申请/专利权人：四川大学华西医院

申请日：2017-01-13

公开（公告）日：2020-06-16

公开（公告）号：CN106749612B

主分类号：C07K14/575(20060101)

分类号：C07K14/575(20060101);C12N15/16(20060101);A61K38/22(20060101);A61P31/00(20060101);A61P31/04(20060101)

优先权：["20161014 CN 2016108981989"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.06.16#授权;2017.06.23#实质审查的生效;2017.05.31#公开

摘要：本发明属于生物医药领域，涉及来源于中介素Intermedin,IMD；又名Adrenomedullin2，ADM2的一种多肽片段，具体为长度为40个氨基酸的成熟肽IMD108‑147。我们的研究发现，中介素前体肽以及这3种剪切后的成熟肽，可减轻脓毒症sepsis引起的细胞因子风暴，并且对血管内皮屏障具有保护作用，可减轻组织水肿和器官损伤，能够有效降低脓毒症的死亡率。本发明所涉及的IMD108‑147，有可能作为多肽药物应用于临床脓毒症的预防和治疗，具有很好的应用前景。

主权项：1.氨基酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的多肽、编码氨基酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的多肽的基因、含有编码氨基酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的多肽的基因的基因载体或含有编码氨基酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的多肽的基因的基因载体的宿主细胞在制备预防和治疗脓毒症的药物中的用途。

全文数据：中介素相关多肽及其在脓毒症预防和治疗中的用途技术领域[0001]本发明属于生物医药领域，涉及一种来源于中介素（Interniedin，IMD;又名Adrenomedul1in2，ADM2的多肽及其在脓毒症预防和治疗中的用途。背景技术[0002]脓毒症sepsis，其英语单词来源于希腊语“sepo”億为“腐烂”）⑴，其定义为感染引起的全身炎性反应综合征（systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS2〇脓毒症也临床I⑶患者中最常见的危重症2-4。脓毒症的总体发病率约为0.3%，全球每年发生的例数约1800万，我国据推算不少于400万例年，且发病率以每年1.5%的速度继续增长。有数据显示，美国在过去30年内，临床ICU患者的脓毒症发病率从8.7%上升到了30%，每年有21.5万人死于脓毒症及其后续并发症，其医疗费用超过200亿美元4。脓毒症若不及时治疗，可进一步发展为严重脓毒症severesepsis，即sepsis合并多器官功能障碍综合征multipleorgandysfunctionsyndrome,MODS，或经过充分容量复苏后仍然持续的低血压状态和组织灌注不足，即进展为脓毒症休克septicshock，最终导致患者死亡5，6〇[0003]2008年的拯救脓毒症运动（survivingsepsiscampaign，SSC提出了早期目标导向性治疗earlygoal-directedtherapy，EGDT的理念7JGDT的核心是确诊感染和控制控制，血流动力学的复苏以及组织氧供氧需平衡的恢复。据此将脓毒症的治疗归纳为以下四个方面:控制感染，血流动力学的稳定和支持治疗，代谢内分泌的支持治疗，以及其他支持治疗8。然而，虽然抗感染治疗和器官功能支持技术的不断进步使得sepsis的预后有一定改善，但其临床死亡率仍然超过30%5,9。其主要原因之一是除了抗感染和对症支持治疗外，缺少特异性针对脓毒症的治疗性药物。因此，亟需对脓毒症发生的机制进行更深入的研究，并寻找更有效治疗手段。[0004]在很长一段时间内，研究者都认为sepsis代表了一类由感染性病原体引起的超出机体控制的恶性炎性反应，主要特征为“细胞因子风暴cytokinestorm”，即机体免疫系统为应对侵入机体的病原体在短时间内产生大量的细胞和炎症因子，包括肿瘤坏死因子-aTNF-a、白介素-1IL-1、白介素-6IL_6、白介素_12IL-12、干扰素-aIFN-a、干扰素-PIFN_®、干扰素-yIFN-y、单核细胞趋化蛋白-1MCP-1等（10-13。细胞因子风暴被认为是一种超出机体控制的免疫反应，破坏了机体的正常生理机制，对机体造成的二次炎性损伤往往超过引起疾病本身的病原体14，15。因此，到目前为止，针对脓毒症的治疗研宄和药物开发，主要集中于抗细胞因子和炎症因子方面。然而，数十年来以抗炎治疗为主的临床研究，包括皮质类固醇疗法（16、TNF_a拮抗剂（17、IL-1受体抑制剂（18及其他抗炎症反应级联效应物的药物（19，以及针对引发炎性反应的细菌内毒素的抗内毒素抗体2〇，21等，均未能有效提高脓毒症病人的生存率（12，22。重组人活化蛋白CactivatedproteinC，APC是首个在临床试验中发现对脓毒症治疗有效的抗炎类药物幻，24，也是唯一通过临床III期实验的抗脓毒症药物。然而，由于在更大样本的多中心临床随机对照研宄中未能证实APC可有效提高脓毒症患者生存率，最终在2013年从市场被撤回（25。也就是说，虽然己经过数十年的研宄，目前除抗感染和对症支持治疗外，仍未能开发出一种特异性针对脓毒症的治疗性药物6,22,26。这引发了人们对以抗炎症因子为主的研究方案的质疑，也提示了目前对脓毒症发病机制的理解仍存在许多不足。[0005]近年来研究发现，除感染和全身炎性反应外，血管和内皮细胞功能也是影响脓毒症疾病进程的关键因素27，28。脓毒症最重要的病理改变之一就是内皮屏障破坏引起血管通透性增高，导致炎性渗出增加和组织水肿27。在脓毒症发生过程中，细胞因子风暴首要的攻击对象就是血管内皮屏障（endothelialbarrieroVE-cadherinVEC是形成血管内皮屏障的关键分子，机体分泌的主要炎症介质TNF-a和血管因子VEGF等可促使VEC分子之间相互解呙，导致内皮细胞连接endothelialjunction松解，引起血管内皮屏障破坏和血管通透性增高29，使细胞因子和炎症因子更易透过细胞膜;而全身循环系统处于高凝状态，机体分泌的主要促凝血因子之一凝血酶thrombin也可诱导血管通透性增加30。这样，炎性介质和促凝血因子的释放引起了血管通透性增高，导致液体渗出、血容量降低和组织水肿，反过来又进一步加重了机体损伤（15。由于血管内皮屏障破坏是导致脓毒症进一步恶化的关键因素，因此保护血管内皮、改善微循环状态就成为了抗脓毒症的一个可能的治疗策略。[0006]中介素（intermedin，IMD是2004年发现的一种内源性多肽，隶属于降钙素基因相关肽家族（calcitoningenerelatedpeptide,CGRP，该家族包括降轉素（calcitonin,CT、前降耗素pro_calcitonin，PCT、胰淀粉酶amylin、降轉素基因相关肽CGRP以及肾上腺髓质素adrenomedullin，ADM等，是一类在体内广泛表达、具有多种生物学活性的内源性激素样肽31-33。研宄发现，顶D在垂体、下丘脑、心、肺、肾、乳腺、胰腺、卵巢、胃、大肠、小肠、唾液腺、下颌腺、结缔组织、淋巴样组织内均有表达，从其分布的广泛程度来看，IMD很可能具有重要的生物学活性31-33。从2004年被发现开始，对IMD的研究主要集中在对心肌的直接作用正性34或负性35,36肌力作用）、对肾脏的保护作用促进肾血管灌流和尿钠排泄等作用37,38、抗氧化应激作用39-42、以及对心、肾缺血再灌注损伤的保护作用43-4f5等方面。近年来的研宄还发现，MD具有调控新生血管形成，维持微血管内皮屏障的完整性、减轻血管渗漏等作用（46-49。重要的是，顶D能够调控VEGF和VEC这两个影响内皮屏障和血管通透性的关键分子的活性，提示IMD可能在脓毒症发生发展过程中起重要作用。[0007]目前，本领域还很缺乏在脓毒症发生发展过程有良好预防或者治疗作用的药物，这是长期以来困扰本领域的技术难题。发明内容[0008]本发明要解决的技术问题是为脓毒症的预防和治疗提供一种新的手段。本发明解决技术问题的技术方案是提供了一种多肽。该多肽的的氨基酸序列如下式所示：[0009]VGCVLGTCQVQNLSHRLWQLX1X2PX3GRX4DSAPVDPSSPHSY，其中的X1=M或V或I;X2=G或R;X3=A或S或N;X4=Q或R或E或D。[0010]其中，上述多肽的两个C残基之间形成二硫键。[0011]进一步的，上述多肽的碳端酪氨酸进行了a位酰胺化修饰。[0012]更进一步的，上述氨基酸多肽的序列如SEQIDNo.l、SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示。[0013]本发明还提供了编码上述多肽的基因。[0014]本发明也提供了含有上述的基因的载体。所述载体可为质粒载体、病毒载体等本领域常用基因载体。[0015]本发明还提供了含有上述基因载体的宿主细胞。[0016]同时，本发明还提供了上述的多肽、基因、基因载体或宿主细胞在制备预防或治疗脓毒症的药物中的用途。[0017]其中，上述的脓毒症为脓毒症的急性炎性反应综合征（SIRS、单纯脓毒症sepsis、重症脓毒症severesepsis或脓毒症休克septicshock中的至少一种。[0018]在此基础上，本发明还提供了一种预防或治疗脓毒症的药物。该药物是由上述的多肽、核基因、基因载体或宿主细胞添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。[0019]其中，上述的脓毒症为包括脓毒症的急性炎性反应综合征（SIRS、单纯脓毒症sepsis、重症脓毒症severesepsis或脓毒症休克septicshock中的至少一种。[0020]各种脓毒症的简要划分或诊断标准:单纯脓毒症S印sis=SIRS+确诊感染;重症脓毒症（severesepsis=单纯脓毒症（Sepsis+—个或多个器官功能衰竭;脓毒症休克septicshock=单纯脓毒症Sepsis+休克。[0021]进一步的，上述的药物的剂型为注射剂。[0022]本发明的有益效果在于:本发明创造性提供了一种IMD相关多肽，该多肽氨基酸序列更短，但是实验证明能在脓毒症进展过程中有效保护血管内皮屏障、减轻液体渗漏和组织水肿、显著减轻脓毒症小鼠血清中TNF-a、IL_lP、IL-6和MCP等主要炎症因子的水平、从而对机体产生明显的保护作用，注射该多肽可显著改善脓毒症小鼠的生存率和生存时间。而对该頂D相关多肽进行酰胺化修饰，则能得到更好疗效。综合看来，本发明所涉及的IMD相关多肽，在脓毒症预防和治疗方面具有很好的应用前景。附图说明[0023]图1、展示人、小鼠和大鼠IMD1-53，IMD1_47和IMD1-40等多肽的异同。[0024]图2、有无二硫键对IMD1-53和IMD1-47的降血压作用的影响实验结果。[0025]图3、IMD1-40与IMD1-47、IMD1_53对颈动脉血压的影响实验结果[0026]图4、体内血管渗漏实验。表明MD1-40与IMD1-47、IMD1_53相比，其血管保护作用更强。[0027]图5、IMD1-40与IMD卜31对颈动脉血压的影响实验结果。[0028]图6、顶D1-40与IMD卜31及体内血管渗漏实验结果。[0029]图7、nffil-40对脓毒症短期生存模型小鼠的保护实验结果。[0030]图8、C末端酰胺化的MD1-40的血管保护实验结果。[0031]图9、C末端酰胺化的頂D1-40对脓毒症短期生存模型小鼠的保护实验结果，表明能减轻细胞因子风暴。[0032]图l〇、C末端酰胺化的MD1-40对脓毒症长期生存模型小鼠的保护实验结果。[0033]图11、顶D1-40在使用野生型或頂D敲除鼠建立的脓毒症模型中保护实验结果。具体实施方式[0034]以下结合附图通过具体实施方式的描述以详细说明但不限制本发明。[0035]本发明创造性提供了一种IMD相关多肽IMD1-40,来自于中介素（英文名Intermedin，IMD;或Adrenomedullin2，ADM2;是一种内源性|丐调素家族多肽），该多肽全长包括信号肽为147个氨基酸，頂D1-40为其剪切后多肽片段，为第10S到第147个氨基酸。本发明研究了人、小鼠和大鼠IMD1-53，IMD卜47和IMH-40这些多肽的异同渗见图1。其中IMD1-53为第95到第147个氨基酸的肽段，IMD1-47为第101到第147个氨基酸的肽段，IMD1-40为第108到第147个氨基酸的肽段。[0036]如图1所示，在IMD多肽的羧基末端C端），有13个氨基酸（图1中下划线标注部分）在人、小鼠、大鼠间的跨物种比较中完全相同。本发明通过研宄发现，这段序列与IMD和受体CRLR之间的结合有关键作用，去掉这段序列，MD多肽既不能与CRLR结合、也无降血压等生物学活性。在前期研宄中发现使用针对这13个氨基酸序列的单克隆抗体，可对人和小鼠这两个物种的IMD多肽均产生抗原抗体结合反应，同时不与IMD的另一家族成员ADMadrenomedullin产生交叉反应。因此，本发明认为这段序列与IMD的受体结合能力密切相关。并且这一段序列在各物种间极为保守，因此如要制备具有生物学活性的MD多肽，那么这13个氨基酸必须保留。[0037]而从N端开始第13位到第29位之间（本发明中均是以人类IMD1-53片段序列的氨基端为基准定义各个氨基酸的序号的22个氨基酸斜体标注则也为高度保守序列，在人、小鼠、大鼠之间完全相同。我们还发现，在这段保守序列中，在第15位和第20位的两个半胱氨酸之间形成一个二硫键，该二硫键可将頂D多肽变为环肽。本发明的研究表明，这个二级结构与MD的生物学功能可能更为关键:在頂D1-53和IMD1-47的一级结构氨基酸序列保持不变，但如果没有第15位和第20位半胱氨酸之间的二硫键，则这两条多肽均无生物学活性参见图2。[0038]本发明通过进一步的分析发现，由于第12位存在精氨酸会形成侧链，因此IMD1-53和頂D1-47的侧链长度不同，我们猜测这种差异可能会影响这两条多肽的活性。我们大胆假设，只要包含第15位和第20位之间的二硫键这个结构，IMD即能形成环肽并具有生物学活性。因此，我们进一步将多肽缩短，去掉了第12位的精氨酸，将IMD多肽进一步缩短为仅有40个氨基酸的IMD1-40。我们在实验中发现，IMD1-40虽然不含第I2位的精氨酸，但具有与IMD1-53和IMD1-47类似的心血管活性，即静脉注射后血压短暂下降、在2min后达到峰值，之后血压缓慢回升（图3。同时，IMD1-40的作用还更加稳定，在皮下注射时，对TNF-a诱导的血管渗漏也具有更好和更持久的保护作用（图4。[0039]但是，如果将頂D1-40进一步截短，去掉第I5位和第2〇位之间的二硫键的结构，可得到一个更短的多肽顶D1-31为頂D全长肽的第137到第147个氨基酸）。我们发现，不仅仅不具有頂D的心血管保护活性，甚至具有相反的作用（图5。我们分析认为这可能是因为IMD1-31包含C末端13个氨基酸的保守序列、因此具有与受体CRLR结合的能力，但无第15至第20位之间的二硫键空间结构，因此无心血管保护活性，反而与正常的BTO多肽互为竞争配体，因此类似于IMD的竞争性拮抗剂。进一步的，本发明通过血管渗漏实验实验发现，IMD1-31确实可以阻断IMD1-40的保护血管内皮屏障的作用（图6;在脓毒症的治疗实验中也发现，IMD1-40可显著提升脓毒症小鼠的生存率，但IMD1-31反而使脓毒症的生存情况恶化图7。[0040]本发明的更进一步的研究还发现，在合成多肽时将最后一位酪氨酸做a位酰胺化，可进显著IMD多肽增强保护血管内皮屏障（参见图8和减轻细胞因子风暴的作用（参见图9。[0041]上述研宄提示，IMD1-40可能是具有生物学活性的IMD多肽的最短形式，同时，由于不含第12位的精氨酸侧链，因此与IMD1-53和IMD1-47相比，具有更好的稳定性和功效，同时也最易合成，具有较好的实用性。我们在脓毒症的治疗实验中发现，在0.25mgkg的给药剂量下，IMD1-40对小鼠生存率的提升更明显，具有更好的治疗效果图10。[0042]随后，本发明使用IMD基因敲除鼠和正常野生型小鼠建立脓毒症模型，用IMD卜40进行治疗，并使用IMD1-31多肽则用做拮抗剂（IMDinh。结果显示:在IMD基因敲除的小鼠模型中，脓毒症导致肺和肾的血管渗漏程度加重，远端肾小管刷状缘上皮的破坏也加重;皮下注射IMD1-40多肽则可显著减轻脓毒症发生过程中肺和肾的渗漏程度，并减轻远端肾小管刷状缘上皮的破坏程度;而使用IMD1-31IMDinh则加重了肺和肾的损伤Fig.11。[0043]本发明由此提供了一系列具有共通结构的多肽，具有预防和治疗各阶段脓毒症作用。这些多肽的的氨基酸序列如下式所示：[0044]VGCVLGTCQVQNLSHRLWQLX1X2PX3GRX4DSAPVDPSSPHSY；[0045]其中的X1=M或V或I;X2=G或R;X3=A或S或N;X4=Q或R或E或D。上述多肽的两个C残基之间形成二硫键。[0046]具体的，上述多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.l、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示。[0047]为了获得更好的活性，在上述多肽的C端酪氨酸进行a位酰胺化修饰是一种经本发明证明可行的方案。[0048]显然，本领域技术人员在上述多肽序列的基础上，能够容易地得到编码上述多肽的基因、所述基因的载体以及含有上述基因载体的宿主细胞。所述载体可为质粒载体、病毒载体等本领域常用基因载体。[0049]本发明还上述的多肽、基因、基因载体或宿主细胞具有制备预防或治疗脓毒症的药物的用途。进一步的，上述的脓毒症为脓毒症的急性炎性反应综合征SIRS、单纯脓毒症sepsis、重症脓毒症severesepsis或脓毒症休克septicshock中的至少一种。[0050]显然，本领域技术人员能将上述的多肽、核基因、基因载体或宿主细胞添加药学上可接受的辅助性成分制备而成预防或治疗脓毒症的药物。其中，上述的脓毒症为包括脓毒症的急性炎性反应综合征SIRS、单纯脓毒症sepsis、重症脓毒症severesepsis或脓毒症休克septicshock中的至少一种。进一步的，上述的药物的剂型可为注射剂等各种常规剂型。[0051]本领域一般对脓毒症有一个简要划分或诊断标准:单纯脓毒症Sepsis=SIRS+确诊感染；重症脓毒症（severesepsis=单纯脓毒症（Sepsis+—个或多个器官功能衰竭;脓毒症休克septicshock=单纯脓毒症Sepsis+休克。本发明药物就其表现的作用来看，是能用于上述各个脓毒症的预防或治疗中并取得好的效果的。[0052]以下通过实施例对本发明进行更进一步的说明。[0053]实施例一有无二硫键对頂D1-53和顶D1-47的降血压作用的影响[0054]分别合成人类IMD1-53和IMD1-47,同时合成未二硫键化的IMDl-53No.DB和顶Dl-47No.DB多肽本发明各实施例使用的多肽均委托上海闪晶生物公司合成并验证正确。若无特殊说明，除IMD1-31外，均有二硫键，以下同）。将6-8周龄Balbc小鼠麻醉后，经颈动脉插管、连接生理多导仪检测小鼠动脉血压。从颈静脉分别注射1101-53、川01-47、11^1-53No•DB、IMD1-47No•DB，剂量均为0•5mgkg。可见IMD1-53和IMD1-47具有显著的瞬时降血压作用，其作用在注射1〜2min后达到峰值，此后血压缓慢恢复至基线；而不含二硫键的IMD1-53No.DB和IMD1-47No.DB多肽未见降血压作用。该结果提示若没有第15位和第20位半胱氨酸之间的二硫键，则IMD多肽不具备生物学活性。从上结果，我们合理推断IMD1-40也需要有这半胱氨酸之间的二硫键，否则无法保持其生物学活性。[0055]实施例二IMD1-40与IMD1-47、IMD1-53对颈动脉血压的影响实验[0056]分别合成人类IMDl-40、IMDl-47及IMD1-53多肽（多肽均合成第10和第15位半胱氨酸之间的二硫键）。将6-8周龄Balbc小鼠麻醉后（每组5只），经颈动脉插管、连接生理多导仪，动态监测小鼠动脉血压。经尾静脉推注0.5mgkgIMD多肽稀释在100U1生理盐水中），结果显示：IMDl-40在瞬时降低血压方面与IMD1-47和IMD1-53有类似的活性，活性略强。[0057]实施例三用体内血管渗漏实验考察IMD1-40与IMD1-47、IMD1-53的血管保护活性[0058]行Miles实验体内血管渗漏实验）：6_8周龄Balbc小鼠分别皮下注射实施例二所述的人类IMD1-53、IMD1_47及IMD1-40多肽0.5mgkg，同时经尾静脉注射伊文思蓝染料。在注射IMD多肽0.5h或2h后，分别皮下注射20ngTNF-a，以诱导局部皮肤血管渗漏；在注射TNF-a〇.5h后，以注射点为圆心手术切取直径8mm左右皮肤组织，将其置入福尔马林液中，56°C过夜，最后测试其吸光度。每只小鼠取2块皮肤组织，每组5只小鼠。[0059]实验结果显示参见图4:IMDl-40与頂Dl-53、nffil-47多肽相比，其抑制血管渗漏作用明显更强，并且在2h以后仍然还保持更强的血管保护活性。[0060]实施例四IMD1-40与MD1-31对颈动脉血压的影响实验及体内血管渗漏实验[0061]按实施例二相同的实验条件，进行IMD1-40多肽与IMD1-31多肽对颈动脉血压的影响实验。其中使用的MD1-31多肽由于不具有两个半胱氨酸残基，因此没有二硫键。[0062]实验结果见图5,可见IMD1-31多肽与IMD1-40多肽具有相反的作用，静脉注射顶D1-31多肽反而导致瞬时血压升高，而頂D1-40多肽则会使血压明显下降。[0063]此外还按实施例三方法用MD1-31与IMD1-40进行了Miles实验（体内血管渗漏实5佥），结果见图6,结果表明IMD1-31可作为拮抗剂，阻断MD1-40抑制血管渗漏的作用。[0064]实施例五IMD1-40对脓毒症短期生存模型小鼠的保护实验[0065]用6-8周龄Balbc小鼠行盲肠结扎穿孔CLP手术，建立脓毒症小鼠短期生存模型：用戊巴比妥钠麻醉小鼠后，打开腹腔，暴露盲肠，从盲肠末端至回盲部方向〇.75cm处结扎，结扎后用18-Ggauge针头穿通两次，造成盲肠内容物泄漏，分为三组，一组为CLP组（10只）；一组为皮下注射IMD1-40组（10只），皮下注射多肽〇.5mgkg只，手术后半小时注射;此后每天注射以相同剂量注射一次）；一组为皮下注射IMD1-31组（10只），皮下注射lmgkg只，手术后半小时注射;此后每天注射以相同剂量注射一次）。而另取5只小鼠打开腹腔，分离暴露盲肠，但不进行结扎穿孔操作，直接缝合皮肤，作为对照Sham假手术组）。在此短期生存模型中，不使用补液和抗生素等支持治疗。[0066]结果显示（参见图7:单纯CLP手术组（10只）的小鼠从术后20h左右开始死亡，在5〇h后全部死亡；皮下注射頂D1-40组（10只）可显著改善小鼠生存，到50h中止观察时，仍有约40%小鼠存活;而皮下注射IMD卜31组（10只）则使小鼠生存情况显著恶化，在24h内小鼠即全部死亡。[0067]实施例六C末端酰胺化的IMD1-40的血管保护作用[0068]行Miles实验体内血管渗漏实验）：6-8周龄Balbc小鼠皮下注射有C末端酰胺化的IMD1-40NH2，或C末端无酰胺化的IMD1-40N〇-NH2，分组为4组：1组为对照;2组为单独使用TNF;3组为TNF+IMD1-40NH2;4组为TNF+頂Dl-40N〇-NH2剂量均为0.5mgkg，同时经尾静脉注射伊文思蓝染料。0.5h后，皮下注射20ngTNF-a，以注射点为圆心手术切取直径8mm左右皮肤组织，将其置入福尔马林液中，560C过夜，最后测试其吸光度。每只小鼠取2块皮肤组织，每组5只小鼠。[0069]实验结果显示参见图8:C末端酰胺化的MD1-40与无酰胺化的IMD1-40相比，其抑制血管渗漏作用明显更强。[0070]实施例七C末端酰胺化的頂D1-40对脓毒症短期生存模型小鼠的保护实验[0071]行盲肠结扎穿孔手术CLP:6_8周龄Balbc小鼠每组各6只，戊巴比妥钠麻醉，打开腹腔，暴露盲肠，从盲肠末端至回盲瓣方向结扎〇.75cm，用18-gauge针头穿通结扎后的盲肠2次;打开腹腔，分离暴露盲肠，但不进行结扎穿孔操作，直接缝合皮肤，作为对照Sham假手术组）；在CLP手术前lh注射頂D1-40NH2或IMD1-40N〇-NH2，皮下注射0.25mgkg只），在CLP手术后9h处死小鼠，收集小鼠血清，ELISA检测IL-lf^RTNF-a的血清水平。[0072]结果参见图9,结果表明：若MD1-40的C末端有酰胺化，其抑制细胞因子风暴的作用明显更强。[0073]实施例八C末端酰胺化的IMD1-40对脓毒症长期生存模型小鼠的保护实验[0074]行盲肠结扎穿孔手术CLP，建立脓毒症小鼠长期生存模型:6-8周龄Balbc小鼠，戊巴比妥钠麻醉，打开腹腔，暴露盲肠，从盲肠末端至回盲部方向0.5cm处结扎，结扎后用22-gauge针头仅穿通1次；C末端酰胺化的IMD1-53、IMD1-47、IMDl-40组（每组20只），0.25mgkg只；术后半小时皮下注射一次;此后每天注射一次。在此长期生存模型中，使用补液在手术完成后，皮下注射800ul生理盐水和抗生素（在手术完成后，肌肉注射环丙沙星Ciprofloxacin，20mgkg—次等支持治疗。长期生存模型用于更好的模拟临床脓毒症患者的疾病进展情况。[0075]治疗试验结果显示结果参见图10:单纯CLP组20只）小鼠在7天后约有25%仍然存活，与临床脓毒症休克患者约30°乂的生存率类似。IMD1-53多肽和IMD1-47多肽组的存活率类似，均为50%;而IMD卜40多肽组的存活率最高，到第7天结束观察时，约60%的小鼠仍然存活，差异显著。[0076]实施例九IMD1-40在使用野生型或IMD敲除鼠建立的脓毒症模型中保护作用[0077]分别使用6-8周龄的IMD基因敲除鼠和野生型小鼠，行盲肠结扎穿孔手术CLP，建立脓毒症小鼠长期模型模型。在CLP手术前lh分别给予IMD1-40羧基端有酰胺化或IMD1-31IMDinh羧基端酰胺化），在CLP手术9h后处死小鼠，取出肺、肾，石蜡包埋、切片，用HE染色检测肺和肾的渗漏情况，用PHA-E染色检测肾远端小管刷状缘的破坏情况。[0078]结果显示参见图11:在IMD敲除鼠行CLP手术，造成的肺、肾血管渗漏以及远端肾小管刷破坏的程度均显著高于野生型小鼠；使用nroi-40皮下注射，不管是在野生型或nro敲除鼠的脓毒症模型中，均能显著减轻肺、肾的血管渗漏和远端肾小管损伤;而使用MD1-31可进一步加重这些损伤。[0079]以上结果显示：頂D1-40多肽与IMD1-47多肽和MD1-53多肽相比较，其血管保护和抑制血管渗漏的作用更强，对脓毒症引起组织器官损伤具有更好的保护和修复作用，可更明显的提高生存率和生存时间，在脓毒症的预防和治疗方面具有很好的应用前景，而酰胺化的頂D1-40多肽效果更佳。[0080]参考文献：[0081]1.RussellJA.Managementofsepsis.TheNewEnglandjournalofmedicine2006;35516:1699-1713.[0082]2.LevyMM,FinkMP,MarshallJC,etal.2001SCCMESICMACCPATSSISInternationalSepsisDefinitionsConference.Criticalcaremedicine2003；314:1250-1256.[0083]3.BoneRC，BalkRA，CerraFB，etal.Definitionsforsepsisandorganfailureandguidelinesfortheuseofinnovativetherapiesinsepsis.TheACCPSCCMConsensusConferenceCommittee.AmericanCollegeofChestPhysiciansSocietyofCriticalCareMedicine.Chest1992；1016:1644-1655.[0084]4.GaieskiDF,EdwardsJM，KallanMJ，etal.BenchmarkingtheincidenceandmortalityofseveresepsisintheUnitedStates.Criticalcaremedicine2013；415:1167-1174.[0085]5.AntonelliM,BontenM,CecconiM,etal.YearinreviewinIntensiveCareMedicine2012.11:Pneumoniaandinfection,sepsis,coagulation,hemodynamics,cardiovascularandmicrocirculation,criticalcareorganization,imaging，ethicsandlegalissues.IntensiveCareMed2013;39⑶：345-364.[0086]6.RiedemannNC,GuoRF,WardPA.Novelstrategiesforthetreatmentofsepsis.NatMed2003；95:517-524.[0087]7.DellingerRP,LevyMM,CarletJM,etal.SurvivingSepsisCampaign:internationalguidelinesformanagementofseveresepsisandsepticshock:2008.Criticalcaremedicine2008；361:296-327.[0088]8.VincentJL.Clinicalsepsisandsepticshock--definition,diagnosisandmanagementprinciples.LangenbeckJsarchivesofsurgeryDeutscheGesellschaftfurChirurgie2008；3936:817-824.[0089]9.OpalSM,LaterrePF,FrancoisB,etal.Effectoferitoran,anantagonistofMD2-TLR4,onmortalityinpatientswithseveresepsis:theACCESSrandomizedtrial.Jama2013；30911:1154-1162.[0090]10.StoneR.Searchforsepsisdrugsgoesondespitepastfailures.Science1994；2645157:365-367.[0091]11.WarrenHS.Strategiesforthetreatmentofsepsis.NEnglJMed1997;33613:952-953.[0092]12.HotchkissRS,KarlIE.Thepathophysiologyandtreatmentofsepsis.TheNewEnglandjournalofmedicine2003;348⑵：138-150.[0093]13.ThomasL.Germs.NEnglJMed1972；28711:553-555.[0094]14.NathanC.Pointsofcontrolininflammation.Nature2002；4206917:846-852.[0095]15.LondonNR,ZhuW,BozzaFA,etal.TargetingRobo4-dependentSlitsignalingtosurvivethecytokinestorminsepsisandinfluenza.SciTranslMed2010；223:23ral9.[0096]16.BoneRC,FisherCJ,Jr.,ClemmerTP,etal.Acontrolledclinicaltrialofhigh-dosemethylprednisoloneinthetreatmentofseveresepsisandsepticshock.NEnglJMed1987;31711:653-658.[0097]17.FisherCJ,Jr.,AgostiJM,0palSM,etal.Treatmentofsepticshockwiththetumornecrosisfactorreceptor:Fcfusionprotein.TheSolubleTNFReceptorSepsisStudyGroup.NEnglJMed1996；33426:1697-1702.[0098]18.FisherCJ,Jr.,SlotmanGJ,0palSM,etal.Initialevaluationofhumanrecombinantinterleukin-1receptorantagonistinthetreatmentofsepsissyndrome:arandomized,open-label，placebo-controlledmulticentertrial.CritCareMed1994；221:12-21.[0099]19.BernardGR,ffheelerAP,RussellJA,etal.Theeffectsofibuprofenonthephysiologyandsurvivalofpatientswithsepsis.TheIbuprofeninSepsisStudyGroup.NEnglJMed1997；33613:912-918.[0100]20.ZieglerEJ，FisherCJ，Jr•，SprungCL,etal.TreatmentofgramnegativebacteremiaandsepticshockwithHA-1Ahumanmonoclonalantibodyagainstendotoxin.Arandomized,double-blind,placeb〇-controlledtrial.TheHA-1ASepsisStudyGroup.NEnglJMed1991;324⑺：429-436.[0101]21.WolffSM.Monoclonalantibodiesandthetreatmentofgram-negativebacteremiaandshock.NEnglJMed1991;324⑺：486-488.[0102]22.RiedemannNC,GuoRF,ffardPA.Theenigmaofsepsis.JClinInvest2003;112⑷：460-467.[0103]23.BernardGR,VincentJL,LaterrePF,etal.EfficacyandsafetyofrecombinanthumanactivatedproteinCforseveresepsis.NEnglJMed2001；34410:699-709.[0104]24.MatthayMA.Severesepsis—anewtreatmentwithbothanticoagulantandantiinflammatoryproperties.NEnglJMed2001；34410:759-762.[0105]25.OpalSM,DellingerRP,VincentJL,etal.Thenextgenerationofsepsisclinicaltrialdesigns:whatisnextafterthedemiseofrecombinanthumanactivatedproteinC.Criticalcaremedicine2014;427:1714-1721.[0106]26.LeeWL,SlutskyAS.Sepsisandendothelialpermeability.TheNewEnglandjournalofmedicine2010;363⑺：689-691.[0107]27.AirdWC.Theroleoftheendotheliuminseveresepsisandmultipleorgandysfunctionsyndrome.Blood2003；10110:3765-3777.[0108]28.GoodwinJE，FengY,VelazquezH，etal.Endothelialglucocorticoidreceptorisrequiredforprotectionagainstsepsis.ProcNatlAcadSciUSA2013；1101:306-311.[0109]29.GoldblumSE,DingX,Campbel1-WashingtonJ.TNF-alphainducesendothelialcellF-actindepolymerization,newactinsynthesis，andbarrierdysfunction.TheAmericanjournalofphysiology1993；2644Pt1:C894-905.[0110]30.RabietMJ，Plantier几，RivalY，etal.Thrombin-inducedincreas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权利要求：i.多肽，其特征在于具有如下式所示的氨基酸序列：VGCVLGTCQVQNLSHRLWQLX1X2PX3GRX4DSAPVDPSSPHSY，其中的X1=M或V或I;X2=G或R;乂3=4或8或1^乂4=〇或1^^或0。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于:两个C残基之间形成二硫键。3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于:碳端酪氨酸进行了a位酰胺化修饰。4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示。5.编码权利要求1〜5任一项所述多肽的基因。6.含有权利要求5所述基因的基因载体。7.含有权利要求6所述基因载体的宿主细胞。8.权利要求1〜4任一项所述的多肽、权利要求5所述基因、权利要求6所基因载体或权利要求7所述的宿主细胞在制备预防和治疗脓毒症的药物中的用途。9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于:所述脓毒症，为包括急性炎性反应综合征、单纯脓毒症、重症脓毒症或脓毒症休克中的至少一种。10.预防或治疗脓毒症的药物，其特征在于是由1〜4任一项所述的多肽、权利要求5所述基因、权利要求6所基因载体或权利要求7所述的宿主细胞添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。11.根据权利要求10所述的药物，其特征在于:所述的脓毒症为包括急性炎性反应综合征、单纯脓毒症、重症脓毒症或脓毒症休克中的至少一种。I2•根据权利要求10所述的药物，其特征在于:所述药物的剂型为注射剂。

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