泌重组IL-21效率最高，DNA:Lipo2000为1:2及1:2.5时细胞中表达重组IL-21效率高且两者间无明显差异。综上，优化的大规模表达条件为HEK293F进行悬浮培养，DNA:Lipo2000为1:2.5。2.4重组IL-21蛋白的纯化及鉴定根据2.3的优化条件大规模悬浮培养HEK293F细胞并进行转染、表达，收集转染后48-72小时的上清，选择HisGraviTrap纯化柱GE公司11-0033-99进行重组IL-21蛋白的初步纯化。安装His纯化柱，用10ml含0mM咪唑的洗涤液10ml平衡柱子，加入含重组蛋白的培养基上清过柱，分别用含0mM、10mM、20mM咪唑的洗涤液20ml洗柱，用含500mM咪唑的洗脱液3ml洗脱。收集各部分滤液，进行SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色碧云天公司P0017，操作步骤及所用试剂同前所述，鉴定纯化后重组蛋白，结果如图5-1及5-2所示，在含0mM，10mM，20mM咪唑的洗涤液中可见少量杂蛋白条带，目的条带出现在含500mM咪唑的洗脱液中，增大含500mM咪唑洗脱液的上样量可见目的条带位置在35kDa附近且纯度较高，因此后续纯化可选用30kDa分子筛进行去盐浓缩。同样的样本进行WesternBlot鉴定，证明该重组蛋白为重组IL-21His-tagged蛋白，结果如图5-3所示，目的条带仅存在于未进行纯化的原液及含500mM咪唑的洗脱液中，并且在洗脱液中得到富集浓缩。用30kDa分子筛Millipore公司UFC803008进行重组蛋白的进一步纯化及去盐浓缩。将含重组蛋白的elutionbuffer加入30kDa分子筛，低温，离心机最大转速，离心30min，弃掉离心管内分子筛下液体，加入PBS置换重组蛋白的溶剂，重复离心，直至蛋白浓缩达到满意浓度，收集分子筛内液体，进行SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，鉴定再次纯化后重组蛋白的纯度，结果如图6所示，可见目的蛋白纯度达到90％，目的条带位于35kDa左右。3重组人IL-21蛋白的功能3.1外周血CD4+T细胞的分离纯化密度梯度离心法获得PBMCs，具体步骤同1.1，获得3例正常人PBMCs。使用Miltenyi公司CD4MicroBeads,human细胞分选试剂130-045-101从PBMCs中分离CD4+T细胞。将计数后PBMCs加入预冷的buffer和MACSCD4磁珠，每107个细胞加入80μlbuffer和20μlMACSCD4磁珠，使用移液枪将细胞吹打混匀，注意避免产生气泡，将细胞置于4℃，避光孵育15min；加入20ml预冷buffer，混匀，2000rpm加速度为8，减速度为9，4℃，离心10min；弃上清，用500ul预冷buffer将细胞重悬，放置于冰上。将LS分离柱放置在MidiMACS分选器上，将3ml预冷buffer加入LS分离柱中，使分离磁珠润湿。当分离柱中的buffer滴完后，用移液枪将已孵育磁珠的细胞悬液加入分离柱中，加柱的过程中避免产生气泡，等液体滴完后再用预冷buffer洗涤分离柱，共3次，每次使用3ml，弃掉流出液体。将LS分离柱从磁场中移出，放置在15ml离心管上，加入5ml预冷buffer，使用推送器，将buffer推挤至15ml离心管中；2000rpm加速度为8，减速度为9，4℃，离心10min；去上清，管底的沉淀即为CD4+T细胞，用于后续实验。3.2诱导CD4+T细胞向Tfh细胞分化取24孔培养板，提前加入0.5ml含5μgmlAnti-CD3抗体的PBS溶液，将24孔板放入细胞培养箱37℃孵育4-6h；取出包被Anti-CD3抗体后的24孔板，用移液器弃去孔板中的PBS。将每例CD4+T平均分为：1.标准诱导分化组，加入终浓度为20ngml商品化IL-21peprotech公司200-21；2.0ngml诱导分化组，加入终浓度为0ngml的重组人IL-21；3.10ngml诱导分化组，加入终浓度为10ngml的重组人IL-21；4.20ngml诱导分化组，加入终浓度为20ngml的重组人IL-21；5.40ngml诱导分化组，加入终浓度为40ngml的重组人IL-21。各成分及终浓度按照下表加入含10％FBS的RPMIMedium1640basic细胞培养基gibcoC11875500，分别重悬各组CD4+T细胞，使细胞终浓度为5×105ml并加入孔板中，每孔1ml培养基，于37℃5％二氧化碳细胞培养箱中培养。分组Anti-CD28IL-21IL-12TGF-β1IL-6标准诱导分化组2μgml20ngml10ngml5ngml20ngml0ngml诱导分化组2μgml0ngml10ngml5ngml20ngml10ngml诱导分化组2μgml10ngml10ngml5ngml20ngml20ngml诱导分化组2μgml20ngml10ngml5ngml20ngml40ngml诱导分化组2μgml40ngml10ngml5ngml20ngml3.3流式细胞检测Tfh细胞分化每个12×75mm流式管加入5×105个诱导分化的细胞，加入1ml预冷的PBS，1600rpm，4℃，离心10min；倒掉上清，使用预冷PBS缓冲液将细胞清洗两次，1600rpm，4℃，离心10min；倒掉上清，用管内剩余的少量PBS缓冲液重悬细胞，最终体积在100μl左右。需准备1-3x105个细胞加入空白管和3个单阳管。每个流式管分别按照下表加入相应的流式表面抗体，涡旋混匀，在4℃避光孵育30分钟。分组抗体空白管-APC单阳0.5ulAPCanti-humanCD4BD公司551980PE单阳0.5ulPEanti-humanCXCR5eBioscience公司12-9185-42PE-Cy7单阳0.5ulPE-Cy7anti-humanPD1eBioscience公司25-4714-80样本管1ulAPCanti-CD4,1ulPEanti-CXCR5,1ulPE-Cy7anti-PD1每管加入1mlPBS缓冲液洗涤，1600rpm，4℃，离心10min，弃上清，重复一次；加入200ulPBS重悬细胞，用BDFACSCantoII流式机进行检测，用FlowJo软件进行分析，圈取淋巴细胞分群，在CD4+细胞亚群中以CXCR5+PD-1+为Tfh细胞分群，流式结果如图7-1所示。用GraphPadPrism7软件对流式结果进行统计分析，采用配对T检验，结果如图7-2所示。可见0ngml重组IL-21诱导分化组TfhCD4+CXCR5+PD1+细胞分群显著少于标准诱导分化组及加入不同浓度重组IL-21的诱导分化组，10ngml、40ngml重组IL-21诱导分化组与标准诱导分化组之间无明显差异，20ngml重组IL-21诱导分化组Tfh细胞分群比例高于标准诱导分化组含商业化IL-2120ngml。即重组人IL-21蛋白具有刺激CD4+向Tfh细胞分化的生理功能，且相同浓度下诱导分化能力高于商业化IL-21蛋白；重组IL-21蛋白的诱导分化能力与浓度有关，呈现低浓度促进高浓度抑制的趋势，进一步说明重组人IL-21蛋白功能具有剂量反应关系。3.4重组人IL-21蛋白对外泌体分泌的影响密度梯度离心法获得PBMCs，具体步骤同1.1，获得3例正常人PBMCs，用PBS洗涤细胞并计数，离心获得细胞沉淀，将每例PBMCs分5组，每组1.5x107个细胞。1.标准对照组，加入终浓度为20ngml商品化IL-21peprotech公司200-21；2.0ngml组，加入终浓度为0ngml的重组人IL-21；3.10ngml组，加入终浓度为10ngml的重组人IL-21；4.20ngml组，加入终浓度为20ngml的重组人IL-21；5.40ngml组，加入终浓度为40ngml的重组人IL-21。未加入其它成分或细胞因子。将重组人IL-21及商业化IL-21按各组终浓度加入含10％FBS的RPMIMedium1640basic细胞培养基，分别重悬各组PBMCs细胞，使细胞密度为1×106个ml并加入24孔板中，每孔1ml培养基，于37℃5％二氧化碳细胞培养箱中培养48小时。收集培养基，500g500rcf，4℃，离心10min去除细胞，收集上清2000g2000rcf，4℃，离心10min去除细胞碎片，收集上清10000g10000rcf，4℃，离心30min去除碎屑及杂质，小心收集上清，通过0.22um无菌滤过膜MilliporeExpressPESMembrane0.22um进一步去除大于220nm的颗粒和囊泡，收集滤过液，小心装入超高速离心机专用离心管BeckmanQuick-SealTube,Ultra-Clear344322配平并封口，使用BECKMANCOULTER公司超高速离心机OptimaXPN-100Ultracentrifuge110000g110000rcf，4℃，离心70min，上清取样作为对照，小心去除部分上清，以管底剩余的30ul上清重悬外泌体沉淀作为样本。使用BCA法检测外泌体中蛋白浓度ThermoPierceBCAProteinAssayKit23225按说明书进行操作，使用PerkinElmer公司多功能酶标仪MultimodePlateReader读取570nm波长的吸光度。根据梯度浓度标准品及其吸光度建立函数方程y＝2895.9x-49.087R2＝0.9918，函数方程代表性好。将超高速离心后的上清作为对照，将各外泌体样本及其对照上清吸光度值带入方程计算浓度，外泌体样本浓度减去对照上清浓度为外泌体蛋白浓度。对该实验进行重复并设置副孔，实验结果均一致并有统计学意义，统计结果如图7-3所示。与0ngml,10ngml,20ngml及商业化IL-21蛋白20ngml相比，浓度为40ngml的重组人IL-21蛋白显著抑制PBMCs分泌外泌体，浓度为20ngml的重组人IL-21蛋白有抑制外泌体分泌的趋势但无统计学差异。提示IL-21参与外泌体分泌的调控，并在其中起重要作用，此前从未有文献报道这一作用，是IL-21及外泌体研究的新方向。序列表描述SEQNO.1为本发明重组IL-21基因的上游引物序列；SEQNO.2为本发明重组IL-21基因的下游引物序列；SEQNO.3为本发明重组IL-21基因的下游引物序列的反向互补序列；SEQNO.4为原始IL-21的DNA编码序列；SEQNO.5为原始IL-21的氨基酸序列；SEQNO.6为本发明实施例中重组表达载体的测序验证序列；SEQNO.7在本发明真核重组表达的IL-21氨基酸序列。序列表中南大学湘雅二医院一种重组人IL-21蛋白及其制备和应用7SIPOSequenceListing1.0129DNA未知Unknown1cggatcccctggtccacaaatcaagctcc29233DNA未知Unknown2cctcgaggggaatcttcacttccgtgtgttcta33333DNA未知Unknown3ggagctccccttagaagtgaaggcacacaagat334486DNA智人Homosapiens4atgagatccagtcctggcaacatggagaggattgtcatctgtctgatggtcatcttcttg60gggacactggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgt120caacttatagatattgttgatcagctgaaaaattatgtgaatgacttggtccctgaattt180ctgccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgctttcag240aaggcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaatt300aaaaagctgaagaggaaaccaccttccacaaatgcagggagaagacagaaacacagacta360acatgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattc420aaatcacttctccaaaagatgattcatcagcatctgtcctctagaacacacggaagtgaa480gattcc4865162PRT智人Homosapiens5MetArgSerSerProGlyAsnMetGluArgIleValIleCysLeuMet151015ValIlePheLeuGlyThrLeuValHisLysSerSerSerGlnGlyGln202530AspArgHisMetIleArgMetArgGlnLeuIleAspIleValAspGln354045LeuLysAsnTyrValAsnAspLeuValProGluPheLeuProAlaPro505560GluAspValGluThrAsnCysGluTrpSerAlaPheSerCysPheGln65707580LysAlaGlnLeuLysSerAlaAsnThrGlyAsnAsnGluArgIleIle859095AsnValSerIleLysLysLeuLysArgLysProProSerThrAsnAla100105110GlyArgArgGlnLysHisArgLeuThrCysProSerCysAspSerTyr115120125GluLysLysProProLysGluPheLeuGluArgPheLysSerLeuLeu130135140GlnLysMetIleHisGlnHisLeuSerSerArgThrHisGlySerGlu145150155160AspSer61006DNA未知Unknown6ctgtacatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttcc60actggtgacgcggcccagccggccaggcgcgccgtacgaagcttggtaccgagctcggat120cccctggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgtcaa180cttatagatattgttgatcagctgaaaaattatgtgaatgacttggtccctgaatttctg240ccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgctttcagaag300gcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaattaaa360aagctgaagaggaaaccaccttccacaaatgcagggagaagacagaaacacagactaaca420tgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattcaaa480tcacttctccaaaagatgattcatcagcatctgtcctctagaacacacggaagtgaagat540tcccctcgaggagggcccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtc600gaccatcatcatcatcatcattgagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttct660agttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgcc720actcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgt780cattctattctggggggtgggggtggggcaggacagcaagggggaggaatgggaagacaa840tagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctg900gggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggggggggtggt960ggttacgcgcagcgtgaccgctaccttggcagggcctaagggcggt10067206PRT未知Unknown7MetGluThrAspThrLeuLeuLeuTrpValLeuLeuLeuTrpValPro151015GlySerThrGlyAspAlaAlaGlnProAlaArgArgAlaValArgSer202530LeuValProSerSerAspProLeuValHisLysSerSerSerGlnGly354045GlnAspArgHisMetIleArgMetArgGlnLeuIleAspIleValAsp505560GlnLeuLysAsnTyrValAsnAspLeuValProGluPheLeuProAla65707580ProGluAspValGluThrAsnCysGluTrpSerAlaPheSerCysPhe859095GlnLysAlaGlnLeuLysSerAlaAsnThrGlyAsnAsnGluArgIle100105110IleAsnValSerIleLysLysLeuLysArgLysProProSerThrAsn115120125AlaGlyArgArgGlnLysHisArgLeuThrCysProSerCysAspSer130135140TyrGluLysLysProProLysGluPheLeuGluArgPheLysSerLeu145150155160LeuGlnLysMetIleHisGlnHisLeuSerSerArgThrHisGlySer165170175GluAspSerProArgGlyGlyProGluGlnLysLeuIleSerGluGlu180185190AspLeuAsnSerAlaValAspHisHisHisHisHisHisHis195200205

权利要求：1.一种重组人IL-21蛋白的制备方法，其特征在于，提取Tfh细胞的总mRNA并逆转录为cDNA作为PCR扩增模板，设计引物扩增人IL-21基因，引入酶切位点；对载体质粒及目的片段双酶切，经连接酶构建重组质粒；构建成功的重组质粒转染入HEK293F细胞，之后大批量悬浮培养HEK293F细胞，收集培养基上清内蛋白进行纯化获得重组人IL-21蛋白。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，扩增人IL-21基因的引物序列为：上游引物：5’-CGGATCCCCTGGTCCACAAATCAAGCTCC-3’,下游引物：5’-CCTCGAGGGGAATCTTCACTTCCGTGTGTTCTA-3’。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，分别在上游引物引入BamHI内切酶位点，下游引物引入XhoI内切酶位点。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的载体质粒包括：pSecTag2。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的重组人IL-21蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，收集培养基上清内蛋白用His纯化柱进行初步纯化，再利用分子筛进行再次纯化及脱盐浓缩，得到纯度在90％以上的重组人IL-21蛋白。7.一种权利要求1-6任一项方法制备而成的重组人IL-21蛋白。8.权利要求7所述的重组人IL-21蛋白在抑制外周血单个核细胞分泌外泌体中的研究应用。9.权利要求7所述的重组人IL-21蛋白在制备抑制外周血单个核细胞分泌外泌体制剂中的应用。

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