申请/专利权人：浙江工业大学

申请日：2017-12-31

公开（公告）日：2020-05-26

公开（公告）号：CN108220170B

主分类号：C12N1/14(20060101)

分类号：C12N1/14(20060101);C12N9/42(20060101);C12R1/645(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.05.26#授权;2018.07.24#实质审查的生效;2018.06.29#公开

摘要：本发明公开了一种裂殖壶菌WZYU059及其生产纤维素酶的应用，将裂殖壶菌通过斜面培养、种子培养和发酵培养即可得到纤维素酶酶液。该方法首次使用裂殖壶菌在包含葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和海盐等廉价原料的培养基中快速生产纤维素酶。利用本发明所述制备方法所得纤维素酶具有较好的pH稳定性,能够解决工业生产中酶在环境酸碱变化时存在的pH稳定性差的问题。同时该方法成本低，工艺流程简单，设备要求低，可控性强，适用于工业化生产。

主权项：1.裂殖壶菌Aurantiochytriumsp.WZYU059，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M2016620，保藏日期为：2016年11月7日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。

全文数据：裂殖壶菌及其产纤维素酶的应用一技术领域[0001]本发明涉及一种纤维素酶的制备，特别涉及一种利用裂殖壶菌生产纤维素酶的方法。二背景技术[0002]裂殖壶囷（Aurantiochytriumsp.是一种海洋类真菌的异养型微生物，多分布于环境多变的海洋生境，能够充分利用自身的多酶体系高效分解环境中的各种基质，以适应温度和pH等环境因子的剧烈变化而快速生长。然而来源于裂殖壶菌且具有工业价值的酶制剂并未见报道。[0003]纤维素酶是由多种水解酶组成的复杂酶体系，通常将其分成三类：即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。由于纤维素是自然界最丰富的可再生资源，所以纤维素酶是工业生产中应用最为广泛的酶之一，可用于木质纤维素的处理、加工和生物转化；另外纤维素酶在纺织、造纸、饲料、食品和去污剂产业中均被广泛应用。[0004]微生物是纤维素酶的重要来源，目前细菌、真菌和酵母等微生物均有产纤维素酶的报道。根据纤维素酶的作用pH可将其分成酸性、中性和碱性纤维素酶，其中酸性纤维素酶主要用于生物能源和纺织水洗等领域；中性纤维素酶用于纺织水洗产业;而碱性纤维素酶主要用于洗涤剂中。虽然纤维素酶有不同的作用pH，但目前普遍存在pH稳定性不足的问题，难以适应工业生产中的酸碱变化。三发明内容[0005]本发明目的是提供一种新菌株一裂殖壶菌Aurantiochytriumsp.WZYU059及利用裂殖壶菌WZYU059高效生产pH稳定纤维素酶的方法。本发明首次使用已通过食品安全认证的海洋微生物裂殖壶菌，采用廉价原料高效生产纤维素酶，有效降低了纤维素酶的生产成本，且该酶在宽pH范围内均具有较高活性，解决了工业纤维素酶稳定性不足的问题，且整个工艺流程简单，设备要求低，可控性强，适用于工业化生产。[0006]本发明采用的技术方案是：[0007]本发明提供一株新菌株--裂殖壶菌Aurantiochytriumsp.WZYU〇59,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCCN0:M2016620,保藏日期为:2〇16年11月7日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。[0008]本发明还提供一种利用裂殖壶菌WZYU059生产纤维素酶的方法，所述方法为:将裂殖壶菌WZYU059接种至发酵培养基中，在25-35°C下，50-600rpm振荡培养，得到发酵液，将发酵液离心，弃细胞沉淀，得到含纤维素酶的粗酶液，将粗酶液分离纯化，获得纤维素酶;所述发酵培养基组成为:葡萄糖20-120gL，酵母粉10_80gL，蛋白胨0_40gL0是指不含蛋白胨的情况，含有蛋白胨时，含量为5〜20gL，海盐20gL，溶剂为水，pH值自然。[0009]进一步，所述裂殖壶菌WZYU059接种前先进行斜面活化和种子扩大培养：（1斜面培养:将裂殖壶菌WZYU059接种于平板培养基，28-30°C下培养2-3天;所述斜面培养基组成为:葡萄糖10_40gL，酵母粉lOgL，蛋白胨5gL，海盐2〇gL，琼脂20gL，溶剂为水，pH值自然；⑵种子培养：将斜面菌体接入含l〇0mL种子培养基的5〇〇mL三角瓶中，在28-30°C下，180rpm震荡培养1-2天，得到种子液;所述种子培养基组成为:葡萄糖6〇gL，酵母粉10gL，蛋白胨5gL，海盐20gL，溶剂为水，pH值自然。[0010]进一步，所述裂殖壶菌WZYU059发酵培养方法为:将种子液接入含发酵培养基的发酵罐中，在25_35。!；下，转速50-600印111，通气量10-20017111；[11，溶氧量10-60%的条件下，培养时间1-6天，获得发酵液，更优选发酵条件为：28_32°C，转速100-300rpm，通气量50_80Lmin，溶氧量20-50%，培养时间4-6天。[0011]进一步，所述种子液以体积浓度的1%_2〇%的接种量接种至发酵培养基。[0012]进一步，所述发酵液离心条件为:8000rpm，4°C下离心5min。[0013]进一步，所述发酵培养基组成为:葡萄糖100gL，酵母粉20gL，蛋白胨10gL，海盐20gL，溶剂为水，pH值自然。[0014]本发明裂殖壶菌WZYU059所产纤维素酶的特征:该酶最适作用pH为5•0，在pH3.0-8.0的范围内，仍保留最佳活力的80%以上活性;该酶在pH3•0-9•0范围内具有较好的稳定性，相对酶活力均能保持在7〇%以上。[0015]与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：[0016]裂殖壶菌较其它纤维素酶生产菌株有很多优势：1培养基配方简单成本低廉，适用于大规模生产;2生产纤维素酶的方式为胞外分泌，简化其提取和分离工艺;3生产纤维素酶具有较高的pH稳定性，解决了纤维素酶在实际生产中pH稳定性不足的问题;4裂殖壶菌已通过权威安全认证，能够应用于食品医药等领域。四附图说明[0017]图1是裂殖壶菌WZYU059菌种菌落形态。[0018]图2是裂殖壶菌WZYU059菌株在番红平板上所形成的透明圈。[0019]图3是裂殖壶菌WZYU059纤维素酶相对活力的影响。[0020]图4是温度对裂殖壶菌WZYU059纤维素酶的pH稳定性。五具体实施方式[0021]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：[0022]实施例1裂殖壶菌WZYU059筛选及鉴定[0023]1菌株WZYU059筛选[0024]在浙江省温州市乐清湾海边采集腐叶样品，洗净放于表面悬浮0•lg松花粉的YP培养液（1gL酵母粉，lgL蛋白胨，50mgL氨苄青霉素，50mgL链霉素，水配制，pH6•0中，30°C黑暗培养1周，取50uL培养物涂布于YP平板（lgL酵母粉，lgL蛋白胨，50mgL氨苄青霉素，50mgL链霉素，琼脂20gL，水配制，pH值6•0上，28°C培养3天，直到长出单菌落，重复划线GYP平板纯化培养三次，得到纯的菌株。将纯的菌落点种在CMC-刚果红平板上，3〇°C倒置培养3天，观察透明圈，标记菌种WZYU059。[0025]GYP平板培养基组分为gL:葡萄糖20，酵母粉1〇，蛋白陈5，海盐20，琼脂20，溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌3〇min，倒制平板。[0026]CMC-刚果红平板组分为gL:羧甲基纤维素钠CMC5,酵母粉10,蛋白陈5,刚果红0.2，海盐20，琼脂20，溶剂为水，pH值7•0，115°C灭菌30min，倒制平板。[0027]2菌株WZYU059鉴定[0028]细胞形态特征：[0029]将菌株WZYU003接种在GYP培养基中，28°C培养2天，在显微镜下细胞呈圆形或椭圆形，直径5-20M，细胞表面比较明亮，有鳞片状结构，边缘清晰，细胞分裂增殖，有偶数个细胞聚集在一起的现象图3。[0030]菌株WZYU〇59的ISSrDNA序列见SEQIDNo.1所示。与Aurantiochytriumsp.菌株KRS101和ST-2〇12等菌株的WSrDNA序列相似度可达99%，故将将菌株WZYU059鉴定为裂殖壶菌Aurantiochytriumsp.，命名为裂殖壶菌Aurantiochytriumsp.WZYU〇59,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCCN0:M2016618,保藏日期为:2016年11月7日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。[0031]实施例2裂殖壶菌WZYU059液体发酵生产纤维素酶[0032]将_8〇°C保存的裂殖壶菌WZYU059菌株转接到斜面培养基上，30°C静止培养2天;将菌体接入含lOOmL种子培养基的500mL三角瓶中，3TC，l8〇rpm震荡培养1天，得到种子液;将种子液按体积浓度10%的接种量转到含3L发酵培养基的发酵罐中，3TC，转速300rpm，通气量8〇Lmin，溶氧量3〇%条件下培养3天，得到发酵液;将发酵液8000rpm，4°C下离心5min，弃细胞沉淀得到粗酶液，酶活力为128.4UmL。[0033]以羟甲基纤维素钠CMC作为底物，结合DNS3，5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活性。酶活定义:50°C，pH4.8条件下，每分钟从5mgmL的CMC中释放1圓〇1的还原糖似葡萄糖计算所需的酶量为一个酶活单位⑹。0•5mL、5mgmLCMC水溶液与0.5mL酶液混合，5TC和pH4•8条件下反应15min，加入1•5mLDNS试剂，沸水浴5min，冷却至室温，定容至5mL，以提前灭活的酶液作为对照，540nm下测定吸光度，计算酶活力。[0034]斜面培养基组成为gL:葡萄糖40，酵母粉10，蛋白胨5，海盐20，琼脂20，溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min;种子培养基为gL:葡萄糖60，酵母粉10，蛋白胨5，海盐2〇,溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌3〇min;发酵培养基为gL:葡萄糖60,酵母粉10,蛋白胨5，海盐20，溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min。[0035]实施例3裂殖壶菌WZYU059液体发酵生产纤维素酶[0036]将-8〇°C保存的裂殖壶菌WZYU059菌株转接到斜面培养基上，28r静止培养2天;将菌体接入含l〇〇mL种子培养基的500mL三角瓶中，28°C，180rpm震荡培养1天，得到种子液;将种子液按体积浓度20%的接种量转到含3L发酵培养基的发酵罐中，25°C，转速600rpm，通气量lOOLrain，溶氧量50%条件下培养2天，得到发酵液;将发酵液SOOOrpnufC下离心5min，弃细胞沉淀得到粗酶液，酶活力为92.4UmL。[OO37]以羟甲基纤维素钠CMC作为底物，结合DNS3，5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活性。酶活定义:5〇°C，pH4.8条件下，每分钟从5mgmL的CMC中释放lwnol的还原糖（以葡萄糖计算所需的酶量为一个酶活单位⑼。0.5mL、5mgmLCMC水溶液与〇.5mL酶液混合，5TC和pH4.8条件下反应15min，加入1•5mLDNS试剂，沸水浴5min，冷却至室温，定容至5mL，以提前灭活的酶液作为对照，540nm下测定吸光度，计算酶活力。[0038]斜面培养基组分为gL:葡萄糖40,酵母粉10,蛋白胨5,海盐20,琼脂2〇,溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min;种子培养基为gL:葡萄糖60，酵母粉10，蛋白胨5，海盐20，溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min;发酵培养基为gL:葡萄糖20，酵母粉1〇，蛋白胨0，海盐20，溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min。[0039]实施例4裂殖壶菌WZYU059液体发酵生产纤维素酶[0040]将_80°C保存的裂殖壶菌WZYU059菌株转接到斜面培养基上，28°C静止培养2天;将菌体接入含lOOmL种子培养基的500mL三角瓶中，28°C，180rpm震荡培养1天，得到种子液;将种子液按体积浓度1%的接种量转到含3L发酵培养基的发酵罐中，35°C，转速500rptn，通气量200Lmin，溶氧量60%条件下培养6天，得到发酵液;将发酵液SOOOrpm，4°C下离心5min，弃细胞沉淀得到粗酶液，酶活力为48.2UmL。[0041]以羟甲基纤维素钠CMC作为底物，结合DNS3,5_二硝基水杨酸法测定纤维素酶活性。酶活定义：50°C，pH4•8条件下，每分钟从5mgmL的CMC中释放lwnol的还原糖（以葡萄糖计算所需的酶量为一个酶活单位⑼。〇.5mLCMC溶液与0•5mL酶液混合，50°C和pH4•8条件下反应15min，加入1.5mLDNS试剂，沸水浴5min，冷却至室温，定容至5mL，以提前灭活的酶液作为对照，540nm下测定吸光度，计算酶活力。[0042]斜面培养基组分为gL:葡萄糖40，酵母粉10，蛋白胨5，海盐20，琼脂20，溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min;种子培养基为gL:葡萄糖60，酵母粉10，蛋白胨5，海盐20，溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min;发酵培养基为gL:葡萄糖120，酵母粉80，蛋白胨20，海盐20，溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min。[0043]实施例5裂殖壶菌WZYU059液体发酵生产纤维素酶[0044]将-80°C保存的裂殖壶菌WZYU059菌株转接到斜面培养基上，28°C静止培养2天;将菌体接入含l〇〇mL种子培养基的500mL三角瓶中，28°C，180rpm震荡培养1天，得到种子液;将种子液按体积浓度15%的接种量转到含3L发酵培养基的发酵罐中，28°C，转速50rpm，通气量10171^11，溶氧量10%条件下培养4天，得到发酵液;将发酵液8000印111，41：下离心5111111，弃细胞沉淀得到粗酶液，酶活力为53•9UmL。[OO45]以羟甲基纤维素钠CMC作为底物，结合DNS3，5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活性。酶活定义:5〇°：4114.8条件下，每分钟从511^11^的0以：中释放111111〇1的还原糖似葡萄糖计算所需的酶量为一个酶活单位U〇0_5mL、5mginLCMC水溶液与0.5mL酶液混合，50°C和pH4•8条件下反应15min，加入1.5mLDNS试剂，沸水浴5min，冷却至室温，定容至5mL，以提前灭活的酶液作为对照，540nm下测定吸光度，计算酶活力。[0046]斜面培养基组分为gL:葡萄糖10,酵母粉10,蛋白胨5,海盐20,琼脂20,溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min;种子培养基为gL:葡萄糖60，酵母粉1〇，蛋白胨5，海盐20，溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min;发酵培养基为gL:葡萄糖1〇〇，酵母粉20，蛋白胨40，海盐20，溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min。[0047]实施例6裂殖壶菌WZYU059纤维素酶最适pH及其稳定性[0048]使用不同PH值的缓冲液PH2•0为0•1M甘氨酸-盐酸缓冲液;PH3•0-6•0为0•1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液;PH7•0-9•0为0•1M巴比妥钠-盐酸缓冲液，PH10•0为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），分别配制口^1为2_0、3_0、4_0、5_0、6.0、7_0、8.0、9.0和10.0，浓度为5810^为底物，结合DNS标准方法测定实施例2裂殖壶菌WZYU059菌株发酵制备的粗酶液的纤维素酶活性，纤维素酶的最适pH为5•〇,将此作为100%，相同条件下其它pH值的底物对应的酶活力与之对比得到纤维素酶相对活力见图3。结果显示该酶在PH3.0_8.0范围内具有较高的酶活性大于最佳活力的80%。[0049]使用不同pH值的缓冲液pH2•0为0•1M甘氨酸-盐酸缓冲液;pH3•0-6•0为0.1M梓檬酸-柠檬酸钠缓冲液;PH7•0-9•0为0•1M巴比妥钠-盐酸缓冲液，pHl0•0为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液分别调节实施例2裂殖壶菌WZYU〇59菌株发酵制备的粗酶液的pH值至2•0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和1〇.〇,4°：保存6〇1^11，以010为底物结合0肥标准方法测定裂殖壶菌WZYU059纤维素酶活性，以自然PH的原酶液活力作为1〇〇%，计算得到不同pH条件下的相对酶活力，以评价该酶的?1^稳定性见图4。结果显示该酶在PH3•〇—9_0范围内具有较好的PH稳定性，相对酶活力均能保持在70%以上。

权利要求：1.裂殖壶菌Aurantiochytriumsp•WZYU059，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCCN0:M2016620,保藏日期为:2016年11月7日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。2.—种利用权利要求1所述裂殖壶菌WZYU059生产纤维素酶的方法，其特征在于所述方法为:将裂殖壶菌WZYU059接种至发酵培养基中，在25-35°C下，50-600rpm振荡培养，得到发酵液，将发酵液离心，弃细胞沉淀，得到含纤维素酶的粗酶液，将粗酶液分离纯化，获得纤维素酶;所述发酵培养基组成为：葡萄糖20_120gL，酵母粉10-80gL，蛋白胨0_40gL，海盐2〇gL，溶剂为水，pH值自然。3.如权利要求2所述利用裂殖壶菌WZYU059生产纤维素酶的方法，其特征在于所述裂殖壶菌WZYU059接种前先进行斜面活化和种子扩大培养：（1斜面活化:将裂殖壶菌WZYU059接种于斜面培养基，28-30°C下培养2-3天，获得斜面菌体;所述斜面培养基组成为:葡萄糖10-4〇gL，酵母粉1OgL，蛋白胨5gL，海盐20gL，琼脂20gL，溶剂为水，pH值自然；（2种子培养:将斜面菌体接入含l〇〇mL种子培养基的5〇OmL三角瓶中，在28-30°C下，180rpm震荡培养1-2天，得到种子液;所述种子培养基组成为:葡萄糖60gL，酵母粉10gL，蛋白胨5gL，海盐2〇gL，溶剂为水，pH值自然。4.如权利要求3所述利用裂殖壶菌WZYU059生产纤维素酶的方法，其特征在于所述发酵液按如下方法制备：将种子液接入含发酵培养基的发酵罐中，在25-35°C下，转速50-600rpm，通气量10_200Lmin，溶氧量10-60%的条件下，培养时间1-6天，获得发酵液。5.如权利要求3所述利用裂殖壶菌WZYUOf59生产纤维素酶的方法，其特征在于所述种子液以体积浓度的1的接种量接种至发酵培养基。6.如权利要求4所述利用裂殖壶菌WZYU059生产纤维素酶的方法，其特征在于发酵培养条件为:28_32°C，转速100-3〇〇rpm，通气量5〇_8〇Lmin，溶氧量2〇-50%，培养时间4-6天。7.如权利要求2所述利用裂殖壶菌WZYU059生产纤维素酶的方法，其特征在于所述发酵液离心条件为:8000rpm，4°C下离心5min。8.如权利要求2所述利用裂殖壶菌WZYU059生产纤维素酶的方法，其特征在于所述发酵培养基组成为：葡萄糖l〇〇gL，酵母粉20gL，蛋白胨l〇gL，海盐20gL，溶剂为水，pH值自然。

百度查询： 浙江工业大学 裂殖壶菌及其产纤维素酶的应用

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