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【发明授权】基于多种肠道细菌含量评估便秘风险及便秘程度的方法及装置_上海宝藤生物医药科技股份有限公司;上海宝藤医学检验所有限公司_201910101058.8 

申请/专利权人:上海宝藤生物医药科技股份有限公司;上海宝藤医学检验所有限公司

申请日:2019-01-31

公开(公告)日:2020-05-26

公开(公告)号:CN109749960B

主分类号:C12N1/20(20060101)

分类号:C12N1/20(20060101);C12Q1/6851(20180101);C12Q1/06(20060101);C12R1/145(20060101);C12R1/01(20060101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2020.05.26#授权;2019.06.07#实质审查的生效;2019.05.14#公开

摘要:本发明提供了基于多种肠道细菌含量评估便秘风险及便秘程度的方法及装置。具体地,本发明提供了一种生物标志物集合,所述的集合包括选自下组两种或多种的生物标志物:拟杆菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌、肠杆菌属、哈撒魏氏梭菌、或其组合。本发明以肠道中便秘相关的细菌为靶点,采用荧光PCR技术快速高效检测细菌相对含量,在便秘临床诊断中具备客观、及时、快速准确等优势,可辅助临床医生有针对性的选择制定最佳治疗方案,大幅度缩短患者治疗周期,早日恢复肠道健康。

主权项:1.一种生物标志物集合,其特征在于,所述的集合包括选自下组的3种生物标志物:普拉梭菌、阿克曼氏菌和哈撒魏氏梭菌。

全文数据:基于多种肠道细菌含量评估便秘风险及便秘程度的方法及装置技术领域本发明涉及医学生物检测技术领域,具体地涉及基于多种肠道细菌含量评估便秘风险及便秘程度的方法及装置。背景技术功能性便秘Functionalconstipation,简称便秘是临床上常见的胃肠道功能性疾病。临床症状主要表现为排便次数减少-1.5时标记为基本正常;当评估值在-4~-1.5范围内时,标记为轻度失衡;当评估值在-6.5~-4范围内时,标记为中度失衡,当评估值2O7ul引物1ulDNA2ul表2根据PCR反应体系及实验设计表格进行加样。1.4.3PCR扩增:将96孔板放入Real-TimePCR仪的托盘上,关上托盘。打开7500Softwarev2.0.5软件,按照96孔板格式纸上的内容,一一对应,设置每孔的样品和引物,其中target为引物,sample为样品。反应程序为:备注:★表示在此步要采集荧光信号;溶解曲线中从60℃到95℃的升温过程中每0.3℃采集一次荧光信号。运行开始。注意:等PCR仪的托盘上移,仪器开始运行时,才可以离开-----此时可根据仪器上显示的总程序时间初步判断反应程序有没有设置错误。1.5结果判断1.5.1样品溶解曲线峰型单一,溶解温度与验证时相近,复孔CT值标准差不超过0.2。1.5.2阴性对照没有起峰;或溶解曲线峰型比较杂乱或TM值与样本TM值有明显差异,CT值超过30.1.5.3符合上述条件即认为样品检测成功,否则重做。肠杆菌属中有系统误差,不再此范围内1.6数据分析1.6.1原理:每版取同一个阈值,确定整版的CT值,采用2^-△Ct法CT值比较法来计算样本目的基因的表达差异。△Ct=目的基因Ct值—16srDNACt值细菌相对含量为2^-△Ct。1.6.2评价方法:便秘相关肠道细菌在人群中所占位置高于75%的正常人群范围标记为偏高,低于25%的正常人群标记为偏低,在25%-75%之间标记为正常。评价体系评估系数及参考范围如下:益生菌及便秘负相关细菌如表3所示:表3便秘正相关细菌及便秘病史如表4所示:表4根据评价方法对健康人及便秘患者粪便中便秘相关细菌进行综合评分如表5所示:表5综合评分评价的参考范围如表6所示:表6参考评判范围-6.5-4-1.5综合评价重度失衡中度失衡轻度失衡基本正常用本发明中综合评估体系对入组的健康人、便秘患者样本进行回顾分析,发现,本方法中便秘患者均表现为便秘相关细菌中度6例或重度9例失衡;健康人表现为便秘相关细菌基本正常27例或轻度失衡18例如下表7所示。表7表8表8显示了如何从18种菌种筛选出了本发明的10种菌。根据健康组与便秘组样本细菌相对含量的差异显著性及细菌与便秘的相关性高低来确定入组细菌及权重系数故本发明通过禅道菌评估便秘方法可行,且有准确性较高,同时能够对健康人中便秘相关肠道菌轻度失衡人群进行预警提示。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表上海宝藤生物医药科技股份有限公司上海宝藤医学检验所有限公司基于多种肠道细菌含量评估便秘风险及便秘程度的方法及装置P2018-229622SIPOSequenceListing1.0119DNA人工序列ArtificialSequence1tcgcgtcctggtgtgaaag19218DNA人工序列ArtificialSequence2ccacatccagcagtccac18319DNA人工序列ArtificialSequence3agcagtagggaatcttcca19417DNA人工序列ArtificialSequence4caccgctacacatggag17519DNA人工序列ArtificialSequence5ctgaaccagccaagtagcg19624DNA人工序列ArtificialSequence6ccgcaaactttcacaactgactta24718DNA人工序列ArtificialSequence7ccagccaagtagcgtgca18820DNA人工序列ArtificialSequence8tggaccttccgtattaccgc20917DNA人工序列ArtificialSequence9cccttcagtgccgcagt171018DNA人工序列ArtificialSequence10gtcgcaggatgtcaagac181120DNA人工序列ArtificialSequence11cagcacgtgaaggtggggac201220DNA人工序列ArtificialSequence12ccttgcggttggcttcagat201319DNA人工序列ArtificialSequence13atcagatgtgcccagatgg191419DNA人工序列ArtificialSequence14ccgtgtctcagttccagtg191519DNA人工序列ArtificialSequence15ggaatattgcacaatgggc191620DNA人工序列ArtificialSequence16agccggtgcttcttagtcag201722DNA人工序列ArtificialSequence17gtaacaaaggtgtcgtttctcg221823DNA人工序列ArtificialSequence18gcaccrtcaaatacaggtgtagc231919DNA人工序列ArtificialSequence19gggctgcggaagcaactta192020DNA人工序列ArtificialSequence20gatgacctcgccctgatcat202119DNA人工序列ArtificialSequence21cgtcagctcgtgycgtgag192217DNA人工序列ArtificialSequence22cgtcrtccccrccttcc17

权利要求:1.一种生物标志物集合,其特征在于,所述的集合包括选自下组两种或多种的生物标志物:拟杆菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌、肠杆菌属、哈撒魏氏梭菌、或其组合。2.如权利要求1所述的生物标志物集合,其特征在于,所述集合还包括选自下组的生物标志物:双歧杆菌属、乳酸杆菌属、普雷沃菌属、直肠真杆菌、韦荣氏菌、或其组合。3.如权利要求1所述的生物标志物集合,其特征在于,所述集合还包括选自下组的生物标志物:厚壁菌门、大肠杆菌、粪肠球菌属、丁酸梭菌、史氏甲烷短杆菌、罗氏弧菌、另枝菌。4.一种用于评估便秘风险及便秘程度的试剂组合,其特征在于,所述试剂组合包括用于检测如权利要求1所述的集合中各个生物标志物的试剂。5.一种试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括如权利要求1所述的集合和或如权利要求4所述的试剂组合。6.一种生物标志物集合的用途,其特征在于,用于制备一试剂盒,所述的试剂盒用于评估待测对象的便秘风险或待测对象的便秘程度,其中,所述生物标志物集合包括选自下组的两种或多种生物标志物:拟杆菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌、肠杆菌属、哈撒魏氏梭菌、或其组合。7.一种评估待测对象的便秘风险及便秘程度的方法,其特征在于,包括步骤:1提供一来源于待测对象的样品,用PCR方法对样品中所述集合中各个生物标记物的水平进行检测;2根据评价体系对步骤1测得的水平进行评价。8.一种筛选评估便秘风险及便秘程度的候选化合物的方法,其特征在于,包括步骤:1在测试组中,向待测对象施用测试化合物,检测测试组中来源于所述对象的样品中集合中各个生物标记物的水平V1;在对照组中,向待测对象施用空白对照包括溶媒,检测对照组中来源于所述对象的样品中所述集合中各个生物标记物的水平V2;2对上一步骤检测得到的水平V1和水平V2进行比较,从而确定所述测试化合物是否是治疗便秘的候选化合物,其中所述集合包括两种或多种选自下组的生物标志物:拟杆菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌、肠杆菌属、哈撒魏氏梭菌。9.一种生物标志物集合的用途,其特征在于,用于筛选评估便秘风险及便秘程度的候选化合物和或用于评估候选化合物对便秘的治疗效果,其中,所述生物标志物集合选自下组的两种或多种的生物标志物:拟杆菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌、肠杆菌属、哈撒魏氏梭菌、或其组合。10.一种便秘早期辅助筛查系统,其特征在于,所述系统包括:a便秘相关疾病特征输入模块,所述便秘相关疾病特征输入模块用于输入某一对象的便秘相关疾病特征;其中所述的便秘相关疾病特征包括选自下组A的2种或多种:拟杆菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌、肠杆菌属、哈撒魏氏梭菌、或其组合;b便秘相关疾病判别处理模块,所述处理模块对于输入的便秘相关疾病特征,按预定的判断标准进行评分处理,从而获得风险度评分;并且将所述风险度评分与便秘相关疾病的风险度阈值进行比较,从而得出辅助筛查结果,其中,当所述风险度评分高于所述风险度阈值时,则提示该对象患便秘相关疾病的风险高于正常人群;当所述风险度评分低于所述风险度阈值时,则提示该对象患便秘相关疾病的风险高于正常人群;和c辅助筛查结果输出模块,所述输出模块用于输出所述的辅助筛查结果。

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