申请/专利权人：浙江工业大学

申请日：2017-12-31

公开（公告）日：2020-06-09

公开（公告）号：CN108220171B

主分类号：C12N1/14(20060101)

分类号：C12N1/14(20060101);C12N9/26(20060101);C12R1/645(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.06.09#授权;2018.07.24#实质审查的生效;2018.06.29#公开

摘要：本发明公开了一种裂殖壶菌WZYU003及其生产淀粉酶的应用，将裂殖壶菌通过斜面培养、种子培养和发酵培养即可得到淀粉酶粗酶液。该方法首次使用裂殖壶菌在包含葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和海盐等廉价原料的培养基中快速生产淀粉酶，大大降低了生产成本；且整个工艺流程简单，设备要求低，可控性强，适用于工业化生产。利用本发明所述制备方法所得淀粉酶具有较好的温度和pH稳定性,可以满足工业化生产淀粉酶的需求。

主权项：1.裂殖壶菌Aurantiochytriumsp.WZYU003，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M2016618，保藏日期为：2016年11月7日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。

全文数据：裂殖壶菌及其产淀粉酶的应用一技术领域[0001]本发明涉及一种淀粉酶的制备，特别涉及一种利用裂殖壶菌生产淀粉酶的方法。二背景技术[0002]裂殖壶囷（Aurantiochytriumsp.是一种海洋类真菌的异养型微生物，多分布于环境多变的海洋生境，能够充分利用自身的多酶体系高效分解环境中的各种基质，以适应温度和pH等环境因子的剧烈变化而快速生长。然而来源于裂殖壶菌且具有工业价值的酶制剂并未见报道。[0003]淀粉酶是水解淀粉和糖原类物质的酶的总称，是最早实现工业化生产、应用最为广泛的酶类，广泛应用于食品、纺织、制药、医疗、洗涤、造纸和饲料等领域，也成为工业上用量最多的酶之一。目前工业淀粉酶主要来源于芽孢杆菌属和古细菌等微生物，但目前淀粉酶仍存在不足，如温度pH稳定性不够，以及发酵成本较高等。三发明内容[0004]本发明目的是提供一种新菌株一裂殖壶菌Aurantiochytriumsp.WZYU003及利用裂殖壶菌WZYU003高效生产高稳定性淀粉酶的方法。本发明首次使用已通过食品安全认证的海洋微生物裂殖壶菌，采用廉价原料高效生产淀粉酶，有效降低了淀粉酶的生产成本，且该酶在宽温度和pH范围内均具有较高活性，解决了工业淀粉酶稳定性不足的问题，且整个工艺流程简单，设备要求低，可控性强，适用于工业化生产。[0005]本发明采用的技术方案是：[0006]本发明提供一株新菌株一裂殖壶菌Aurantiochytriumsp.WZYU003,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCCN0:M2016618,保藏日期为:2016年11月7日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。[0007]本发明还提供一种利用裂殖壶菌WZYU003生产淀粉酶的方法，所述方法为:将裂殖壶菌WZYU003接种至发酵培养基中，在2〇_35°C下，50-600rpm振荡培养，得到发酵液，将发酵液离心，弃细胞沉淀，得到含淀粉酶的粗酶液，将粗酶液分离纯化，获得淀粉酶;所述发酵培养基组成为：葡萄糖20-120gL，酵母粉10-60gL，蛋白胨0-20gL0是指不含蛋白胨的情况，含有蛋白胨时，含量为5-20gL，海盐20gL，溶剂为水，pH值自然。[0008]进一步，所述裂殖壶菌WZYU003接种前先进行平板活化和种子扩大培养：（1平板培养:将裂殖壶菌WZYU003接种于平板培养基，30°C下培养2_3天;所述平板培养基组成为：葡萄糖20gL，酵母粉10gL，蛋白胨5gL，海盐20gL，琼脂20gL，溶剂为水，pH值自然；⑵种子培养:将平板菌体接入含100mL种子培养基的50〇mL三角瓶中，在30°C下，200rpm震荡培养1-2天，得到种子液;所述种子培养基组成为:葡萄糖6〇gL，酵母粉10gL，蛋白胨5gL，海盐20gL，溶剂为水，pH值自然。[0009]进一步，所述裂殖壶菌ffZYUO〇3发酵培养方法为:将种子液接入含发酵培养基的发酵罐中，在20-35。：下，转速5〇_600rpm，通气量20-100Lmin，溶氧量10-60%的条件下，培养时间1天，获得发酵液，更优选发酵条件为：25-32°C，转速100-400rpm，通气量20-80Lmin，溶氧量20-50%，培养时间3-5天。[0010]进一步，所述种子液以体积浓度的1%-20%的接种量接种至发酵培养基。[0011]本发明裂殖壶菌WZYU003所产淀粉酶的特征:该酶最适作用pH为6•0，在PH4•0-S•〇的范围内，仍保留最佳活力的80%以上活性;该酶在pH5.0-10•0范围内具有较好的pH稳定性，相对酶活力均能保持在80%以上；该酶最适温度为60°C，在40-100°C范围内，仍保存80%以上的活性;将该酶在60°C下处理120min，仍能保留90%以上的酶活力；而在l〇〇°C下处理12〇11^11，该酶活性可保留80%以上。[0012]与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：[0013]裂殖壶菌较其它淀粉酶生产菌株有很多优势：1安全性高，可以广泛应用于食品领域;2能够利用葡萄糖、酵母粉和蛋白胨等传统廉价的原料，发酵培养基中的海盐组分能够替代其它菌种发酵生产淀粉酶所必须的无机盐，大大降低生产成本;3生产淀粉酶的方式为胞外分泌，大大简化了淀粉酶的提取和分离工艺，适合工业化生产;4生产淀粉酶具有较高的温度和pH稳定性，适合工业应用。四附图说明[0014]图1是裂殖壶菌WZYU003在淀粉酶筛选平板上形成的透明圈[0015]图2是裂殖壶菌WZYU003菌种平板菌落形态。[0016]图3是裂殖壶菌WZYU003菌种显微菌落形态。[0017]图4是pH对裂殖壶菌WZYU003淀粉酶相对活力的影响。[0018]图5是裂殖壶菌WZYU003淀粉酶的pH稳定性。[0019]图6是温度对裂殖壶菌WZYU003淀粉酶相对活力的影响。[0020]图7是裂殖壶菌WZYU003淀粉酶的温度稳定性。五具体实施方式[0021]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：[0022]实施例1裂殖壶菌WZYU003筛选及鉴定[0023]⑴菌株WZYU011筛选[0024]在浙江省温州市乐清湾海边采集腐叶样品，洗净放于表面悬浮〇•lg松花粉的YP培养液（lgL酵母粉，lgL蛋白胨，50mgL氨苄青霉素，50mgL链霉素，水配制，pH6•0中，30°C黑暗培养1周，取50uL培养物涂布于YP平板（lgL酵母粉，lgL蛋白胨，50mgL氨苄青霉素，50mgL链霉素，琼脂20gL，水配制，pH值6.0上，28°C培养3天，直到长出单菌落，重复划线GYP平板纯化培养三次，得到纯的菌株。将纯的菌落点种在淀粉酶筛选平板上，3〇°C倒置培养3天，观察透明圈，标记菌种WZYU003。[0025]GYP平板培养基组分为gL:葡萄糖2〇,酵母粉1〇,蛋白陈5,海盐2〇,琼脂20,溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min，倒制平板。[0026]淀粉酶筛选平板组分为gL:可溶性淀粉15,酵母粉10,蛋白陈5,海盐20,琼脂20，曲利苯蓝0.05，溶剂为水，pH值7.0，115°C灭菌30min，倒制平板。[0027]⑵菌株WZYU011鉴定[0028]细胞形态特征：[0029]将菌株WZYU003接种在GYP平板上，28°C培养2天，菌落呈黄白色，圆形，表面湿润光滑，微微隆起（图2;在显微镜下细胞呈圆形或椭圆形，直径5-20M1，细胞表面比较明亮，有鳞片状结构，边缘清晰，细胞分裂增殖，有偶数个细胞聚集在一起的现象图3。[0030]菌株WZYU003的ISSrDNA序列见SEQIDNo.l所示。与Aurantiochytriumsp•菌株KRS101和ST-2012等菌株的18SrDNA序列相似度可达99%，故将将菌株WZYU003鉴定为裂殖壶菌（Aurantiochytriumsp.，命名为裂殖壶菌（Aurantiochytriumsp_WZYU003,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCN0:M2016618,保藏日期为:2〇16年11月7曰，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。[0031]实施例2裂殖壶菌WZYU003液体发酵生产淀粉酶[0032]将-80°C保存的裂殖壶菌WZYU003菌株转接到斜面培养基上，30°C静止培养2天;将菌体接入含lOOmL种子培养基的500mL三角瓶中，30°C，200rpm震荡培养1天，得到种子液;将种子液按体积浓度4%的接种量转到含3L发酵培养基的发酵罐中，3〇°C，转速300rpm，通气量80Lmin，溶氧量60%条件下培养3天，得到发酵液;将发酵液5000rpm，4°C下离心5tnin，弃细胞沉淀得到粗酶液，酶活力达436.2UmL。[0033]利用DNS3,5_二硝基水杨酸法测定淀粉酶活性。酶活定义⑻是在6TC、pH6.0条件下，ltnin内酶解淀粉生成lug还原糖以葡萄糖计所需要的酶量。[0034]斜面培养基组成为gL:葡萄糖20，酵母粉10，蛋白陈5，海盐20，琼脂20，溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min;种子培养基为gL:葡萄糖60，酵母粉10，蛋白陈5，海盐20，溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min;发酵培养基为gL:葡萄糖60，酵母粉10，蛋白胨0,海盐20,溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min。[0035]实施例3裂殖壶菌WZYU011液体发酵生产淀粉酶[0036]将-80°C保存的裂殖壶菌WZYU003菌株转接到斜面培养基上，30°C静止培养2天;将菌体接入含lOOmL种子培养基的500mL三角瓶中，30°C，200rpm震荡培养1天，得到种子液;将种子液按体积浓度1%的接种量转到含3L发酵培养基的发酵罐中，35°C，转速6〇OrPm，通气量20Lmin，溶氧量10%条件下培养6天，得到发酵液;将发酵液5000rpm，4°C下离心5min，弃细胞沉淀得到粗酶液，酶活力达525.lUmL。[0037]利用DNS3，5-二硝基水杨酸法测定淀粉酶活性。酶活定义⑼是在60°C、pH6•0条件下，lmin内酶解淀粉生成Uxg还原糖（以葡萄糖计所需要的酶量。[0038]斜面培养基、种子培养基组成同实施例2,发酵培养基为gU:葡萄糖120,酵母粉60，蛋白胨2〇，海盐20，溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min。[0039]实施例4裂殖壶菌WZYU003液体发酵生产淀粉酶[0040]将-80°c保存的裂殖壶菌WZYU003菌株转接到斜面培养基上，3〇°C静止培养2天;将菌体接入含lOOmL种子培养基的500mL三角瓶中，30°C，200rpm震荡培养1天，得到种子液;将种子液按体积浓度20%的接种量转到含3L发酵培养基的发酵罐中，2〇°C，转速5〇rpm，通气量100Lmin,溶氧量60%条件下培养1天，得到发酵液;将发酵液5000rpm，4°C下离心5min，弃细胞沉淀得到粗酶液，酶活力达210.2UmL。[0041]利用DNS3，5-二硝基水杨酸法测定淀粉酶活性。酶活定义⑹是在60°C、pH6•0条件下，lmin内酶解淀粉生成lyg还原糖（以葡萄糖计所需要的酶量。[0042]斜面培养基和种子培养基组成同实施例2,发酵培养基组成为gL:葡萄糖20,酵母粉10,蛋白膝〇,海盐20,溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌30min。[0043]实施例5裂殖壶菌WZYU003液体发酵生产淀粉酶[0044]将-80°C保存的裂殖壶菌WZYU003菌株转接到斜面培养基上，3〇°C静止培养2天;将菌体接入含100mL种子培养基的500mL三角瓶中，3〇°C，200rpm震荡培养1天，得到种子液;将种子液按体积浓度10%的接种量转到含3L发酵培养基的发酵罐中，28°C，转速50〇rpm，通气量70Lrain，溶氧量50%条件下培养5天，得到发酵液;将发酵液5000rpm，4°C下离心5min，弃细胞沉淀得到粗酶液，酶活力达352•lUmL。[0045]利用DNS3，5-二硝基水杨酸法测定淀粉酶活性。酶活定义⑻是在60°C、pH6.0条件下，lmin内酶解淀粉生成lyg还原糖（以葡萄糖计所需要的酶量。[0046]斜面培养基和种子培养基组成同实施例2,发酵培养基为gL:葡萄糖1〇〇,酵母粉20，蛋白胨5，海盐20，溶剂为水，pH值自然，115°C灭菌3〇min。[0047]实施例6裂殖壶菌WZYU003淀粉酶最适温度、pH，及其稳定性[0048]使用不同PH值的缓冲液pH2•0为0•1M甘氨酸_盐酸缓冲液;pH3•0-6•0为0•1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液;PH7•0-9•0为0•1M巴比妥钠-盐酸缓冲液分别配制pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,浓度均为5gL可溶性淀粉溶液作为底物，利用DNS标准方法测定实施例3制备的裂殖壶菌WZYU003菌株发酵制备的粗酶液的淀粉酶活性，酶的最适pH为6.0,将此作为100%，相同条件下的其它pH值底物对应的酶活性与之对比得到淀粉酶相对活力见图2。结果显示该酶在pH4.0-8.0范围内具有较高的酶活性大于最佳活力的80%。[0049]使用不同pH值的缓冲液pH2•0为0•1M甘氨酸-盐酸缓冲液;pH3•0-6.0为0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液;PH7•0-9•0为0•1M巴比妥钠-盐酸缓冲液;pHIO•0为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液分别调节实施例3制备的裂殖壶菌WZYU003菌株发酵制备的粗酶液的pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0,4°：保存60111111，利用0胳标准方法测定淀粉酶活性，以自然pH的原酶液活力作为100%，计算得到不同pH条件下的相对酶活力，以评价该酶的PH稳定性见图3。结果显示该酶在pH5•0-10•0范围内具有较好的pH稳定性，相对酶活力均能保持在80%以上。[0050]将0.5mL的使用0•1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH6.0配制、浓度是5gL的可溶性淀粉溶液和0•5mL实施例3制备的裂殖壶菌WZYU003菌株发酵制备的粗酶液混合，分别在30°：、35°：、40°：、45°：、50°：、55°：、60°：、65°：、70°〇、75°：、80°：、85°：、90°：和100°：条件下保温3〇min，加入DNS煮沸显色，各温度梯度以煮沸失活的酶液作为阴性对照，以60°C体系的酶活力作为100%，从而计算出各体系的相对活力见图4。结果显示该酶的最适温度是60°C，在40-100°C范围内，仍保存最佳活力的60%以上。[0051]将实施例3制备的裂殖壶菌WZYU003菌株发酵制备的粗酶液在55°C、60°C、70°C、80°C和100°C下分别水浴0、10、30、40、50、60、90和120min，使用DNS法测定淀粉酶活性。以未经温度处理的粗酶液活性作为100%，通过计算其它条件下的相对活性评估该酶的热稳定性。结果显示该酶在最佳温度60°C下保温120min，仍能保留9〇%以上的活性;而在l〇TC下保温120min，该酶活力仍能够保留80%以上见图5。

权利要求：1.裂殖壶菌Aurantiochytriumsp•WZYU003，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCCN0:M2016618,保藏日期为:2〇ie年11月7日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。2.—种利用权利要求1所述裂殖壶菌WZYU003生产淀粉酶的方法，其特征在于所述方法为:将裂殖壶菌WZYU003接种至发酵培养基中，在2〇_35°C下，50_6〇Orpm振荡培养，得到发酵液，将发酵液离心，弃细胞沉淀，得到含淀粉酶的粗酶液，将粗酶液分离纯化，获得淀粉酶；所述发酵培养基组成为：葡萄糖20_120gL，酵母粉10-60gL，蛋白胨0-20gL，海盐20gL，溶剂为水，pH值自然。3.如权利要求2所述利用裂殖壶菌WZYU003生产淀粉酶的方法，其特征在于所述裂殖壶菌WZYU003接种前先进行平板活化和种子扩大培养：（1平板活化:将裂殖壶菌WZYU003接种于平板培养基，30°C下培养2-3天，获得平板菌体;所述平板培养基组成为:葡萄糖20gL，酵母粉l〇gL，蛋白胨5gL，海盐20gL，琼脂20gL，溶剂为水，pH值自然；（2种子培养:将平板菌体接入含l〇〇mL种子培养基的500mL三角瓶中，在3〇°C下，2〇Orpm震荡培养1-2天，得到种子液;所述种子培养基组成为:葡萄糖6〇gL，酵母粉10gL，蛋白胨5gL，海盐2〇gL，溶剂为水，pH值自然。4.如权利要求3所述利用裂殖壶菌WZYU003生产淀粉酶的方法，其特征在于所述发酵液按如下方法制备:将种子液接入含发酵培养基的发酵罐中，在2〇-35°C下，转速5〇-6〇Orpm，通气量20-100Lmin，溶氧量10-60%的条件下，培养时间1-6天，获得发酵液。5.如权利要求3所述利用裂殖壶菌WZYU003生产淀粉酶的方法，其特征在于所述种子液以体积浓度的1%-20%的接种量接种至发酵培养基。6.如权利要求4所述利用裂殖壶菌WZYU003生产淀粉酶的方法，其特征在于发酵培养条件为:温度25-32°C，转速100-400rpm，通气量2〇_8〇Lmin，溶氧量2〇_5〇%，培养时间3-5天。7.如权利要求2所述利用裂殖壶菌WZYU003生产淀粉酶的方法，其特征在于述发酵液离心条件为：5000rpm，4°C下离心5min。8.如权利要求2所述利用裂殖壶菌WZYU003生产淀粉酶的方法，其特征在于所述发酵培养基组成为:葡萄糖1〇〇gL，酵母粉2〇gL，蛋白胨5gL，海盐2〇gL，溶剂为水，pH值自然。

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