【发明公布】一种人类口腔微生物组群结构及组成的研究方法_重庆医科大学附属口腔医院_201911423139.6 

申请/专利权人:重庆医科大学附属口腔医院

申请日:2019-12-31

发明/设计人:舒毅

公开(公告)日:2020-05-22

代理机构:北京艾皮专利代理有限公司

公开(公告)号:CN111187808A

代理人:杨克

主分类号:C12Q1/686(20180101)

地址:400017 重庆市渝北区松石北路426号

分类号:C12Q1/686(20180101);C12Q1/04(20060101)

优先权:["20190808 CN 2019107307634"]

专利状态码:在审-公开

法律状态:2020.05.22#公开

摘要:本发明公开了一种人类口腔微生物组群结构及组成的研究方法,包括以下步骤:步骤1、收集唾液样本;步骤2、唾液细菌集合DNA提取;步骤3、PCR扩增目标基因片段;步骤4、DGGE电泳;步骤5、差异条带回切测序;步骤6、DGGE图谱及数据分析。该方法采用DGGE技术针对样本人群唾液样本进行唾液微生物组群的多样性,了解人群口腔唾液微生物组群结构及组成。本发明得到以下结论:DGGE能够较为全面的反映口腔微生物群落结构,其操作简便,是一项评估口腔建状况、预估口腔疾病发生的经济、准确的技术。

主权项:1.一种人类口腔微生物组群结构及组成的研究方法,其特征在于:包括以下步骤:步骤1、收集唾液样本:收集目标群体刷牙后12小时、餐后饮后2小时非刺激性唾液样本3ml,冷藏运输2小时内送回实验室,于-80℃条件下冷冻保存用以提取集合DNA;步骤2、唾液细菌集合DNA提取:采用MasterPureTMDNAPurificationKit提取唾液细菌基因组DNA;步骤3、PCR扩增目标基因片段:用DreamTaqTMPCRMasterMix试剂盒对从唾液细菌集合DNA的16SrDNAV3区域进行扩增,引物设计为不同种类细菌的通用引物:上游引物5’端特异性加了GC夹的BAC1其核苷酸序列如SEQ:ID:1所示,下游引物BAC2其核苷酸序列如SEQ:ID:2所示,扩增后细菌V3高变区片段大小为340bp;PCR反应体系:DNA模板100ng,上游引物1μl,下游引物1μl,预混PCR反应液25μl,用水将整个反应体系补齐;PCR反应参数如下:第一步:94℃预变性4分钟;第二步:94℃变性1分钟;第三步:56℃退火1分钟;第四步:72℃延伸2分钟;第二步至第四步循环25次;第五步:72℃延伸5分钟;反应完成后,PCR产物使用加有goldview的1%普通琼脂糖凝胶,1×TAE缓冲液,100伏电泳30分钟,凝胶成像系统检测产品及其浓度;采用QIAGENQIAquickPCRPurificationKit对PCR产物进行纯化备用;步骤4、DGGE电泳:点用通过Bio-RadDCode基因突变检测系统进行;60%和40%的DGGE变性溶液各16ml,分别加入10%APS18μl作为诱发剂、TEMED150μl作为催化剂,混匀,固定于胶灌输装置,尽量匀速灌胶,小心插入梳子,让凝胶聚合一个小时;并把电泳控制装置打开,预热电泳缓冲液到58℃;胶彻底凝固后,将PCR产品20μl与2X上样液均匀混合,点入加样孔;恒定电压为60V,温度60℃电泳过夜;16h后,分离玻璃板,将胶置于0.5%μgml的溴化已锭染色液EB中染色10min,1×TAE缓冲液漂洗10min,漂去多余溴化已锭,将胶取出,于胶成像系统中成像;为验证实验的可重复性,每组样品重复跑胶2-3次;步骤5、差异条带回切测序:在紫外灯下将DGGE胶上不同的条带切下,置于无菌EP管中,加入20μl蒸馏水浸泡,捣碎,使条带中DNA充分溶解,于4℃过夜后取5μl浸出液体进行测序PCR反应,体系及反应条件同前:DNA模板100ng,上游引物1μl,下游引物1μl,预混PCR反应液25μl,用水将整个反应体系补齐;PCR反应物采用QIAGENQIAquickPCRPurificationKit纯化后由北京中科希林科技有限公司公司对产物进行测序;测序结果在HumanOralMicrobiomeDatabase数据库的Identify16SrRNABlastSequence进行序列比对分析,找出其最相似的微生物种属;步骤6、DGGE图谱及数据分析:采用QuantityOne1-D分析软件4.6.2对采集的DGGE电泳图像进行分析;实验可重复性评价采用Sorenson’s相似系数、采用样品平均条带数NO.和Shannon指数H’反应样品种群丰富性和均衡性。

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