申请/专利权人：江南大学

申请日：2017-08-03

公开（公告）日：2020-05-22

公开（公告）号：CN107233626B

主分类号：A61L27/46(20060101)

分类号：A61L27/46(20060101);A61L27/56(20060101);A61L27/52(20060101);A61L27/50(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.05.22#授权;2017.11.03#实质审查的生效;2017.10.10#公开

摘要：本发明提供一种海藻酸‑多巴胺纳米羟基磷灰石复合支架的制备方法。本发明利用3‑氯‑2‑羟丙基三甲基氯化铵CHPTAC对壳聚糖CS进行季铵化改性，制备季铵化壳聚糖QCS；再以QCS为有机质原位合成羟基磷灰石，制备具有优异分散性的季铵化壳聚糖羟基磷灰石QCHA；进而将其与预先制备的多巴胺改性海藻酸Alg‑DA通过静电作用复合，制备海藻酸‑多巴胺纳米羟基磷灰石Alg‑DAQCHA复合支架材料。改变Alg‑DA与QCHA间的配比，调控Alg‑DAQCHA复合支架的结构及性能；进而利用氯化钙对其进行交联，调节支架孔隙率。本发明制备得到的Alg‑DAQCHA复合支架材料具有良好的力学性能、矿化性能，适宜的降解周期，优异的细胞相容性和细胞黏附性，在生物医学工程领域具有广阔的应用前景。

主权项：1.海藻酸-多巴胺纳米羟基磷灰石复合支架的制备方法，其特征在于，1用3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵对壳聚糖进行季铵化改性，制备季铵化壳聚糖；2以季铵化壳聚糖为有机质，原位合成得到季铵化壳聚糖羟基磷灰石；3以具有优异粘附性能和氧化自聚性的多巴胺改性生物大分子海藻酸，制备海藻酸-多巴胺改性大分子；4通过静电相互作用，将海藻酸-多巴胺与季铵化壳聚糖羟基磷灰石复合，再用氯化钙对其进行交联制备得到海藻酸-多巴胺羟基磷灰石复合支架；所述海藻酸-多巴胺与季铵化壳聚糖羟基磷灰石的配比为1:2～2:1。

全文数据：_种海藻酸-多巴胺纳米羟基磷灰石复合支架的制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种海藻酸—多巴胺纳米羟基磷灰石复合支架的制备方法，属于高分子材料和生物材料技术领域。技术背景[0002]年来，随着骨修复材料临床需求的增加，骨修复材料已成为了生物医学领域的研1究热点之一。人体自然骨是由磷灰石和高分子胶原纤维组成的无机—有机复合物，临床医学领±或长期以来广泛使用的金属、陶瓷、高分子等单组分生物医学材料的成分与其不同。作为骨修复支架材料，其人体适应性以及与自然骨之间的相容性不是十分理想。为了克服单组分骨修复支架材料存在的局限性，将金属、陶瓷、高分子等基体材料通过复合或加入其它增强材料制备得到了骨修复复合材料。骨修复复合材料具有可设计性，可根据不同的应用需求调节基体材料与增强材料之间的比例，合成具有优异综合性能的骨修复材料。骨修复复合材料的发展为获得与人体骨组织相近结构、性能的生物医学材料提供了一种新的途径。[0003]羟基磷灰石HA是一种生物活性材料，其与人体之间存在较好的相容性，是公认性能良好的骨修复替代材料。羟基磷灰石植入人体后，对组织无刺激，不会产生免疫排斥作用，具有优异的骨传导性，可以引导骨生长;此外，羟基磷灰石带有多个羟基，具有强极性，能与机体组织形成较强的亲和力，使其与骨组织形成牢固的化学键合，一旦骨细胞在其表面附着、伸展，即可产生骨基质胶原，并进一步矿化形成骨组织。[0004]研宄发现，在贻贝丝足蛋白中存在大量的3,4_二羟基苯丙氨酸DOPAoDOPA中邻苯二酚基团具有很强的配位能力，能与矿物、金属、金属氧化物等材料表面产生双配位基作用力，形成可逆络合物，而且邻苯二酚被氧化成醌后能与多种基团反应形成共价键。其中多巴胺DA是D0PA—种非常重要的衍生物。其具有极强的防水黏附能力，这种不受水或潮湿环境影响的神奇黏合特性是己有人工合成黏合剂所无法媲美的，不仅如此，由于它是天然分泌产物，因此具有较好的细胞相容性、生物可降解性以及无毒性等特性，对人体细胞造成的侵害很小，也不会引发人体免疫反应，使其在生物医学领域具有十分广泛的应用前景。[0005]本专利发明了一种海藻酸-多巴胺纳米羟基磷灰石复合支架的制备方法。本发明利用（3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵CHPTAC对壳聚糖CS进行季铵化改性，制备季铵化壳聚糖QCS;并以其为有机质原位合成具有优异分散性能的季铵化壳聚糖羟基磷灰石QCHA，利用多巴胺DA改性海藻酸Alg制备具有优异粘附性能的海藻酸-多巴胺Alg-DA改性大分子;通过Alg-DA与QCHA之间的静电作用，将Alg-DA与QCHA以不同配比进行复合，并利用氯化钙对其进行交联制备得到Alg-DAQCHA复合支架。该种复合支架材料具有适宜骨细胞生长的孔隙率和良好的力学性能、矿化性能、药物负载性能，适宜的降解周期，优异的细胞相容性和细胞黏附性，在组织工程领域具有广阔的应用前景。发明内容[0006]本发明的目的是提供一种海藻酸-多巴胺纳米羟基磷灰石复合支架的制备方法，得到复合支架具有适宜骨细胞生长的孔隙率和良好的力学性能、矿化性能、药物负载性能，适宜的降解周期，优异的细胞相容性和细胞黏附性。[0007]本发明的设计思路是：利用（3-氯-2-羟丙基）三甲基氯化铵（CHPTAC对壳聚糖CS进行季铵化改性，制备季铵化壳聚糖QCS;并以其为有机质模板原位合成具有良好分散性的季铵化壳聚糖羟基磷灰石（QCHA;利用多巴胺（DA的可反应性，将其与海藻酸Alg发生酰胺化反应得到海藻酸-多巴胺Alg-DA改性生物大分子;再利用Alg-DA与QCHA之间的静电作用制备复合支架;并用氯化钙进一步交联调节支架孔隙率得到Alg-DAQCHA复合支架材料。[0008]本发明的技术方案为：利用（3_氯-2-羟丙基三甲基氯化铵CHPTAC对壳聚糖CS进行季铵化改性制备一系列不同季铵化程度的季铵化壳聚糖QCS，并以队8为有机质模板，通过原位合成法制备具有良好分散性的季铵化壳聚糖羟基磷灰石QCHA;通过酰胺化反应，利用具有化学反应性以及优异黏附性的多巴胺DA改性海藻酸Alg，合成海藻酸-多巴胺Alg-DA改性生物大分子;利用Alg-DA与QCHA之间的静电作用制备复合支架，并利用氯化钙对支架进行交联，进一步调节支架孔隙率，交联后用超纯水洗涤，冷冻干燥48h，Alg-DAQCHA复合支架材料。[0009]其中，其中QCS制备过程中CS与CHPTAC的投料比为1:1〜1:8，QCS的季铵化程度为17•7〜％.;QCHA原位合成过程中QCHA中HA与QCS的理论比值为9:1〜7:3。酰胺化反应中Alg与DA的投料比为2:1〜1:5，DA在Alg-DA中的取代度为18.9〜52.6%;Alg-DA与QCHA复合时，Alg-DA与QCHA的配比为1:2〜2:1Jig-DA在超纯水中的浓度均为3wt%;氯化钙在超纯水中的浓度为5wt%。[0010]本发明的有益效果：用季铵化壳聚糖生物大分子作为有机质模板合成羟基磷灰石，可以模拟自然骨的生物矿化机理，从而控制羟基磷灰石的成核与生长的作用，同时使所得羟基磷灰石在水中具有较好的分散性。季铵化壳聚糖与海藻酸-多巴胺间具有更强的静电相互作用，将其两者复合可得到三维交联结构的复合凝胶，再通过氯化钙交联，使海藻酸分子链间发生交联，从而得到含有两种交联网络结构的支架材料，赋予了该支架具有更适宜的孔隙率和优异的力学性能。多巴胺改性后的材料，利用多巴胺的黏附性，使得支架能够有效黏附细胞，促进支架材料与组织界面快速结合，从而有效促进组织再生，具有修复组织的潜在应用价值。附图说明[0011]图1季铵化壳聚糖的核磁共振谱图[0012]图2季铵化壳聚糖轻基憐灰石的x射线衍射图[0013]图3海藻酸-多巴胺纳米轻基磷灰石复合支架材料形貌图具体实施方式[0014]实施例i、季铵化壳聚糖QCS的合成[0015]4g的壳聚糖CS分散在lOOmL质量比为7:8:8:77的K0H-Li0H.H20-urea-H20混合溶液得到CS分散液，将其置于-20°C冰箱中冷冻过夜，之后在5。：下解冻、搅拌直至得到透明的CS溶液。然后将62•3mL的（3-氯_2_羟丙基三甲基氯化铵溶液CHPTAC逐滴加入到CS溶液中，30°C下搅拌反应24h。反应完成后的溶液用盐酸中和，并在去离子水中透析一周后进行冷冻干燥，得到的白色絮状样品即为季铵化壳聚糖QCS，季铵化程度为96.8%。[0016]需要说明的是，将实施例1中的CHPTAC的加入量改变为7.78、15.6、31.1mL，可以分别得到季铵化程度17.7、23.3、47.2%的季铵化壳聚糖QCS。[0017]实施例2、季铵化壳聚糖轻基磷灰石QCHA的合成[0018]取一定量的QCS溶于0.3MNa2HP〇4溶液中，常温搅拌lh;然后升温至90°C，在机械搅拌的条件下，以CaP为1.67的原子比将一定量的0.5MCaCl2溶液以2mLmin加入到上述QCS溶液中。在此过程中，利用1MNaOH调节反应溶液的pH在10左右。反应2h后离心得到白色沉淀，并用去离子水洗涤沉淀直至其pH值接近中性，冷冻干燥即可得到QCHA。其中季铵化壳聚糖与羟基磷灰石的理论比值分别为3:7，对应得到的QCHA标记为QCHA-30。[0019]需要说明的是，将实施例2中季铵化壳聚糖与羟基磷灰石的理论比值改变为1:9、2:8，可分别得到QCHA-10以及QCHA-20。[0020]实施例3、海藻酸-多巴胺的制备[0021]称取lg海藻酸Alg，装入三口烧瓶中，加入100mLPBS缓冲液50mM，pH=5.5.，常温搅拌溶解，待完全溶解后，依次加入1•94g1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐EDC和2.32gN-羟基丁二酰亚胺NHS，nC00HnEDCnNHS=124,室温活化30min后，加入4•79g盐酸多巴胺DA，反复抽真空、通氮气三次，以排除空气，防止DA氧化，在氮气氛围下室温反应24h，停止反应后在去离子水中透析以除去EDC和NHS及未反应单体，至透析液中无多巴胺紫外吸收峰后，冷冻干燥得到白色棉花状生物改性大分子Alg-DA，DA取代度为52.6%。[0022]需要说明的是，将实施例3中DA的加入量改变为0.479、0.958、2.87§，可分别得到DA取代度为18.9、23.6、31.5%的八18-0八。[0023]实施例4、Alg-DAQCHA复合支架的制备[0024]将0.6gAlg-DA溶于PBS缓冲液pH=6.0配制成浓度为3wt%的Alg-DA溶液，加入1•2g，QCHA-30到以上溶液中，机械搅拌8h后得到Alg-DAQCHA2.o。将其加入到圆柱形模具中冷冻干燥48h后用5wt%的CaCl2溶液进行交联，交联后的样品再次冷冻干燥48h即得到Alg-DAQCHA复合支架。[0025]需要说明的是，将实施例4中QCHA-30的量改变为0•6g、0•3g，得到的复合支架分别表不为A1g-DAQCHAi.〇，A1g-DAQCHA〇.5。

权利要求：1.海藻酸-多巴胺纳米羟基磷灰石复合支架的制备方法，其特征在于，（1用（3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵对壳聚糖在进行季铵化改性，制备季铵化壳聚糖；（2以季铵化壳聚糖我有机质，原位合成得到季铵化壳聚糖羟基磷灰石；（3以具有优异粘附性能和氧化自聚性的多巴胺改性生物大分子海藻酸，制备海藻酸_多巴胺改性大分子；（4通过静电相互作用，将海藻酸-多巴胺于季铵化壳聚糖羟基磷灰石复合，再用氯化钙对其进行交联制备得到海藻酸-多巴胺羟基磷灰石复合支架。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，季铵化壳聚糖制备中，壳聚糖与（3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵的投料比为1:1〜1:8,季铵化程度为17.7〜96.8%。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以季铵化壳聚糖为有机质原位合成羟基磷灰石时，羟基磷灰石与季铵化壳聚糖的理论比值为9:1〜7:3;其中壳聚糖可以起到控制羟基磷灰石的成核与生长的作用，同时使所得羟基磷灰石在水中具有较好的分散性。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，季铵化壳聚糖羟基磷灰石成针状结构，长度在200〜300nm之间。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，海藻酸改性中，海藻酸与多巴胺的投料比为2:1〜1:5,多巴胺在海藻酸中的取代度为18.9〜52.6%。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，海藻酸-多巴胺与季铵化壳聚糖羟基磷灰石的配比为1:2〜2:1。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，海藻酸-多巴胺在超纯水中的浓度为3wt%，氯化钙在超纯水中的浓度为5wt%。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所得复合支架的孔隙率为71〜78%。

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