申请/专利权人：九芝堂股份有限公司

申请日：2016-12-31

公开（公告）日：2020-05-15

公开（公告）号：CN108267535B

主分类号：G01N30/89(20060101)

分类号：G01N30/89(20060101);G01N30/34(20060101);G01N30/06(20060101);G01N30/14(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.05.15#授权;2018.08.03#实质审查的生效;2018.07.10#公开

摘要：本发明公开了一种青皮药材指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，涉及中药材的指纹图谱技术领域。方法包括：a对照品溶液的制备；b供试品溶液的制备；cHPLC检测条件；d以橙皮苷为参照峰的标准指纹图谱的制定；e指纹图谱的质量控制。该方法对各供试品的前处理方法简单，特征性成分保留完整，重复性、稳定性良好，精密度高，具一定的专属性；所得指纹图谱中各特征峰分离效果较好；可用于鉴别青皮药材的真伪及优劣。

主权项：1.青皮药材的指纹图谱检测方法，包括如下步骤：1对照品溶液的制备：称取橙皮苷对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；2供试品溶液的制备：称取青皮药材粉末过四号筛，置锥形瓶中，加甲醇，称重，超声提取20～45min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得青皮药材供试品溶液；3HPLC检测：色谱条件为：色谱柱为C18反相色谱柱4.6×250mm,5μm；柱温为30～40℃；检测波长为360nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，总流速为0.8～1.2mlmin；分析时间90分钟；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1：表1梯度洗脱程序表 4以橙皮苷为参照峰的标准指纹图谱的制定吸取步骤12所得的橙皮苷对照品溶液20μl、青皮药材供试品溶液10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的13批青皮药材的指纹图谱，制定标准指纹图谱；所述标准指纹图谱具有17个特征峰，其中9号峰为橙皮苷；5指纹图谱的质量控制将青皮药材指纹图谱与步骤4制定的标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别所具有的共同吸收峰的数量，确定相似度。

全文数据：青皮药材指纹图谱检测方法及其指纹图谱技术领域[0001]本发明涉及中药材的指纹图谱技术领域，尤其是青皮药材的指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。背景技术[0002]中药材指纹图谱是指中药材经过适当处理后，采用一定的分析手段和检测仪器得到的，能够标示该中药材特性的图谱，它是现阶段可以较全面地反映中药材内在质量的最有效的手段之一，也得到了国际社会的认可。[0003]青皮为常用中药，主要为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的青色果皮。青皮主要分为四花青皮和个青皮。每年5〜6月收集自落的幼果，晒干，习称“个青皮”；7〜8月采收未成熟的果实，在果皮上纵剖成四瓣至基部，除尽果瓤，晒干，习称“四花青皮”；对切成两半者，称“对开青皮”。青皮味苦、辛，性温，具有疏肝破气、消积化滞、散结的功效，主治胸胁脘腹胀痛、食积不消、疝气、乳痈等。青皮与枳实、枳壳等均来源于芸香科橘属的植物果实或果皮（枳实为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种或甜橙CitrussinensisOsbeck的干燥幼果，枳壳芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实），其不仅在外表体征上容易混淆，主要指标性成分也均为橙皮苷、柚皮苷、辛弗林等成分;但是在中医治疗应用上又有较大区别，不能混用，因此，制定青皮的指纹图谱非常必要。[0004]目前对于青皮的指纹图谱已有的研究中，有以气相色谱对挥发油成分建立指纹图谱，也不乏利用液相技术对其进行质量控制，但是色谱图中共有峰过少，不能建立青皮的特征指纹图谱，易与枳实、枳壳等药材混用。发明内容[0005]本发明所要解决的问题是提供一种青皮药材指纹图谱的检测方法及其指纹图谱，利用该图谱可监控青皮药材的质量及鉴别真伪。[0006]为了解决上述技术问题，本发明技术方案为：[0007]青皮药材指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：[0008]1对照品溶液的制备：[0009]称取橙皮苷对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；[0010]⑵供试品溶液的制备：[0011]称取青皮药材粉末过四号筛），置锥形瓶中，加甲醇，称重，超声提取20〜45min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得青皮药材供试品溶液；[0012]3HPLC检测：[0013]吸取上述步骤2所得供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，记录90min内的指纹图谱。[0014]色谱条件为:色谱柱为C18反相色谱柱4.6X250mm，5μπι;柱温为30〜40°C;检测波长为360nm;流动相A为乙腈，流动相B为0.1〜0.5%磷酸溶液，总流速为0.8〜1.2mlmin;[0015]采用下述梯度洗脱方式洗脱：[0016]表1梯度洗脱程序表[0018]本发明所建立的本青皮药材的指纹图谱，由17个共有指纹峰构成，所述指纹图谱的17个共有指纹峰的相对保留时间范围及相对标准偏差如下见表2[0019]表2指纹图谱17个共有指纹峰的相对保留时间及相对标准偏差[0022]本发明上述方法中所用甲醇均为纯甲醇。[0023]本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：[0024]1本发明青皮药材指纹图谱检测方法对各供试品的前处理方法简单，特征性成分保留完整，且供试品溶液稳定；[0025]2本发明中的高效液相色谱方法精密度较高、重现性良好，具有一定的专属性；[0026]3本发明所建立的标准指纹图谱有17个共有峰，信息量较大，较完整的保留了供试液中的化学成分；[0027]4本发明确立了青皮药材指纹图谱的方法，通过该方法可获得青皮药材的标准指纹图谱，比较指纹图谱中共有峰的有无，能有效地监控青皮药材的质量，完善了青皮药材的质量评价体系，避免与同科属来源的枳实枳壳药材混用，为青皮药材质量的全面、有效控制提供了理论和实践基础。附图说明[0028]图1供试品制备-提取方式1色谱图[0029]图2供试品制备-提取方式2色谱图[0030]图3供试品制备-提取方式3色谱图[0031]图4流动相1色谱图[0032]图5流动相2色谱图[0033]图6对照品色谱图[0034]图7指纹图谱稳定性）[0035]图8指纹图谱精密度）[0036]图9指纹图谱重复性）[0037]图10标准指纹图谱[0038]图1113批青皮药材原始指纹图谱[0039]图121批枳实药材的原始图谱[0040]图131批枳壳药材的原始图谱具体实施方式[0041]下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明的范围。[0042]实施例1青皮药材指纹图谱的建立[0043]1药材的来源[0044]为使药材具有足够的代表性，收集不同产地的药材或不同采收季节的药材作为供试品。见表3。[0045]表3青皮药材来源[0047]2仪器与试药[0048]Waterse2695-2998高效液相色谱仪，Empower色谱工作站;色谱柱:ZORBAXSBCi8柱4.6mmX250mm，5ym，美国安捷伦公司）；KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市仪器有限公司）；Milli-Q纯水系统美国Millipore公司）；AY220电子天平（日本岛津公司）。[0049]3提取方式的选择：[0050]1取青皮样品粉碎过四号筛），精密称取lg，精密加入70%甲醇25ml，称定重量，超声30min，冷却后补重。过0.45μηι滤膜即可，结果见图1。[0051]2取青皮样品粉碎过四号筛），精密称取0.5g，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声45min，冷却后补重。过0.45μηι滤膜即可，结果见图2。[0052]3取青皮样品粉碎过四号筛），精密称取lg，精密加入甲醇30ml，超声60min，定容至50ml容量瓶中。过0.45μπι滤膜即可，结果见图3。[0053]根据上述三种方法给出的色谱图，发现提取方式2中提取的成分最多，且包含主要指标成分橙皮苷，因此选择该法作为供试品制备的最佳条件。[0054]4色谱条件的选择：[0055]1检测波长的选择:根据药典中橙皮苷的检测条件，选择360nm为检测波长；[0056]2流动相的选择：以乙腈-0.1%磷酸为基础溶剂，进行不同梯度的洗脱，其结果见图4、5;最终确定最佳流动相条件，见表4及效果图5:[0057]表4最佳流动相条件[0059]3色谱条件为:色谱柱为C18反相色谱柱4.6X250mm，5μπι;柱温为35°C;流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸溶液，总流速为I.Omlmin;[0060]5对照品溶液的制备:称取橙皮苷对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成每Iml含0.5mg的对照品溶液;见图6;[0061]6供试品溶液的制备:精密称取石柑子药材粉末0.5g置于三角锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，超声处理45min，放冷，用相应甲醇溶液补足损失的重量，摇匀，粗滤，滤液用0.45μπι的微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；[0062]7方法学考察[0063]1稳定性试验[0064]取同一供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别在O、2、4、6、12、24小时进行检测，每次进样1〇μ1，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果见表5,图7〇[0065]表5稳定性相似度[0067]2精密度试验[0068]取同一份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进样6次，每次进样ΙΟμΙ，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果见表6,图8。[0069]表6精密度相似度[0071]3重复性试验[0072]取同一批样品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进样分析，考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果见表7,图9。[0073]表7重复性相似度[0075]8青皮药材标准指纹图谱的制定[0076]精密吸取上述对照品溶液20μ1、供试品溶液10μ1，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的13批青皮药材的指纹图谱，制定标准指纹图谱。见图10，11。[0077]比较青皮药材色谱图，确定17个峰为共有峰，其中9号峰为橙皮苷峰，依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，制定青皮药材的标准指纹图谱。以橙皮苷峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和其相对标准偏差，结果见表2。[0078]9相似度评价[0079]表813批青皮药材HPLC指纹图谱相似度评价结果表[0081]对比例I1批枳实药材原始图谱[0082]1药材的来源[0083]购买自安徽亳州中药材市场，产地江西，批号160301。[0084]2仪器与试药[0085]Waterse2695-2998高效液相色谱仪，Empower色谱工作站;色谱柱:ZORBAXSBCi8柱4·6mmX250mm，5μπι，美国安捷伦公司）；KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市仪器有限公司）；Milli-Q纯水系统美国Millipore公司）；ΑΥ220电子天平（日本岛津公司）。[0086]3色谱条件:色谱柱为C18反相色谱柱4.6X250mm，5μπι;柱温为35°C;梯度洗脱：流动相A为乙腈、流动相B为0.1%磷酸溶液表3;总流速为I.Omlmin;[0087]4供试品溶液的制备:精密称取石柑子药材粉末0.5g置于三角锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，超声处理45min，放冷，用相应甲醇溶液补足损失的重量，摇匀，粗滤，滤液用0.45μπι的微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。（结果见附图12[0088]对比例21批枳壳药材原始图谱[0089]1药材的来源[0090]购买自湖南邵阳中药材市场，产地湖南，批号151120。[0091]2仪器与试药[0092]Waterse2695-2998高效液相色谱仪，Empower色谱工作站;色谱柱:ZORBAXSBCi8柱4·6mmX250mm，5μπι，美国安捷伦公司）；KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市仪器有限公司）；Milli-Q纯水系统美国Millipore公司）；ΑΥ220电子天平（日本岛津公司）。[0093]3色谱条件:色谱柱为C18反相色谱柱4·6X250mm，5μπι;柱温为35°C;梯度洗脱：流动相A为乙腈、流动相B为0.1%磷酸溶液表3;总流速为I.Omlmin;[0094]4供试品溶液的制备:精密称取石柑子药材粉末0.5g置于三角锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，超声处理45min，放冷，用相应甲醇溶液补足损失的重量，摇匀，粗滤，滤液用0.45μπι的微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液结果见附图13。

权利要求：1.青皮药材的指纹图谱检测方法，包括如下步骤：1对照品洛液的制备：称取橙皮苷对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；⑵供试品溶液的制备：称取青皮药材粉末过四号筛），置锥形瓶中，加甲醇，称重，超声提取20〜45min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得青皮药材供试品溶液；⑶HPLC检测：色谱条件为:色谱柱为C18反相色谱柱4.6X250mm，5μπι;柱温为30〜40°C;检测波长为360nm;流动相A为乙腈，流动相B为0.1〜0.5%磷酸溶液，总流速为0.8〜1.2mlmin;分析时间90分钟;采用梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1:表1梯度洗脱程序表⑷以橙皮苷为参照峰的标准指纹图谱的制定吸取步骤（1⑵所得的橙皮苷对照品溶液20μ1、青皮药材供试品溶液10μ1，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；依据所得的13批青皮药材的指纹图谱，制定标准指纹图谱;所述标准指纹图谱具有17个特征峰，其中9号峰为橙皮苷；⑸指纹图谱的质量控制将青皮药材指纹图谱与步骤4制定的标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别所具有的共同吸收峰的数量，确定相似度。2.根据权利要求1所述的青皮药材指纹图谱检测方法，其特征在于:所述步骤2供试品溶液的制备按照下述方法进行：称取青皮药材粉末过四号筛〇.2〜1.5g，置锥形瓶中，精密加甲醇20〜50ml，称重，超声提取20〜45min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得青皮药材供试品溶液。3.根据权利要求1所述的青皮药材指纹图谱检测方法，其特征在于:所述步骤3中流动相B为0.1%磷酸溶液。4.根据权利要求1所述的青皮药材指纹图谱检测方法，其特征在于:所述步骤3中总流速为lmlmin〇5.根据权利要求1所述的青皮药材指纹图谱检测方法，其特征在于所建立的青皮药材指纹图谱由17个共有指纹峰构成，所述指纹图谱的17个共有指纹峰的相对保留时间范围及及相对标准偏差如下表2:表2指纹图谱17个共有指纹峰的相对保留时间及相对标准偏差〇.

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