申请/专利权人：中国石油化工股份有限公司;中国石油化工股份有限公司石油勘探开发研究院

申请日：2016-07-04

公开（公告）日：2020-05-22

公开（公告）号：CN107574122B

主分类号：C12N1/00(20060101)

分类号：C12N1/00(20060101);C12Q1/64(20060101);C12Q1/06(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.05.22#授权;2018.02.06#实质审查的生效;2018.01.12#公开

摘要：本发明涉及一种油气微生物复苏溶液，在所述复苏溶液中，氮元素与磷元素的摩尔比为0.97‑1.63：1，钾元素的摩尔浓度为0.021‑0.033molL，硫元素的摩尔浓度为0.0008‑0.012molL，钠元素的摩尔浓度为0.017‑0.048molL。本发明还涉及一种油气微生物样品复苏方法，通过对油气微生物样品进行预处理和复苏处理，得到用于培养检测的油气微生物。本发明提供的复苏溶液配比简单，可最大程度上还原野外原位的菌群数量和结构；油气微生物的复苏方法得到的油气微生物存活率高，且对典型的油气微生物均有良好的复苏效果。本发明提供的油气微生物复苏溶液及样品复苏方法在油气微生物勘探中具有重要意义。

主权项：1.一种油气微生物复苏溶液，所述复苏溶液的组分为：KNO31.2gLMgSO4•7H2O3.0gLKH2PO40.5gLK2HPO41.5gLNaCl2.8gL；其中，所述油气微生物包括甲烷氧化菌、乙烷氧化菌、丙烷氧化菌、丁烷氧化菌和戊烷氧化菌中的一种或多种。

全文数据：油气微生物复苏溶液、油气微生物样品复苏方法及应用技术领域[0001]本发明属于油气微生物复苏技术领域，具体涉及油气微生物复苏溶液、油气微生物样品复苏方法及应用。背景技术[0002]微生物勘探是目前油气资源开发的热点。其技术体系是基于地下油气藏的挥发性或半挥发性烃的垂直迀移理论逐步建立起来的。伴随着表层土壤中一定浓度的烃持续供给，氧化层中的以烃作为唯一碳源的微生物得以快速生长和繁殖，通过测定这些油气指示微生物的丰度差异就可以用来间接表征土壤中轻烃浓度的高低，从而预测地下构造的含油气性。由此可见，土壤或沉积物中油气指示微生物数量准确测定对于油气勘探工程具有十分重要的现实意义。其中微生物勘探样品在野外的保藏是一项非常关键的技术。[0003]目前主流的方式是不经任何预处理，加快野外采样进度，集中运输样品至实验室集中进行分析测试。这种方式遇到工期较长，样品较多的工况时，早期采集的样品很容易发生微生物群落变化，不同批次样品很难进行比较分析。[0004]另一种方法是在野外对样品进行快速冷冻。其原理是使样品中的微生物生理活性降到最低，保证最初采样时的微生物群落结构。但缺点在于快速冷冻会使部分细菌细胞内的细胞液冻结，从而杀死部分微生物。[0005]除此之外，也有研究者采用快速风干法。即在野外采用烘箱去除样品中大部分的水分，使得其中的微生物处于休眠状态，这种方法也会造成一部分对水分敏感的微生物死亡，从而影响微生物勘探的准确性。[0006]综上所述，目前对于油气微生物勘探样品处理方法存在的问题和缺点在于:无论采用快速冷冻法还是快速风干法，均会造成很大一部分敏感的微生物死亡，同时在进行微生物培养计数前也没有配套的复苏方法，最终不可避免地会影响微生物勘探的准确性和稳定性。可见，现有的样品预处理技术还不能满足实际生产的要求。因此，目前存在的问题是急需研究开发一种高效实用的油气微生物复苏溶液、油气微生物样品复苏方法及应用。发明内容[0007]本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种油气微生物复苏溶液、油气微生物样品复苏方法及应用。本发明通过对油气微生物样品进行预处理和复苏处理，得到的油气微生物存活率高，且对典型的油气微生物均有良好的复苏效果。本发明提供的油气微生物复苏溶液及其样品复苏方法在油气微生物勘探中具有重要意义。[0008]为此，本发明第一方面提供了一种油气微生物复苏溶液，在所述复苏溶液中，氮元素与磷元素的摩尔比为0.97-1.63:1，钾元素的摩尔浓度为0.021-0.033molL，硫元素的摩尔浓度为〇.0008-0.012molL，钠元素的摩尔浓度为0.017-0.048molL。[0009]根据本发明，所述油气微生物是指能够通过微生物的丰度差异来预测地下构造的含油气性的微生物。具体来说，所述油气微生物为以烃为唯一碳源的微生物，所述烃包括甲烧、乙烧、丙烧、丁烧和戊烧中的一种或多种。优选所述油气微生物包括甲烧氧化菌、乙烧氧化菌、丙烷氧化菌、丁烷氧化菌和戊烷氧化菌中的一种或多种。[0010]根据本发明，氮元素与磷元素的摩尔比有利于使得油气微生物样品中的油气微生物域称为“油气指示微生物”）的生理生化特性恢复到原位状态。[0011]根据本发明，控制钾元素、硫元素与钠元素的摩尔浓度的目的是确保微生物的生长不受以上几种元素的限制。[0012]根据本发明，提供钾元素、硫元素与钠元素的化合物可以使用本领域常用的化合物，例如硝酸钾、硫酸镁、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾及氯化钠。[0013]根据本发明，所述复苏溶液中的溶剂采用可以使得钾元素、硫元素与钠元素以离子状态存在于溶液中的溶剂，例如去离子水。[0014]根据本发明，在不影响所述钾元素、硫元素与钠元素配比的情况下，在所述油气微生物复苏溶液中还可以添加有助于微生物复苏的助剂，例如蛋白胨或黄原胶。[0015]本发明第二方面提供了一种油气微生物样品复苏方法，其包括：[0016]步骤A，对油气微生物样品进行预处理，得到经预处理的油气微生物样品，所述油气微生物样品为含有本发明第一方面中所述油气微生物的土壤和或沉积物；[0017]步骤B，采用如本发明第一方面所述的复苏溶液对经预处理的油气微生物样品进行复苏处理，后经振荡处理，得到含有复苏的油气微生物的样品。[0018]根据本发明方法，所述预处理包括逐步降温、冷冻真空干燥以及任选的保藏处理。[0019]根据本发明方法，所述逐步降温是指使含有本发明第一方面中所述的油气微生物的样品的温度以一定下降速率下降到指定温度，并在指定温度下保持一段时间，或在比指定温度高的某一个或多个温度下各保持一段时间，之后立刻在指定温度下保持一段时间。优选以一定下降速率下降到指定温度，并在指定温度下保持一段时间。另外，在指定温度下保持一段时间后，还包括再在超低温（比指定温度更低的温度下保持一段时间，优选包括再在超低温下保持一段时间。[0020]在本发明的一些实施例中，所述逐步降温处理包括以下具体步骤：[0021]步骤M，将所述油气微生物样品的温度以I-3°Cmin的速率下降到-20°C至-35°C后，在-20°C至-35°C下保持一定时间，所述步骤M的总时间为2h以上，优选为2-4h;[0022]步骤N，将经过步骤M处理得到的油气微生物样品保持在_70°C至-80°C的温度下，保持时间为2_3h。[0023]根据本发明方法，在不具备控温条件的情况下，所述逐步降温处理也可以采用以下步骤:将所述油气微生物样品在4°C下保持0.5-lh，之后在-12°C下保持1-1.5h，然后在-30°C下保持1.5-2h，最后在-70°C保持2-2.5h。[0024]根据本发明方法，所述冷冻真空干燥处理可使用本领域技术人员公知的仪器，例如冷冻干燥机和真空栗。在本发明的一些实施例中，所述冷冻真空干燥处理的温度为_50°C以下；所述冷冻真空干燥处理的真空度为0.1-0.2MPa。经冷冻真空干燥处理后所得油气微生物样品的含水量小于3wt%。[0025]根据本发明方法，所述保藏处理是指通过本领域技术人员公知的手段使得样品中的微生物降低或停止微生物的代谢活动，减慢或停止生长繁殖，并使其不被杂菌或其他物质污染，在较长时期内保持生活能力，具体可列举使用真空干燥法、冷冻真空干燥法及超低温冻结法。所述保藏处理可使用本领域技术人员公知的方法和仪器，例如在实验室低温保存箱下避光保藏，所述保藏处理温度为-4°C至-HTC。[0026]根据本发明方法，为了加快复苏速度，可以在将经预处理的油气微生物样品进行复苏处理后，对所得溶液进行振荡处理。所述振荡处理可采用本领域常规方法。在本发明的一些实施例中，所述复苏处理即将经预处理的油气微生物样品溶解在本发明第一方面所述的复苏溶液中。在本发明的另一些实施例中，所述振荡处理的时间为8-12h;所述振荡处理的频率为60_80rpm。[0027]根据本发明方法，在将经预处理的油气微生物样品溶解在所述复苏溶液之前，可以在不损害样品中的微生物的代谢、生活能力，不污染样品中的微生物的前提下进行本领域人员公知的前处理，具体可列举水浴解冻，例如将包装样品的密封袋放入38±2°C的水浴中进行急剧解冻，解冻时间为I-2h。[0028]根据本发明方法，在对油气微生物样品进行预处理之前，还包括对所述油气微生物样品进行研磨过筛处理。研磨过筛处理可以使在样品表面附着的微生物，例如在土壤或沉积物表面附着的微生物，深入到土壤或沉积物的内部，分散土壤颗粒，使得与土壤颗粒吸附紧密的微生物分散开，有利于后期培养或者土壤微生物DNA提取实验。[0029]根据本发明方法，所述过筛处理可采用本领域技术人员公知的方法，例如利用研磨棒搅拌，再利用20目筛网过筛。[0030]本发明所述用语“任选的”是指包括或不包括。[0031]本发明第三方面提供了一种如本发明第一方面所述的复苏溶液或如本发明第二方面所述的复苏方法在油气微生物勘探中的应用。[0032]根据本发明应用，所述油气微生物勘探是指本领域技术人员利用公知的方法或仪器根据得到油气微生物样品中的微生物的数量和分布，预测地下构造的含油气性以及油气藏的分布位置。[0033]本发明提供的油气微生物复苏溶液、油气微生物样品复苏方法具有如下优点：[0034]1本发明提供的油气微生物复苏溶液的配方简单，经复苏后的油气微生物存活率高，数量大，并且对典型的油气微生物均有良好的复苏效果，例如以烃为唯一碳源的微生物；[0035]2本发明提供的油气微生物样品复苏方法步骤简单，经济实用，可在野外驻地进行；[0036]3本发明提供的油气微生物样品复苏方法可最大程度还原野外原位的菌群数量和结构，并且可以长时间地保藏油气微生物样品，保藏时间可达5-10年，大幅提高在工期较长的项目中利用油气微生物进行勘探的准确性和可靠性。附图说明[0037]图1是本发明实施例1的油气微生物样品经过所述过筛、逐步降温、冷冻真空干燥处理前后的扫描电镜照片，左侧为经过过筛、逐步降温及冷冻真空干燥处理前的样品照片，右侧为经过所述过筛、逐步降温及冷冻真空干燥处理后的样品照片。[0038]图2是利用本发明所述油气微生物的勘探方法在油气藏剖面上的指示效果图；纵轴上甲烷氧化菌数量和丁烷氧化菌数量的单位均为IO5个克干土，浅灰色区块是指在此区域预测有油气田，深灰色区块是指在此区域相比浅灰色区域有更大概率为油气田，虚线是指微生物在虚线对应的数量以上才有指示作用。具体实施方式[0039]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但并不构成对本发明的任何限制。[0040]本发明使用平板计数法测定各种微生物的数量。[0041]本发明的扫描电镜为本领域常规仪器。[0042]本发明中含有油气微生物的粘土样品取自江苏油田海安凹陷油气区，采样间距为200-300m，采样深度为40-60cm。[0043]本发明中含有油气微生物的沙土样品取自胜利油田东营凹陷油气区，采样间距为200-300m，采样深度为40-60cm。[0044]实施例[0045]实施例1[0046]将含有油气微生物的样品（沙土样品或粘土样品）搅拌过筛，筛网为20目，称取样品15g。然后对含有油气微生物的样品进行逐步降温，控制降温速率为rCmin，降温到-35°C，保持一段时间，使得从开始降温加上保持时间的总时间为2h，之后将样品放入-70°C下保持2h。再将上述样品在-50°C，真空度为0.15MPa下进行冷冻真空干燥，使得样品的含水量为lwt%。然后将样品在4°C下避光保藏3个月。将保藏后的样品溶解在复苏溶液1见表1中，在室温下在70rpm的摇床振荡IOh，得到含有复苏的油气微生物的样品，对其中的油气微生物进行培养检测，其结果示于表2。[0047]实施例2[0048]与实施例1相同，不同之处在于，复苏溶液为复苏溶液2见表1，且不经过保藏处理。在将经预处理的油气微生物样品溶解在复苏溶液2中之前，将其放入38±2°C的水浴中进行急剧解冻，解冻时间为l_2h。经复苏处理以及振荡处理后得到含有复苏的油气微生物的样品，对其中的油气微生物进行培养检测，其结果示于表2。[0049]对比例1[0050]与实施例1相同，不同之处在于，对经保藏处理后的样品不进行复苏处理，直接进行油气微生物的培养检测，其结果示于表2。[0051]对比例2[0052]与实施例1相同，不同之处在于，复苏溶液为复苏溶液3见表1，其结果示于表2。[0053]对比例3[0054]将含有油气微生物的样品（沙土样品或粘土样品）直接在-30Γ下冷冻保藏，冷冻保藏时间为7天，之后将保藏后的样品不经复苏处理，直接进行油气微生物的培养检测，其结果示于表2。[0055]对比例4[0056]将含有油气微生物的样品（沙土样品或粘土样品通过风干，使得样品的含水量为2wt%，之后将样品在-4°C下避光保藏7天，然后将保藏后的样品溶解在蒸馏水中，在室温下在70rpm的摇床振荡10h，将所得样品进行油气微生物的培养检测，其结果示于表2。[0057]对比例5[0058]对油气微生物的新鲜样品沙土样品或粘土样品进行培养检测，其结果示于表2。[0059]表1[0063]从表2可以看出，相比对比例3冷冻法和对比例4快速风干法），使用本发明的复苏溶液及样品复苏方法可最大程度还原野外原位的菌群数量和结构，即使在保藏时间较长的情况下仍然具有很好的复苏效果。[0064]应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

权利要求：1.一种油气微生物复苏溶液，在所述复苏溶液中，氮元素与磷元素的摩尔比为〇.97_1·63:1，钾元素的摩尔浓度为O·021-0·033molL，硫元素的摩尔浓度为O·0008-0·012molL，钠元素的摩尔浓度为0.017-0.048molL。2.根据权利要求1所述的复苏溶液，其特征在于，所述油气微生物为以烃为唯一碳源的微生物，所述烃包括甲烷、乙烷、丙烷、丁烷和戊烷中的一种或多种;优选所述油气微生物包括甲烷氧化菌、乙烷氧化菌、丙烷氧化菌、丁烷氧化菌和戊烷氧化菌中的一种或多种。3.—种油气微生物样品复苏方法，其包括：步骤A，对油气微生物样品进行预处理，得到经预处理的油气微生物样品，所述油气微生物样品为含有如权利要求2中所述油气微生物的土壤和或沉积物；步骤B，采用如权利要求1或2所述的复苏溶液对经预处理的油气微生物样品进行复苏处理，后经振荡处理，得到含有复苏的油气微生物的样品；其中，所述预处理包括逐步降温、冷冻真空干燥以及任选的保藏处理。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述逐步降温处理包括：步骤M，将所述油气微生物样品的温度以l-3°Cmin的速率下降到-20°C至_35°C后，在_20°C至-35°C下保持一定时间，所述步骤M的总时间为2h以上，优选为2-4h;步骤N，将经步骤M处理得到的油气微生物样品保持在-70°C至_80°C的温度下，保持时间为2_3h。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述冷冻真空干燥处理的温度为-50°C以下;所述冷冻真空干燥处理的真空度为〇.1-0.2MPa。6.根据权利要求3-5中任意一项所述的方法，其特征在于，经冷冻真空干燥处理后所得油气微生物样品的含水量小于3wt%。7.根据权利要求3-6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述保藏处理的温度为-4°C至-10cC〇8.根据权利要求3-7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述振荡处理的时间为8-12h;所述振荡处理的频率为60-80rpm。9.根据权利要求3-8中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤A中，在对油气微生物样品进行预处理之前，还包括对所述油气微生物样品进行研磨过筛处理。10.—种如权利要求1或2所述的复苏溶液或如权利要求3-9中任意一项所述的复苏方法在油气微生物勘探中的应用。

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