申请/专利权人：重庆医科大学附属口腔医院

申请日：2019-12-31

公开（公告）日：2020-05-22

公开（公告）号：CN111187808A

主分类号：C12Q1/686(20180101)

分类号：C12Q1/686(20180101);C12Q1/04(20060101)

优先权：["20190808 CN 2019107307634"]

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2023.08.25#发明专利申请公布后的视为撤回;2020.06.16#实质审查的生效;2020.05.22#公开

摘要：本发明公开了一种人类口腔微生物组群结构及组成的研究方法，包括以下步骤：步骤1、收集唾液样本；步骤2、唾液细菌集合DNA提取；步骤3、PCR扩增目标基因片段；步骤4、DGGE电泳；步骤5、差异条带回切测序；步骤6、DGGE图谱及数据分析。该方法采用DGGE技术针对样本人群唾液样本进行唾液微生物组群的多样性，了解人群口腔唾液微生物组群结构及组成。本发明得到以下结论：DGGE能够较为全面的反映口腔微生物群落结构，其操作简便，是一项评估口腔建状况、预估口腔疾病发生的经济、准确的技术。

主权项：1.一种人类口腔微生物组群结构及组成的研究方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1、收集唾液样本：收集目标群体刷牙后12小时、餐后饮后2小时非刺激性唾液样本3ml，冷藏运输2小时内送回实验室，于-80℃条件下冷冻保存用以提取集合DNA；步骤2、唾液细菌集合DNA提取：采用MasterPureTMDNAPurificationKit提取唾液细菌基因组DNA；步骤3、PCR扩增目标基因片段：用DreamTaqTMPCRMasterMix试剂盒对从唾液细菌集合DNA的16SrDNAV3区域进行扩增，引物设计为不同种类细菌的通用引物：上游引物5’端特异性加了GC夹的BAC1其核苷酸序列如SEQ：ID：1所示，下游引物BAC2其核苷酸序列如SEQ：ID：2所示，扩增后细菌V3高变区片段大小为340bp；PCR反应体系：DNA模板100ng，上游引物1μl，下游引物1μl，预混PCR反应液25μl，用水将整个反应体系补齐；PCR反应参数如下：第一步：94℃预变性4分钟；第二步：94℃变性1分钟；第三步：56℃退火1分钟；第四步：72℃延伸2分钟；第二步至第四步循环25次；第五步：72℃延伸5分钟；反应完成后，PCR产物使用加有goldview的1％普通琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，100伏电泳30分钟，凝胶成像系统检测产品及其浓度；采用QIAGENQIAquickPCRPurificationKit对PCR产物进行纯化备用；步骤4、DGGE电泳：点用通过Bio-RadDCode基因突变检测系统进行；60％和40％的DGGE变性溶液各16ml，分别加入10％APS18μl作为诱发剂、TEMED150μl作为催化剂，混匀，固定于胶灌输装置，尽量匀速灌胶，小心插入梳子，让凝胶聚合一个小时；并把电泳控制装置打开，预热电泳缓冲液到58℃；胶彻底凝固后，将PCR产品20μl与2X上样液均匀混合，点入加样孔；恒定电压为60V，温度60℃电泳过夜；16h后，分离玻璃板，将胶置于0.5％μgml的溴化已锭染色液EB中染色10min，1×TAE缓冲液漂洗10min，漂去多余溴化已锭，将胶取出，于胶成像系统中成像；为验证实验的可重复性，每组样品重复跑胶2-3次；步骤5、差异条带回切测序：在紫外灯下将DGGE胶上不同的条带切下，置于无菌EP管中，加入20μl蒸馏水浸泡，捣碎，使条带中DNA充分溶解，于4℃过夜后取5μl浸出液体进行测序PCR反应，体系及反应条件同前：DNA模板100ng，上游引物1μl，下游引物1μl，预混PCR反应液25μl，用水将整个反应体系补齐；PCR反应物采用QIAGENQIAquickPCRPurificationKit纯化后由北京中科希林科技有限公司公司对产物进行测序；测序结果在HumanOralMicrobiomeDatabase数据库的Identify16SrRNABlastSequence进行序列比对分析，找出其最相似的微生物种属；步骤6、DGGE图谱及数据分析：采用QuantityOne1-D分析软件4.6.2对采集的DGGE电泳图像进行分析；实验可重复性评价采用Sorenson’s相似系数、采用样品平均条带数NO.和Shannon指数H’反应样品种群丰富性和均衡性。

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权利要求：

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