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【发明公布】一种基于SEC-HPLC测定蒜酶的方法_新疆医科大学_201910020676.X 

申请/专利权人:新疆医科大学

申请日:2019-01-09

公开(公告)日:2019-04-09

公开(公告)号:CN109596750A

主分类号:G01N30/02(20060101)

分类号:G01N30/02(20060101);G01N30/06(20060101)

优先权:

专利状态码:失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态:2022.11.18#发明专利申请公布后的驳回;2019.05.03#实质审查的生效;2019.04.09#公开

摘要:本发明提供了一种基于SEC‑HPLC测定蒜酶的方法,属于酶检测技术领域,包括:将待测样品采用SEC‑HPLC测定蒜酶;所述SEC‑HPLC的色谱条件包括:色谱柱为TSKgelG3000SWXL,检测波长为325nm,流动相为磷酸盐缓冲液,流速为0.1~1mLmin,柱温为20~30℃,进样量为10~20μL。采用SEC‑HPLC法分别测定蒜酶提取物、大蒜冻干粉和鲜蒜中的蒜酶,分别检测到蒜酶和蒜酶亚基,而经过提取纯化后的蒜酶提取物中的蒜酶亚基含量减少,与SDS‑PAGE法相比,不用破坏蒜酶结构,并且分别测到蒜酶和蒜酶亚基的存在。

主权项:1.一种基于SEC-HPLC测定蒜酶的方法,其特征在于,包括:将待测样品采用SEC-HPLC测定蒜酶;所述SEC-HPLC的色谱条件包括:色谱柱为TSKgelG3000SWXL,检测波长为325nm,流动相为磷酸盐缓冲液,流速为0.1~1mLmin,柱温为20~30℃,进样量为10~20μL。

全文数据:一种基于SEC-HPLC测定蒜酶的方法技术领域本发明涉及酶检测技术领域,具体涉及一种基于SEC-HPLC测定蒜酶的方法。背景技术大蒜AlliumsativumL.为百合科葱属植物蒜的鳞茎,是一种具有悠久历史的药食两用植物。蒜氨酸裂解酶Alliinase,EC4.4.1.4简称蒜酶,是用来催化大蒜中活性成分蒜氨酸,使其裂解生成大蒜辣素,大蒜辣素是目前公认的大蒜活性成分,具有多种药理活性作用。蒜氨酸酶相对分子质量为108KDa,大蒜粉末中蒜酶有两个相同的亚基结构分子量为54KDa。现有技术中,常采用还原型SDS-PAGE凝胶电泳法测定蒜酶分子量及蒜酶在总蛋白里的含量,但是由于蒜酶结构为双亚基结构,在电泳测定前加入的载样缓冲液会使得蒜酶中二硫键断裂而最终检测出的蒜酶为蒜酶亚基。发明内容本发明的目的在于提供一种基于SEC-HPLC测定蒜酶的方法,采用本发明提供的方法,不用破坏蒜酶的结构,就能够检测蒜酶,而且还能够分别测定蒜酶和蒜酶亚基。本发明提供了一种基于SEC-HPLC测定蒜酶的方法,包括:将待测样品采用SEC-HPLC测定蒜酶;所述SEC-HPLC的色谱条件包括:色谱柱为TSKgelG3000SWXL,检测波长为325nm,流动相为磷酸盐缓冲液,流速为0.1~1mLmin,柱温为20~30℃,进样量为10~20μL。优选的,所述色谱柱的规格包括:所述色谱柱的内径为7.8mm,所述色谱柱的柱长为300mm,所述色谱柱的填料粒径为7μm。优选的,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05~0.15molL。优选的,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1molL。优选的,所述磷酸盐缓冲液的组分包括磷酸氢二钠和磷酸氢二钾。优选的,所述流速为0.5mLmin。优选的,所述柱温为25℃。优选的,所述进样量为15μL。本发明提供了一种基于SEC-HPLC测定蒜酶的方法,包括:将待测样品采用SEC-HPLC测定蒜酶;所述SEC-HPLC的色谱条件包括:色谱柱为TSKgelG3000SWXL,检测波长为325nm,流动相为磷酸盐缓冲液,流速为0.1~1mLmin,柱温为20~30℃,进样量为10~20μL。实验采用色谱技术应用于高效凝胶渗透色谱的检测方法测定蒜酶,供试品中的蒜酶提取物和大蒜冻干粉中的蒜酶均是含有二聚体结构、亚基结构和凝集素的混合物。所以实验采用凝胶色谱柱的分子筛原理,按照分子量大小对蒜酶供试品中的各个分子蛋白质进行分离检测而不破坏其结构。本发明实施例的结果显示:采用SEC-HPLC法分别测定蒜酶提取物、大蒜冻干粉和鲜蒜中的蒜酶,在大蒜样品中分别检测到蒜酶和蒜酶亚基的存在,而经过提取纯化后的蒜酶提取物中的蒜酶亚基含量减少,与常规还原型SDS-PAGE法测定蒜酶相比,不用破坏蒜酶结构,并且可以分别测到蒜酶和蒜酶亚基的存在,为进一步探索蒜酶催化蒜氨酸产生大蒜辣素的机制奠定研究基础。附图说明图1:图1-A为牛血清蛋白、卵清蛋白液相色谱图;图1-B为大蒜冻干粉中蒜酶HPLC测定液相色谱图;图1-C为HPLC测定蒜酶提取物中蒜酶液相色谱图;图2为大蒜冻干粉和蒜酶提取物不同保留时间峰面积柱状图;图3为不同产地大蒜冻干粉HPLC色谱图;图4为同一鲜蒜灭酶和不灭酶处理液相色谱图;图5为不同产地鲜蒜的蒜酶及蒜酶亚基峰面积柱状图。具体实施方式本发明提供了一种基于SEC-HPLC测定蒜酶的方法,包括:将待测样品采用SEC-HPLC测定蒜酶;所述SEC-HPLC的色谱条件包括:色谱柱为TSKgelG3000SWXL,检测波长为325nm,流动相为磷酸盐缓冲液,流速为0.1~1mLmin,柱温为20~30℃,进样量为10~20μL。本发明对所述待测样品的制备方法没有特殊限定,采用常规方法将样品制备成待测样品即可。在本发明中,所述样品优选为大蒜。本发明对所述大蒜的来源没有特殊限定,采用常规市售产品即可。在本发明中,所述色谱柱为TSKgelG3000SWXL,所述色谱柱的内径优选为7.8mm,所述色谱柱的柱长优选为300mm,所述色谱柱的填料粒径为优选7μm。在本发明中,所述检测波长为325nm,在该检测波长下,所述蒜酶具有色谱峰。在本发明中,所述流动相为磷酸盐缓冲液,所述磷酸盐缓冲液的组分优选包括磷酸氢二钠和磷酸氢二钾。在本发明中,所述磷酸盐缓冲液的浓度优选为005~0.15molL,更优选为0.1molL。在本发明中,所述流速为0.1~1mLmin,优选为0.5mLmin。在本发明中,所述柱温为20~30℃,优选为25℃。在本发明中,所述进样量为10~20μL,优选为15μL。下面结合具体实施例对本发明所述的一种基于SEC-HPLC测定蒜酶的方法做进一步详细的介绍,本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例11仪器与试药1.1仪器LC-20AD-SPD-RID高效液相色谱仪日本岛津、Exceed-E艾柯超纯水机成都唐氏康宁科技发展有限公司、M1-L213B微波炉Midea集团、JYL-C020E匀浆机九阳股份有限公司1.2试剂磷酸氢二钠成都市科龙化工试剂厂,批号2013100801、磷酸二氢钾天津市福晨化学试剂厂,批号20131007、牛血清蛋白上海源叶生物科技有限公司,批号L16M6S2,纯度:≥98%、卵清蛋白美国Sigma-Aldrich公司,批号SLBM7240V,纯度≥98%药材不同产地大蒜冻干粉新疆埃乐欣药业、不同产地鲜蒜新疆埃乐欣药业、蒜酶提取物新疆埃乐欣药业,批号201703013、201702011、201703012、201702013、201702012、2017020242方法与结果2.1溶液制备蒜酶供试品溶液精密称定蒜酶提取物160mg置10mL量瓶中,纯水溶解定容至刻度。大蒜供试品溶液1精密称定大蒜冻干粉约160mg置10mL量瓶中,纯水溶解定容至刻度。大蒜供试品溶液2精密称定大蒜冻干粉约640mg置10mL量瓶中,纯水溶解定容至刻度。鲜蒜供试品溶液取去皮鲜蒜10g,精密称定,加水35mL,匀浆1min,浆液转移至50mL容量瓶中,加水定容至刻度,0.22μm微孔滤膜过滤,即得。灭酶鲜蒜供试品溶液取去皮鲜蒜10g,精密称定,至50mL小烧杯中,加水25mL,微波灭酶1.5min,置于匀浆机中,加水15mL,匀浆1min,浆液转移至50ml量瓶中,加水定容至刻度,0.22μm微孔滤膜过滤,即得。牛血清蛋白溶液称取牛血清蛋白溶液20mg,精密称定,置于10mL量瓶中,纯水溶解定容,0.22μm微孔滤膜过滤,备用。卵清蛋白溶液称取卵清蛋白溶液20mg,精密称定,置于10mL量瓶中,纯水溶解定容,0.22μm微孔滤膜过滤,备用。2.2HPLC测定蒜酶方法的建立精密称定牛血清蛋白、卵清蛋白、大蒜冻干粉供试品溶液2、鲜蒜和蒜酶提取物按2.1项下制备供试品溶液。色谱条件:采用TSKgelG3000SWXL7.8mm×300mm,7μm色谱柱,检测波长325nm,流动相:以0.1molL磷酸盐缓冲液磷酸氢二钠7.098g,磷酸二氢钾6.803g加水至1000mL为流动相,流速0.5mLmin,柱温25℃,进样量15μl。试验采用凝胶色谱柱定性测定蒜酶提取物中蒜酶,根据凝胶色谱柱分子筛原理,大分子量物质先出峰。图1-A结果显示牛血清蛋白和卵清蛋白的保留时间分别是18.850min和20.225min,它们的分子量分别是66.4KDa和44.5KDa。已知蒜酶相对分子量为108KDa,其中单个亚基分子量为54KDa。根据图1-B可以看出大蒜冻干粉在14min和19min处均有色谱峰出现,14min在牛血清蛋白之前出峰,所以可以确定在325nm时,14min处的色谱峰为蒜酶二聚体峰,而19min也在牛血清蛋白和卵清蛋白保留时间之间,所以确定19min处的色谱峰为蒜酶的单个亚基峰。图1-C为蒜酶提取物液相色谱图,在14min处有色谱峰出现,19min有一较小的色谱峰,根据图可知在蒜酶提取纯化过程中,除去了大蒜中存在的部分亚基结构蒜酶。根据图1-A、1-B和1-C可知,在蒜酶提取纯化过程中,除去了大蒜中存在的部分亚基结构蒜酶。实验分别测定大蒜冻干粉和蒜酶提取物中蒜酶二聚体及蒜酶亚基的峰面积,对比它们在大蒜冻干粉和蒜酶提取物中的相对含量。2.3HPLC法测定大蒜冻干粉和蒜酶提取物中蒜酶精密称定不同批次蒜酶提取物和不同产地大蒜冻干粉,6批蒜酶提取物,A1-A6分别是201703013、201702011、201703012、201702013、201702012、201702024,6个不同产地大蒜冻干粉,G1-G6分别是山东大蒜、塔城博孜达克农场大蒜、巴里坤农丰园大蒜、巴里坤板房沟大蒜、巴里坤引种山东种子种植大蒜、花庄子大蒜按照2.1项下制备蒜酶供试品溶液和大蒜供试品溶液1,测定蒜酶提取物和大蒜冻干粉中的蒜酶。根据图2的结果可知,在相同条件下蒜酶提取物中蒜酶含量较高;大蒜冻干粉中蒜酶含量低于蒜酶提取物,且不同产地大蒜冻干粉中均存在亚基蒜酶。2.4HPLC法测定不同产地大蒜冻干粉中的蒜酶精密称定不同产地大蒜冻干粉,按照2.1项下制备大蒜供试品溶液2,采用2.2项下色谱条件测定不同产地大蒜冻干粉。根据图3结果可知,在完整的大蒜中存在蒜酶和亚基蒜酶,其中25个不同产地大蒜冻干粉中蒜酶峰面积之间有较大差异,而蒜酶亚基峰面积之间差异较小。2.5HPLC法测定不同产地鲜蒜和灭酶鲜蒜中蒜酶为进一步确定大蒜中蒜酶成分,试验采用HPLC法测定不同产地鲜蒜,按照2.1项下制备鲜蒜供试品溶液和灭酶鲜蒜供试品溶液,采用2.2项下色谱条件测定不同产地鲜蒜。根据图4可以看出,鲜蒜样品经匀浆处理后,有14min处的蒜酶和19min处蒜酶亚基色谱峰,而同一鲜蒜样品经微波灭酶处理后,样品中蒜酶峰和蒜酶亚基峰均消失,在11min处有一小的色谱峰,但尚不确定其成分。根据试验结果可知采用微波灭酶处理后蒜酶变性后,蛋白质溶解度降低产生沉淀。根据图5可知,不同产地鲜蒜中也都含有蒜酶和亚基蒜酶,且不同产地鲜蒜中蒜酶峰面积有较大差异,蒜酶亚基峰面积差异较小,这一结果与大蒜冻干粉一致。由以上实施例可以得出,试验采用HPLC法分别测定蒜酶提取物、大蒜冻干粉和鲜蒜中蒜酶,在大蒜样品中分别检测到蒜酶和蒜酶亚基存在,而经过提取纯化后的蒜酶提取物中蒜酶亚基含量减少。本试验较常规还原型SDS-PAGE法测定蒜酶,不用破坏蒜酶结构,并且可以分别测到蒜酶和蒜酶亚基的存在,这为进一步探索蒜酶催化蒜氨酸产生大蒜辣素的机制奠定研究基础。以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求:1.一种基于SEC-HPLC测定蒜酶的方法,其特征在于,包括:将待测样品采用SEC-HPLC测定蒜酶;所述SEC-HPLC的色谱条件包括:色谱柱为TSKgelG3000SWXL,检测波长为325nm,流动相为磷酸盐缓冲液,流速为0.1~1mLmin,柱温为20~30℃,进样量为10~20μL。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述色谱柱的规格包括:所述色谱柱的内径为7.8mm,所述色谱柱的柱长为300mm,所述色谱柱的填料粒径为7μm。3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05~0.15molL。4.根据权利要求1或3所述的方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1molL。5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液的组分包括磷酸氢二钠和磷酸氢二钾。6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述流速为0.5mLmin。7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述柱温为25℃。8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述进样量为15μL。

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