申请/专利权人：中国农业大学

申请日：2018-06-20

公开（公告）日：2020-05-22

公开（公告）号：CN108929900B

主分类号：C12Q1/686(20180101)

分类号：C12Q1/686(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.05.22#授权;2018.12.28#实质审查的生效;2018.12.04#公开

摘要：本发明提供一种镉离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器，包括：1切割体系，2sPCR扩增体系，3包含ABTS显色液的检测体系。本发明通过巧妙地设计引物、模板及探针，使得在镉离子存在下可对模板进行超快扩增，并使扩增产物在适宜环境中形成G四链体。进一步利用G四链体的类过氧化物酶活性进行显色，解决了传统PCR产物难于可视化检测的难题，实现了对镉离子的快速、可视化检测。不仅如此，本发明提供的传感器对镉离子具有高特异、高灵敏的特点，检测结果更加客观、准确。

主权项：1.一种镉离子切割型通用隔断扩增可视化传感器，其特征在于，包括：1切割体系，2sPCR扩增体系，3包含ABTS显色液的检测体系；所述检测体系用于对待测样品依次经由所述切割体系、sPCR扩增体系进行反应后所得产物进行显色检测；所述检测体系包括：酶活缓冲液和氯高铁血红素溶液，其中酶活缓冲液中含有K+；其中，所述切割体系包括底物链和酶链：底物链：5′-CTCACTATArG—GAAGAGATG-3′酶链：5′-CATCTCATCTAACAGCGTTCCGAAATAGC-3′其中，rG表示核糖核酸；-表示镉离子切割位点；所述sPCR扩增体系包括：正向隔断引物、反向引物、模板：正向隔断引物：5′-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-隔断物-CCAACCCGCCCTACCCACTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′反向引物：5′-GAAGAGATG-3′模板：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTACCCCAATTTCGCCATCTTCCCCCACGCACACATCTCTTC-3′。

全文数据：一种镉离子切割型通用隔断超快扩増可视化传感器技术领域[0001]本发明涉及生物传感器技术领域，具体地说，涉及一种镉离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器。背景技术[0002]镉元素符号Cd，蓝白色金属，在元素周期表中属IIB族，镉的原子序数48，原子量112.41，氧化态为+1、+2,有毒性，但由于其良好的柔韧性和抗氧化性，被广泛应用于工业生产中。镉可以通过呼吸道与消化道进入生物体，进入机体的镉可以对肝、肾、骨骼、脑和肺等一系列重要器官造成损害，也会引起神经、生殖、免疫等系统的损伤。中国是世界上第一大镉储量和开发国，同时也是第一大镉消费国。近年来，伴随着人们对镉的进一步开发利用，环境镉污染越来越严重，关于人和动物镉中毒的报道也不断出现。镉中毒已经变为严重威胁人类健康的又一大隐患，因此，对于镉的检测与鉴定工作十分重要。[0003]目前，重金属镉的检测方法主要有火焰原子吸收法、石墨炉原子吸收法、电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体质谱法以及阳极溶出伏安法等。具体来看，火焰原子吸收法操作简单、分析速度快、测定高浓度元素时干扰小、信号稳定。石墨炉原子吸收法灵敏、准确、选择性好，但在线检测方法基体干扰严重，不适合多种元素分析。电感耦合等离子体质谱法灵敏度高，选择性好，能同时分析多种元素，但价格昂贵度，易受污染。电感耦合等离子体质谱法简便、快速、灵敏仪器简单、价格低廉，容易普及，但干扰因素选择性较差。阳极溶出伏安法灵敏度高、分辨仪器价格低廉，可同时测定几种元素。但这些方法依赖于大型仪器和专人操作，在现场和野外检测中受到限制。以醚类、多胺类、环芳烃类等有机小分子为代表的化学传感方法也有一定的发展，但目前存在灵敏度低、可重复性差、检测需在有机溶剂中进行等不足之处，检测的可靠性和实用性不高。因此迫切需要发展无污染的、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法来满足微量金属检测的需要。发明内容[0004]本发明的目的是提供一种镉离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器。[0005]本发明的另一目的是提供基于生物传感器技术检测镉离子的方法。[0006]为了实现本发明目的，发明人根据镉离子的特异性核酶，设计通用隔断引物对其进行超快聚合酶链式反应（superPolymeraseChainReaction，sPCR，结合富G序列在K+存在条件下形成具有类过氧化物酶活性的G四链体，构建了一种新型的基于隔断引物的镉离子切割型功能核酸比色传感器。[0007]第一方面，本发明提供一种镉离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器，包括：⑴切割体系，⑵sPCR扩增体系，（3包含ABTS显色液的检测体系。[0008]所述检测体系用于对待测样品依次经由所述切割体系、sPCR扩增体系进行反应后所得产物进行显色检测；[0009]其中，所述切割体系包括底物链和酶链：[0010]底物链j'-CTCACTATArG—GAAGAGATG-3'[0011]酶链：5'-CATCTCATCTAACAGCGTTCCGAAATAGC-3'[0012]其中，rA表示核糖核酸;-表示镉离子切割位点；[0013]所述sPCR扩增体系包括:正向隔断引物、反向引物、模板：[0014]正向隔断引物iS'-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-隔断物-CCAACCCGCCCTACCCACTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-37[0015]反向引物：5'-GAAGAGATGTGTGCGTGGG-3'[0016]模板：5'-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTACCCCAATTTCGCCATCTTCCCCCACGCACACATCTCTTC-3'。[0017]其中，所述正向隔断引物中的隔断物为聚六乙二醇。其它能够阻止PCR延伸的隔断结构也可用于本发明。[0018]所述DNA聚合酶为ExTaqDNA聚合酶，所述缓冲液为10XExTaqBuffer，二者与所述dNTP均购自赛默飞科技ThermoScientificLifeTechnologies。[0019]本发明所述的检测体系包括:酶活缓冲液，氯高铁血红素溶液。[0020]其中，所述酶活缓冲液为：IOOmMTris、120mMNaCKlOmMMgCl2、100mMKC1，ρΗ8·4〇[0021]所述氯高铁血红素溶液为20mM的氯高铁血红素原液与上述酶活缓冲液按照2yL:ImL的比例混合后的氯高铁血红素稀释溶液。[0022]本发明还提供前述系统在检测镉离子方面中的应用，所述检测可表现为定性检测或定量检测。[0023]第二方面，本发明提供了一种利用前述传感器对镉离子进行定性检测的方法，包括如下步骤：[0024]S1、向所述切割体系中加入待测样品，进行切割反应；[0025]S2、将Sl所得切割产物加入所述sPCR扩增体系中进行超快聚合酶链式反应，得sPCR产物；[0026]S3、利用所述检测体系对所述sPCR产物进行检测。[0027]Sl具体如下:将底物链与酶链按等摩尔比例混合，用缓冲液稀释至浓度1μΜ_2μΜ，85°C-95°C加热15min，然后降温至25-37°C，得到核酶液；向35yL所述核酶液中加入待测样品溶液，形成40yL体系，于36-38°C孵育4-6min，然后加入4-6yL终止液，得到切割产物。[0028]进一步地，所述检测体系包括酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液，将酶活缓冲液、氯高铁血红素稀释溶液和sPCR产物按体积比为8:1:1混匀（总体积为IOOyL，在35-38°C条件下反应20-40min，加入与前述混合物等体积的ABTS显色液，混匀，35-38°C避光孵育，肉眼进行监测。[0029]第三方面，本发明提供了一种利用前述传感器对镉离子进行定量检测的方法，包括如下步骤：[0030]SI、制作标准曲线：[0031]利用已知浓度的镉离子溶液，构建具有不同镉离子浓度的切割体系，sPCR扩增与检测步骤与前述定性检测的步骤相同；[0032]以镉离子浓度为横坐标，以OD415值为纵坐标，绘制标准曲线；[0033]SII、按照前述定性检测方法对待测样品进行检测，将测得的OD415值代入标准曲线，计算得到待测样品中镉离子的含量，实现对镉离子的定量检测。[0034]本发明提供一种基于生物传感器技术检测镉离子的方法，首先设计镉离子特异性核酶，包括底物链和酶链，将底物链与酶链进行杂交形成具有特异性镉离子切割活性的核酶，当镉离子存在的条件下发生切割反应，切割下来的核酸片段作为反向引物（即目标引发分子），与正向隔断引物一起对模板进行PCR扩增反应，所得PCR产物的一端带有一段单链核酸序列;所述PCR产物在K+存在条件下，形成G四链体，催化H2O2和ABTS显色，进而完成对镉离子的快速可视化检测。[0035]本发明中，显色液可用TMB替代。[0036]所述底物链和酶链的碱基序列如下：[0037]底物链j'-CTCACTATArG—GAAGAGATG-3'[0038]酶链：5'-CATCTCATCTAACAGCGTTCCGAAATAGC-3'[0039]其中，rA表示核糖核酸;-表示镉离子切割位点；[0040]所述正向隔断引物的5'端具有富G碱基序列，3'端含有可与模板结合的碱基序列，所述富G碱基序列和可与模板结合的碱基序列之间至少设有一阻断物，所述阻断物可阻断PCR延伸。[0041]优选地，所述阻断物为聚六乙二醇。[0042]优选地，所述底物链的3'端添加有一段可增加所述反向引物与模板结合Tm值的碱基序列，使得PCR退火温度控制在50-60°C。[0043]前述的方法，镉离子检测中所用的底物链、酶链、正向隔断引物、反向引物和模板的碱基序列如下（SEQIDNO:1-5:[0044]底物链：5'-CTCACTATArG—GAAGAGATGTGTGCGTGGG-3'[0045]酶链：5'-CATCTCATCTAACAGCGTTCCGAAATAGC-3'[0046]正向隔断弓I物iS'-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-聚六乙二醇-CCAACCCGCCCTACCCACTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-37[0047]反向引物：5'-GAAGAGATGTGTGCGTGGG-3'[0048]模板：5'-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTACCCCAATTTCGCCATCTTCCCCCACGCACACATCTCTTC-37[0049]其中，rA表示核糖核酸;-表示镉离子切割位点。[0050]本发明还提供与上述方法配套的检测试剂盒，所述试剂盒至少包括以下成分:底物链、酶链、正向隔断引物和模板等。[0051]本发明试剂盒的检测分析原理:首先将底物链与酶链进行杂交形成具有特异性镉离子切割活性的核酶，当镉离子存在的条件下发生切割反应，切割下来的核酸片段可以与模板结合进行PCR延伸，由于通用的正向隔断引物的隔断作用阻碍了聚合酶的延伸，使得PCR产物是带有长富G序列的单链，PCR产物在适宜的缓冲条件下缓冲液中含有K+形成G四链体，催化H2O2和ABTS显色，进而完成对镉离子的检测。[0052]具体检测方法如下：[0053]1核酶的构建:将底物链与酶链I按等摩尔比例混合，用缓冲液稀释至浓度1μΜ_2μM，85-95°C加热15min，然后缓慢降至25-37°C大约耗时45min，即得核酶液；[0054]2切割反应：向35yL上述核酶液中加入待测样品溶液，形成40yL体系，于25-37°C孵育4-6min，然后加入4-6yL终止液，得到切割产物；[0055]3超速PCR反应:配制由正向隔断引物、切割产物、模板、DNA聚合酶、dNTP、反应缓冲液和CldH2O组成的PCR反应体系，进行PCR扩增反应；[0056]4显色反应:将80yL酶活缓冲液、IOyL氯高铁血红素溶液与IOyLPCR产物混合，于37°C反应30min，加入IOOyLABTS显色液，混匀，37°C避光孵育IOmin，根据加入显色液前后溶液颜色的变化来判断待测样品中是否含有镉离子以及镉离子浓度的高低。可通过肉眼直接观察溶液颜色的变化，或利用酶标仪测定溶液的OD值变化。[0057]其中，步骤1所述缓冲液的配方为25mMHEPES液pH7.6。[0058]步骤2所述终止液的配方为:0·2MEDTA，2MNaCl，0·5MTris。[0059]步骤4所述酶活缓冲液的配方为：IOOmMTris、120mMNaCKlOmMMgCl2UOOmMKCl，pH8.4〇[0060]步骤4所述氯高铁血红素溶液的配制方法为：用DMSO配制浓度为20mM的氯高铁血红素原液，将2yL氯高铁血红素原液与ImL所述酶活缓冲液混合，即得。[0061]优选地，步骤3中PCR反应体系如下：[0062][0063]PCR反应程序如下：90-95°C2s，55-60°C3s，30-40个循环。优选地，PCR反应程序为：95°C2s，58°C3s，36个循环。[0064]配制一系列浓度的镉离子标准溶液，按照上述方法进行检测。步骤4利用酶标仪测定溶液0D415值来判断显色情况，并根据溶液颜色变化绘制显色的标准曲线:y=0.0016x+0.2268，R2=0.9934，从而可实现对镉离子的定量检测。[0065]本方法的镉离子检测限是I-600nM。[0066]借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：[0067]本发明通过建立一种隔断快速扩增镉离子切割型功能核酸比色传感器，用于镉离子的快速可视化检测。根据镉离子的特异性核酶，设计隔断引物对其进行超快聚合酶链式反应，结合富G序列在K+存在条件下形成具有类过氧化物酶活性的G四链体，构建了一种新型的基于通用隔断引物的镉切割型功能核酸比色传感器，并提供了一种快速、可视的镉离子检测新方法。使样品的检测时间大大缩短，检出限达nM级，而且本发明成功解决了PCR产物的可视化问题，对解决现场实时快速检测具有重要的现实意义。[0068]—本方法首次构建了隔断引物，对模板进行超快扩增，将耗时3小时左右的传统PCR过程缩减到10分钟，显著减少了PCR反应的用时。[0069]二）引物的隔断作用阻碍了聚合酶的延伸，获得单链核酸序列。[0070]三结合G四链体的类过氧化物酶活性进行显色，PCR产物可直接与ABTS发生颜色变化，解决了传统PCR产物难于可视化检测的难题。[0071]四）本方法可实现镉离子的大批量、快速检测。附图说明[0072]图1为本发明实施例1中镉离子核酶制备并切割验证的结果；其中，泳道1:核酶酶链-Cd;泳道2:核酶-Cd;泳道3-4:切割体系。[0073]图2为本发明实施例1中超速PCR扩增产物的胶图；其中，泳道1:DNAMarker2000;泳道2-3:镉离子超速PCR产物。[0074]图3为本发明实施例1中根据不同浓度镉离子及溶液颜色变化绘制显色的标准曲线。[0075]图4为本发明实施例2中生物传感器特异性检测结果。具体实施方式[0076]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。[0077]本发明中，ABTS显色液的配方为：ImLDNAzyme底物缓冲液，柠檬酸0.933g，蒸馏水IOOmL，5yLABTS底物溶液，IyL30%H2O2。[0078]0财”1116底物缓冲液：即为？!13.6的柠檬酸盐缓冲液，配方为：此2耶〇4.12!1201·843g，柠檬酸0·933g，蒸馏水100mL。[0079]ABTS底物溶液:取20mg2联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐粉末购自Sigma公司）溶于ImLDMSO，即得。[0080]实施例1镉离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器的建立[0081]1、实验材料[0082]SYBRGold核酸染料、核酸分子量标准ultra-lowrangeDNAladder、dNTP、ExTaqDNA聚合酶、IOXTaqbuffer、氯高铁血红素、氯化镉、2,2_联氮-二3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸二胺盐ABTS、H202、氯化钾、氯化钠、氯化镁、磷酸氢钾、乙二胺四乙酸二钠、尿素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES、氢氧化钠、磷酸氢二钠，均购自赛默飞科技（ThermoScientificLifeTechnologies。实验用水均来自Milli-Q纯水系统。[0083]序列设计如下（SEQIDNO:1-5:[0084][0085]注:核酶切割目标产物和扩增模板3’端序列互补；[0086]核酶底物链末端所添加的加粗碱基序列是为了增加与模板结合Tm值;切割位点用-表不；[0087]核酶底物链-Cd和核酶酶链-Cd共同组成镉离子的特异性核酶核酶-Cd。[0088]2、核酶的构建及切割反应体系的验证[0089]将4yL核酶底物链-Cd10μΜ母液）与4yL核酶酶链-Cd10μΜ母液）用缓冲液（25mMHEPES液，pH7.6稀释至4^1^，95°：加热151^11，然后缓慢降至25°：，大约耗时451^11。[0090]加入5yL氯化镉溶液（ΙμΜ母液），形成40yL体系，于25°C下孵育6分钟，在40yL体系中加入5yL终止液浓度为0.2MEDTA，2MNaCl，0.5MTris，混匀后4摄氏度保存。用20%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，得到镉离子核酶切割后的小片段，证明镉离子核酶的制备与切割成功图1。[0091]3、超速PCR装置的搭建以及超速PCR反应体系的建立与验证[0092]超速PCR装置的具体结构、连接方式和工作原理、工作过程包括:超速PCR装置的温度变化经由一个95°C的高温水浴锅和一个58°C的中温水浴锅来实现。采用LightCycIer型号的毛细管（20yL，04929292001，Roche作为PCR样品室。通过快速离心的方式，样品会分别聚集到各个毛细管一端;离心完成后带有样品的毛细管被固定在一个专用的塑料支架上。[0093]镉离子超速PCR体系如下：[0094][0095]在实际检测中，切割产物是指上述切割反应体系中，用待测样品替换标样。[0096]在冰上配制IOyL反应体系，迅速置于超速PCR反应装置中进行温度控制。超速PCR反应程序:95°C2s，58°C3s，36个循环，总计3min。[0097]完成超速PCR反应过程，使用2%琼脂糖凝胶电泳验证超速PCR反应体系的扩增效果，反应条件：120V0.5h，拍照系统:MolecularImagerGelDocXRBio-Rad。[0098]实验结果表明，在切割产物存在时可以使模板在短时间内进行扩增图2。[0099]4、显色模块的建立与验证[0100]80yL酶活缓冲液（IOOmMTris、120mMNaCl、10mMMgCl2、100mMKCl，pH8.4，10yL氯高铁血红素溶液与IOyLPCR产物，混匀后37°C反应30min，使PCR产物结合氯高铁血红素形成具有类过氧化物酶活性的G四链体结构，加入IOOyLABTS显色液，混匀，37°C避光孵育IOmin，酶标仪测定OD415。[0101]所述氯高铁血红素溶液的配制方法为：用DMSO配制浓度为20mM的氯高铁血红素原液，将2yL氯高铁血红素原液与ImL所述酶活缓冲液混合，即得。[0102]5、镉离子超灵敏、可视化的快速检测[0103]根据上述优化体系，分别加入不同浓度的镉离子的切割产物进行超快PCR，PCR产物在适宜的缓冲条件下形成G四链体进行ABTS显色，根据颜色变化绘制显色的标准曲线（图3〇[0104]Cr3+检测范围是1-600ηΜ可在此范围内实现定量检测），最低检出限是0.36nM。[0105]实施例2传感器特异性考察[0106]按照实施例1构建的生物传感器，分别将IOOnMCd2+，10yM的Ag+、Mg2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+加入到体系中进行检测，结果表明，所建立的Cd2+生物传感器具有较好的特异性图4。[0107]实施例3加标实验[0108]取高纯水用实施例1构建的生物传感器进行检测，Cd2+无检出，对其进行加标实验，连续测定多次所得结果见表1。[0109]表ICd2+加标回收实验结果[0110][0111]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

权利要求：1.一种镉离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器，其特征在于，包括：（1切割体系，⑵SPCR扩增体系，⑶包含ABTS显色液的检测体系；所述检测体系用于对待测样品依次经由所述切割体系、sPCR扩增体系进行反应后所得产物进行显色检测；其中，所述切割体系包括底物链和酶链：底物链:5-CTCACTATArG—GAAGAGATG-3'酶链：5'-CATCTCATCTAACAGCGTTCCGAAATAGC-3'其中，rA表示核糖核酸;-表示镉离子切割位点；所述sPCR扩增体系包括:正向隔断引物、反向引物、模板：正向隔断引物：5-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-隔断物-CCAACCCGCCCTACCCACTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-37反向引物：5-GAAGAGATGTGTGCGTGGG-3'模板：5'-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTACCCCAATTTCGCCATCTTCCCCCACGCACACATCTCTTC-3。2.根据权利要求1所述的传感器，其特征镉在于，所述正向隔断引物中的隔断物为聚六乙二醇。3.根据权利要求1或2所述的传感器，其特征在于，所述检测体系包括:酶活缓冲液和氯尚铁血红素溶液。4.权利要求1-3任一项所述传感器在检测镉离子方面中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测为定性检测或定量检测。6.利用权利要求1-3任一项所述传感器对镉离子进行定性检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：51、向所述切割体系中加入待测样品，进行切割反应；52、将Sl所得切割产物加入所述sPCR扩增体系中进行超快聚合酶链式反应，得sPCR产物；53、利用所述检测体系对所述sPCR产物进行检测。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，Sl具体如下：将底物链与酶链按等摩尔比例混合，用缓冲液稀释至浓度1μΜ-2μΜ，85°095°：加热15min，然后降温至25-37°C，得到核酶液；向35yL所述核酶液中加入待测样品溶液，形成40yL体系，于36-38°C孵育4-6min，然后加入4-6yL终止液，得到切割产物。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测体系包括酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液，将酶活缓冲液、氯高铁血红素稀释溶液和sPCR产物按体积比为8:1:1混匀，在35-38°C条件下反应20-40min，加入与前述混合物等体积的ABTS显色液，混匀，35-38°C避光孵育，肉眼进行监测。9.利用权利要求1-3任一项所述传感器对镉离子进行定量检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：SI、制作标准曲线：利用已知浓度的镉离子溶液，构建具有不同镉离子浓度的切割体系，sPCR扩增、HCR反应与检测步骤与权利要求6中的步骤相同；以镉离子浓度为横坐标，以〇D415值为纵坐标，绘制标准曲线；SII、按照权利要求6所述的方法对待测样品进行检测，将测得的OD415值代入标准曲线，计算得到待测样品中镉离子的含量，实现对镉离子的定量检测。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述不同镉离子浓度的浓度区间为1-600nM〇

百度查询： 中国农业大学 一种镉离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器

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