申请/专利权人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所

申请日：2017-05-04

公开（公告）日：2020-05-19

公开（公告）号：CN107099592B

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12Q1/6844(20180101);C12Q1/04(20060101);C12N15/11(20060101);C12R1/645(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.05.19#授权;2017.09.22#实质审查的生效;2017.08.29#公开

摘要：本发明公开了检测茄匍柄霉菌的成套试剂及应用。本发明公开的检测茄匍柄霉菌的成套试剂由名称为Stem14‑FIP的单链DNA、名称为Stem14‑BIP的单链DNA、名称为Stem14‑F3的单链DNA、名称为Stem14‑B3的单链DNA、名称为Stem14‑LF25的单链DNA和名称为Stem14‑LB25的单链DNA组成，其序列分别为序列表中SEQIDNo.1‑6。本发明的成套试剂可以特异检测茄匍柄霉菌，其检测茄匍柄霉菌的灵敏度可达2.4×100pg基因组DNAμL。

主权项：1.成套试剂，包括名称为Stem14-FIP的单链DNA、名称为Stem14-BIP的单链DNA、名称为Stem14-F3的单链DNA和名称为Stem14-B3的单链DNA；所述Stem14-FIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.1的单链DNA；所述Stem14-BIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.2的单链DNA；所述Stem14-F3为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.3的单链DNA；所述Stem14-B3为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.4的单链DNA。

全文数据：检测茄匍柄霉菌的成套试剂及应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域中，检测茄匍柄霉菌的成套试剂及应用。背景技术[0002]匍柄属真菌Stemphylium能够侵染全球范围内多种作物，可以引起多种蔬菜病害，主要危害蔬菜包括番茄、莴苣、辣椒、甘蓝、菠菜、大蒜，其中尤以危害番茄最为严重。美国、以色列、新西兰等地均报道过由匍柄霉引起的番茄叶斑病，给当地番茄生产造成了巨大的经济损失。近年来，我国东北、华北、华东和华南等地50万亩的番茄灰叶斑病发生尤为严重。其中尤以山东寿光、海南海口、广西田阳发病最为严重，总发病面积超过10万亩，损失超过千万元。[0003]番茄是茄果类蔬菜中非常重要的一种蔬菜，是我国蔬菜种植业中的主要栽培作物之一。目前，中国番茄的种植、加工和出口都处于持续增长态势，经过20多年的发展中国已成为全球最重要的番茄制品生产国和出口国，是继美国、欧盟之后的第三大生产地区和第一大出口国。自2002年以来番茄匍柄霉叶斑病在国内各大番茄主产区陆续发生，渐由次要病害上升为主要病害，对我国番茄产业的发展带来严重的影响。[0004]2002年在山东鱼台县种植的3万个大棚中，病棚率为43%，2003年病棚率为90%，防治不及时，番茄减产20%左右，有的甚至减产80%，同时造成番茄果实质量下降。在贵州高山地区种植的进口番茄品种表现出了对番茄灰叶斑病的高感性，2005年在贵阳市白云区、息烽县、修文县等地大面积暴发，由于番茄灰叶斑病在以往种植的品种上极少发现，农民缺乏防治经验，因而防治不力，给生产带来毁灭性打击。李宝聚等在蔬菜病害调查过程中发现，北京大兴、辽宁海城、河北廊坊、保定以及山东寿光等地都有该病的发生，但当时并未造成产量损失[0005]2009〜2016年的蔬菜病害调查过程中我们发现，番茄匍柄霉叶斑病发生面积逐年扩大，在海南省海口市西秀镇龙头村、灵山镇大昌村，山东寿光洛城镇黄家尧水村，山东寿光田柳镇陈马村、邵家岭村、毛家村、闫家庄子村，广西资源县资源镇同禾村鸭子背屯、广西资源县车田乡黄保村、广西资源县东田苗族乡海棠村等地都发现了番茄匍柄霉叶斑病的严重危害。尤其是在山东寿光田柳镇陈马村，番茄自定植后不久即开始零星发生匍柄霉叶斑病，遇到连阴天湿度大，温度忽高忽低时，病害快速扩展，至第6穗果座果时，棚内发病率达到90%以上，严重影响了番茄的产量，给农民带来了巨大的损失。[0006]经过系统研究发现，前匍柄霉菌（Stemphyliumsolani是国内侵染番前的主要种。植物病原微生物检测通常采用形态学及分子生物学手段，方法各有优劣，多元化的检测手段才能更好的为生产服务。2000年日本荣研化学的Notomi博士在传统PCR技术基础上发明了LAMP技术，具有简便、准确、快速等突出优点。但是目前尚未有很好的检测茄匍柄霉菌Stemphyliumsolani的方法。发明内容[0007]本发明所要解决的技术问题是如何检测检测前匍柄霉菌Stemphyliumsolaniο[0008]为解决上述技术问题，本发明首先提供了可以用于检测或辅助检测茄匍柄霉菌或检测或辅助检测茄匍柄霉菌所致病害的成套试剂，所述成套试剂包括名称为StemH-FIP的单链DNA、名称为StemH-BIP的单链DNA、名称为Steml4-F3的单链DNA和名称为Steml4-B3的单链DNA;[0009]所述StemH-FIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.1的单链DNA;[0010]所述StemH-BIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.2的单链DNA;[0011]所述Steml4-F3为核苷酸序列是序列表中SEQID如.3的单链0嫩；[0012]所述Steml4-B3为核苷酸序列是序列表中SEQID如.4的单链0嫩。[0013]上述成套试剂可由所述StemH-FIP、所述Steml4-BIP、所述Steml4-F3和所述Steml4-B3组成。所述Steml4-FIP、所述Steml4_BIP、所述Steml4-F3和所述Steml4-B3的摩尔比可为8:8:1:1。所述Steml4_FIP、所述Steml4_BIP、所述Steml4_F3和所述Steml4_B3可独立包装，也可包装在一起。[0014]上述成套试剂也可由所述StemH-FIP、所述StemH-BIP、所述Steml4-F3、所述Steml4-B3、名称为Steml4-LF25的单链DNA和名称为Steml4-LB25的单链DNA组成；[0015]所述Steml4-LF25为核苷酸序列是序列表中SEQID如.5的单链0嫩；[0016]所述Steml4-LB25为核苷酸序列是序列表中SEQID如.6的单链0嫩。[0017]所述Steml4_FIP、所述Steml4-BIP、所述Steml4_F3、所述Steml4_B3、所述StemH-LF25和所述Steml4-LB25的摩尔比可为8:8:1:1:4:4〇[0018]所述成套试剂的各单链DNA可独立包装，也可包装在一起。[0019]为解决上述技术问题，本发明还提供了可以用于检测或辅助检测茄匍柄霉菌或检测或辅助检测茄匍柄霉菌所致病害的系统，所述系统含有所述成套试剂和M;所述M为链置换型DNA聚合酶和或进行环介导等温扩增所需要的其他试剂。[0020]所述进行环介导等温扩增所需要的其他试剂可为反应缓冲液和或钙黄绿素。所述反应缓冲液具体可为荣研生物科技（中国）有限公司的2X反应缓冲液RM。所述DNA聚合酶具体可为BstDNA聚合酶。所述BstDNA聚合酶可为荣研生物科技（中国）有限公司产品。[0021]所述系统还可包括进行环介导等温扩增所需要的仪器。所述仪器可为实时浑浊监测仪LA-300。[0022]具体来说，所述系统可由所述成套试剂和所述M组成，也可由所述成套试剂和所述进行环介导等温扩增所需要的仪器组成，还可由所述成套试剂、所述M和所述进行环介导等温扩增所需要的仪器组成。[0023]所述系统可为包括相关试剂的环介导等温扩增试剂或试剂盒。[0024]为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂的制备方法，所述方法包括将所述成套试剂的各单链DNA分别单独包装。[0025]为解决上述技术问题，本发明还提供了所述系统的制备方法，包括将所述成套试剂的各单链DNA和或进行环介导等温扩增所需要的其它试剂分别单独包装。[0026]为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂的下述任一应用：[0027]XI、在制备检测或辅助检测茄匍柄霉菌产品中的应用；[0028]X2、在制备检测或辅助检测茄匍柄霉菌所致病害产品中的应用。[0029]X3、在检测或辅助检测茄匍柄霉菌中的应用；[0030]X4、在检测或辅助检测茄匍柄霉菌所致病害中的应用。[0031]所述产品可为试剂或试剂盒。[0032]为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测茄匍柄霉菌的方法，所述方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，用所述成套试剂进行LAMP，根据LAMP反应体系中物质的变化确定所述待测样品是否含有茄匍柄霉菌或是否为茄匍柄霉菌。[0033]所述LAMP反应体系中物质的变化可通过扩增曲线确定:所述LAMP反应体系的扩增曲线为S型扩增曲线，所述待测样品含有或候选含有茄匍柄霉菌或为或候选为茄匍柄霉菌；所述LAMP反应体系的扩增曲线非S型扩增曲线，所述待测样品不含有或候选不含有茄匍柄霉菌或非或候选非前匍柄霉菌。[0034]所述LAMP反应体系中物质的变化也可通过反应体系颜色的变化确定，该反应体系含有钙黄绿素:在自然光下，所述LAMP反应体系为绿色，所述待测样品含有或候选含有茄匍柄霉菌或为或候选为茄匍柄霉菌;所述LAMP反应体系为橙色，所述待测样品不含有或候选不含有前匍柄霉菌或非或候选非前匍柄霉菌。[0035]为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测茄匍柄霉菌所致病害的方法，所述方法包括：以待测样品的基因组DNA为模板，用所述成套试剂进行LAMP，根据LAMP反应体系中物质的变化确定所述待测样品的病害是否为茄匍柄霉菌所致病害。[0036]所述LAMP反应体系中物质的变化可通过扩增曲线确定:所述LAMP反应体系的扩增曲线为S型扩增曲线，所述待测样品的病害为或候选为茄匍柄霉菌所致病害;所述LAMP反应体系的扩增曲线非S型扩增曲线，所述待测样品的病害不为或候选不为茄匍柄霉菌所致病害。[0037]所述LAMP反应体系中物质的变化也可通过反应体系颜色的变化确定，该反应体系含有钙黄绿素:在自然光下，所述LAMP反应体系为绿色，所述待测样品的病害为或候选为茄匍柄霉菌所致病害;所述LAMP反应体系为橙色，所述待测样品的病害不为或候选不为茄匍柄霉困所致病害。[0038]上文中，所述成套试剂在LAMP的反应体系中的浓度均可为:所述StemH-FIP40μΜ，所述StemH-BIP40μΜ，所述Steml4-F35μΜ，所述Steml4-B35μΜ，所述Steml4-LF2520μΜ，所述Steml4-LB2520μΜ〇[0039]LAMP的反应温度均可为60-67°C，如65°CC3LAMP的反应时间均可为20-60分钟，如27-40分钟。[0040]本发明的成套试剂具有以下特征优点：[0041]1、实用性好:本发明的检测茄匍柄霉菌的成套试剂实用性强，通过恒温水浴锅就可以完成全部反应，而且添加钙黄绿素后可以通过显色反应直观的判断反应结果，省去了凝胶电泳检测的步骤，降低了检测成本，提高了检测的安全性，增加了检测技术的实用性。[0042]2、准确度高:本发明的检测茄匍柄霉菌的成套试剂可以特异检测茄匍柄霉菌，其检测茄匍柄霉菌的灵敏度可达2.4XIOt3Pg基因组DNAyL。[0043]3、检测速度快:普通PCR反应的检测周期需要2小时以上，利用本发明的检测茄匍柄霉菌的成套试剂全程仅需要60分钟左右，检测速度快，明显优于普通PCR检测。附图说明[0044]图1为成套试剂1的特异性检测结果。其中，1-17分别为17株茄匍柄霉菌，18-30分别为1株茄病镰刀菌、1株灰葡萄孢菌、3株茄链格孢菌、2株多主棒孢、4株链格孢菌和1株芸薹链格孢菌以及阴性对照。[0045]图2为成套试剂1与成套试剂2的反应时间的比较。[0046]图3为成套试剂的可视化反应。[0047]图4为成套试剂1的灵敏度检测。[0048]图5为LAMP检测茄匍柄霉菌接种后番茄叶片后动态变化。其中，N为对照，1-7分别为接种后611、1211、2411、4811、7211、9611、10811番茄叶片0嫩。[0049]图6为茄匍柄霉菌接种后番茄叶片后LAMP反应产物的电泳检测结果。其中，N为对照，M为DNA分子量标准，1-7分别为接种后6h、12h、24h、48h、72h、96h、108h番茄叶片DNA。[0050]图7为不同LAMP引物的比较。其中，3表示LAMP引物3,6表示LAMP引物6,14表示实施例1的成套试剂1。具体实施方式[0051]下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。[0052]实施例1、检测茄匍柄霉菌的成套试剂的制备[0053]本发明所提供的检测茄匍柄霉菌的成套试剂为LAMP引物，为成套试剂1和成套试剂2,成套试剂1由名称分别为5七61111441?、5七611114-81?、5七61111443和5七611114-83的单链0嫩组成，成套试剂2由5七611114叶1?、5七611114-81?、5七611114叶3和5七611114-83以及名称分别为Steml4-LF25和Steml4-LB25的单链DNA组成，各单链DNA信息如表1所示。[0054]其中，StemH-FIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.1的单链DNA;[0055]StemH-BIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.2的单链DNA;[0056]Steml4-F3为核苷酸序列是序列表中SEQID如.3的单链0嫩；[0057]Steml4-B3为核苷酸序列是序列表中SEQID如.4的单链0嫩。[0058]Steml4-LF25为核苷酸序列是序列表中SEQID如.5的单链0嫩；[0059]Steml4-LB25为核苷酸序列是序列表中SEQID如.6的单链0嫩。[0060]成套试剂1和成套试剂2中各单链DNA均独立包装。成套试剂1中，Steml4-FIP、Steml4-BIP、Steml4-F3和Steml4-B3的摩尔比为8:8:1:1;成套试剂2中，Steml4-FIP、5七611114-81?、5七611114-卩3、5七611114-83、5七611114-1^25和5七611114-1^25的摩尔比为8:8:1:1:4:4。[0061]表1、检测茄匍柄霉菌的成套试剂[0062][0063]实施例2、检测茄匍柄霉菌的成套试剂的特异性[0064]1、供试菌株[0065]选用供试菌株为：17株茄匍柄霉菌株、1株茄病镰刀菌、1株灰葡萄孢菌、3株茄链格孢菌、2株多主棒孢、4株链格孢菌和1株芸薹链格孢菌表2，供试菌株保存于中国农业科学院蔬菜花卉研究所蔬菜病害综合防治课题组。[0066]表2、供试菌株信息[0067][0068]表2中，编号为YQZ11020901的茄匍柄霉菌（Stemphyliumsolani记载在文献Xieetal.,FirstreportofStemphyliumsolanicausingleafspotonwildeggplantinChina，Can.J.PlantPathol.，2016，V〇1.38，N〇.4,517_521*;[0069]编号为HG09021201的灰霉病菌Botrytiscinerea记载在文献唐明等，啶酰菌胺对黄瓜灰霉病防治效果的综合评价，中国蔬菜，20162:51-55中；[0070]编号为QZ08092301的茄链格孢菌Alternariasolani、编号为HG0903150102的前病镜刀菌Fusariumsolani和编号为SD21的多主棒抱菌Corynesporacassiicola均记载在文献高苇等，黄瓜棒孢叶斑病的Dot-ELISA检测技术研究，植物保护，2013，396:69-73中。[0071]编号为FQ13072821和FQ13080306的茄链格孢菌（Alternariasolani、编号为FQ13080401和FQ13072817的链格孢菌Alternariaalternata记载在文献（柴阿丽等，加工番茄早疫病病原菌鉴定，华北农学报·2015,30增刊）：316-320中。[0072]2、特异性检测[0073]提取各供试菌株的基因组DNA，对于每个菌株的基因组DNA利用LAMP反应体系检测实施例1的成套试剂1的特异性，利用去离子水替换基因组DNA作为阴性对照。LAMP反应体系如下：[0074][0075]其中，2X反应缓冲液RM与BstDNA聚合酶均为荣研生物科技（中国）有限公司产品。[0076]将各LAMP反应体系于实时浑浊监测仪LA-300中65°C反应60min。[0077]结果显示，17株茄匍柄霉菌株的反应体系（图1中1-17中均有阳性扩增，另外的1株茄病镰刀菌、1株灰葡萄孢菌、3株茄链格孢菌、2株多主棒孢、4株链格孢菌和1株芸薹链格孢菌以及阴性对照的反应体系（图1中18-30中均没有扩增，结果表明，实施例1的成套试剂1能够特异检测茄匍柄霉菌。[0078]实施例3、成套试剂2中的Steml4-LF25和Steml4-LB25可以提高LAMP反应效率[0079]选取实施例2的菌株编号为FQ11112407的茄匍柄霉菌的基因组DNA检测实施例1的成套试剂1和成套试剂2的LAMP反应效率。[0080]其中，成套试剂1的LAMP反应体系见实施例2,成套试剂2的反应体系如下：[0081][0082][0083]将各LAMP反应体系于实时浑浊监测仪LA-300中65°C反应60min。[0084]结果显示，成套试剂1的反应体系的反应时间为40min左右；加入环引物StemH-LF25和Steml4-LB25之后，成套试剂2的反应体系中反应时间能够加速至27min左右（如图2，结果表明，加入环引物Steml4-LF25和Steml4-LB25后，能加速反应时间13min左右，说明该环引物能切实有效加速LAMP反应。图2中，1为成套试剂1的反应体系，2为成套试剂2的反应体系。[0085]实施例4、实施例1的成套试剂1的可视化反应[0086]由于LAMP反应后能产产生大量的焦磷酸镁沉淀，焦磷酸镁能和橙色钙黄绿素反应，使反应液变在自然条天下即可识别的绿色。因此向实施例3的成套试剂2的反应体系中添加FD妈黄绿素），可通过反应液颜色的变化确定是否发生LAMP反应。[0087]按照下述反应体系用实施例1的成套试剂2检测多主棒孢菌、链格孢菌、茄病镰刀菌和茄匍柄霉菌，用去离子水替换菌株基因组DNA作为阴性对照，反应条件同实施例3:[0088][0089]结果（图3显示，只有茄匍柄霉菌的反应体系中发生了颜色变化（自然光下反应体系颜色由橙色变为绿色），其他菌株与阴性对照的反应体系均未发生颜色变化（自然光下反应体系保持为橙色）。图3中，N为阴性对照，P为未添加反应体系的空管，1为多主棒孢菌SD21，2为多主棒孢菌（HG15081901，3为链格孢菌（FQ13072817，4为链格孢菌XHL1506102，5为茄病镰刀菌HG0903150102，6为茄匍柄霉菌YQZ11020901。[0090]实施例5、实施例1的成套试剂的灵敏度[0091]选取实施例2的菌株编号为YQZ11020901的茄匍柄霉菌的基因组DNA初始浓度为2.4XIO5PgAxL，进行10倍梯度稀释，检测实施例1的成套试剂1的进行灵敏性检测，所用茄匍柄霉菌的基因组DNA浓度分别为2.4XIO5PgAxL6.26XIO9拷贝AxL、2.4XIO4PgAxL6·26XIO8拷贝yL、2·4XIO3PgAiL6·26XIO7拷贝yL、2·4XIO2PgAxL6·26XIO6拷贝μυ、2.4XIO1PgAiUejexIO5拷贝yL、2.4XIO0PgAiL6.26XIO4拷贝μυ、2·4Χ10—1PgAL6·26XIO3拷贝yL、2·4X10—2pgVL6·26XIO2拷贝yL、2·4X10—3pgVL62·6拷贝AxL和2.4XIT4PgAiL6.26拷贝AiL，以去离子水替换基因组DNA作为阴性对照。反应体系和反应条件见实施例2。[0092]结果如图4所示，图4中，1-10分别为2·4X105pgyL、2·4XIO4PgAxU2·4XIO3PgAL、2·4X102pgAiL、2·4XIO1PgAxU2·4X100pgAiL、2·4X10—1PgAiU2·4X10—2pgVL、2·4X10_3pgyL和2.4XIT4pg此的茄匍柄霉菌的基因组DNA，11为阴性对照。结果显示，前匍柄霉菌的基因组DNA浓度在2.AXlOt3PgAiL及其以上时均可有扩增曲线，在茄匍柄霉菌的基因组DNA浓度低于2.4XIOt3PgAiL时及阴性对照均没有扩增曲线，表明，实施例1的成套试剂1的检测茄匍柄霉菌的灵敏度是2.4XIOt3Pg基因组DNAyL。[0093]实施例6、茄匍柄霉接种后番茄叶片后动态变化[0094]将低温4°C保存菌株编号为YQZ11020901的茄匍柄霉菌菌株采用PDA平板活化，转接至ro液体培养基，28°C培养7d后，用豆浆机打碎菌丝后，用喷菌悬液法接种番茄叶片接种3-4叶期的番茄植株，保温保湿，接种后每隔611、1211、2411、4811、7211、9611、10811观察记录其症状，并分别收集和提取叶片总DNA，利用实施例1的成套试剂1进行qRT-PCR检测，利用未接种茄匍柄霉菌的健康番茄叶片作为对照。利用实施例2的LAMP反应体系和反应条件检测接种后病原菌含量在活体植株体内的动态变化。[0095]结果（图5显示，茄匍柄霉菌菌株接种12h至108h的反应液均变为绿色（图5中2-7，茄匍柄霉菌菌株接种6h的反应液（图5中1以及对照（图5中N的反应液均为橙色，其中接种12h的反应液绿色相对较浅，而后面相对较深。利用2%的琼脂糖凝胶电泳进行反应产物的检测，结果显示茄匍柄霉菌菌株接种6h没有条带，而茄匍柄霉菌菌株接种12h至108h的反应液均为梯形条带，且条带的亮度梯次加深（图6。结果表明，试验条件下，利用实施例1的成套试剂可最快检测前匍柄霉菌侵染12h的番前叶片，且前匍柄霉菌菌量随侵染时间推移，菌量逐渐增多，IOSh时菌量致病番茄叶片达9级，病斑覆盖整个番茄叶片。[0096]对比例1、不同LAMP引物检测茄匍柄霉菌的比较[0097]利用实施例1的成套试剂1以及LAMP引物3与LAMP引物6分别对菌株编号为YQZ11020901的茄匍柄霉菌的基因组DNA进行LAMP反应，反应体系与反应条件均同实施例2。LAMP引物3与LAMP引物6的各引物见表3。[0098]表3、Lamp引物信息表[0099][0100]结果如图7所示，结果显示，实施例1的成套试剂1的反应体系中在40miη左右开始大量扩增，而LAMP引物3在60min左右开始大量扩增，LAMP引物6在90min内均无扩增。结果表明，实施例1的成套试剂1进行LAMP反应检测茄匍柄霉菌的效果最好。

权利要求：1.成套试剂，包括名称为StemH-FIP的单链DNA、名称为StemH-BIP的单链DNA、名称为Steml4-F3的单链DNA和名称为Steml4-B3的单链DNA;所述StemH-FIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.1的单链DNA;所述StemH-BIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.2的单链DNA;所述Steml4-F3为核苷酸序列是序列表中SEQID如.3的单链0~八；所述Steml4-B3为核苷酸序列是序列表中SEQID如.4的单链0~八。2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于:所述成套试剂由所述Steml4-FIP、所述Steml4-BIP、所述Steml4-F3、所述Steml4-B3、名称为Steml4-LF25的单链DNA和名称为Steml4-LB25的单链DNA组成；所述Steml4-LF25为核苷酸序列是序列表中SEQID如.5的单链0~八；所述Steml4-LB25为核苷酸序列是序列表中SEQID如.6的单链0~八。3.用于检测或辅助检测茄匍柄霉菌或检测或辅助检测茄匍柄霉菌所致病害的系统，含有权利要求1或2所述成套试剂和M;所述M为链置换型DNA聚合酶和或进行环介导等温扩增所需要的其它试剂。4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于:所述进行环介导等温扩增所需要的其它试剂为反应缓冲液和或钙黄绿素。5.根据权利要求3或4所述的系统，其特征在于:所述系统为环介导等温扩增试剂或试剂盒。6.权利要求1或2所述成套试剂的制备方法，包括将权利要求1或2中各单链DNA分别单独包装。7.权利要求3或4所述系统的制备方法，包括将权利要求1或2中各单链DNA、链置换型DNA聚合酶和或进行环介导等温扩增所需要的试剂分别单独包装。8.权利要求1或2所述成套试剂的下述任一应用：Xl、在制备检测或辅助检测茄匍柄霉菌产品中的应用；X2、在制备检测或辅助检测茄匍柄霉菌所致病害产品中的应用。X3、在检测或辅助检测茄匍柄霉菌中的应用；X4、在检测或辅助检测茄匍柄霉菌所致病害中的应用。9.检测或辅助检测茄匍柄霉菌的方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，用权利要求1或2所述成套试剂进行LAMP，根据LAMP反应体系中物质的变化确定所述待测样品是否含有前匍柄霉菌或是否为前匍柄霉菌。10.检测或辅助检测茄匍柄霉菌所致病害的方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，用权利要求1或2所述成套试剂进行LAMP，根据LAMP反应体系中物质的变化确定所述待测样品的病害是否为前匍柄霉菌所致病害。

百度查询： 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 检测茄匍柄霉菌的成套试剂及应用

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