申请/专利权人：浙江工业大学;浙江绿创生物科技有限公司

申请日：2018-08-10

公开（公告）日：2020-06-19

公开（公告）号：CN110055292B

主分类号：C12P13/22(20060101)

分类号：C12P13/22(20060101);C12P7/40(20060101);C12R1/88(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.06.19#授权;2019.08.20#实质审查的生效;2019.07.26#公开

摘要：本发明涉及一种丙酮酸和左旋多巴联产工艺与应用。采取如下的技术方案：1利用光滑球拟酵母发酵获得丙酮酸料液，料液经过陶瓷膜除菌，超滤膜除蛋白、核酸、色素等大分子；2根据丙酮酸的摩尔量向丙酮酸浓缩液加入一定量的邻苯二酚、醋酸铵、EDTA、亚硫酸钠等化合物，调pH7.0‑9.0，配制成酶催化底物溶液；3利用酪氨酸酚裂解酶基因工程菌发酵获得酪氨酸酚裂解酶菌液，离心收菌体，高压均质机破胞，离心，收集酶液；4酶液加入一定量的底物溶液，搅匀，25℃，密封震荡反应；所述底物溶液为丙酮酸浓缩液配制,通过流加底物溶液控制邻苯二酚的浓度0‑10gL，产物达到120gL以上，停止流加底物溶液，当反应液中邻苯二酚含量低于0.2gL，停止反应。

主权项：1.一种丙酮酸和左旋多巴联产工艺，其特征在于：1利用光滑球拟酵母发酵获得丙酮酸料液，料液经过陶瓷膜除菌，超滤膜除蛋白、核酸、色素，得到丙酮酸粗提物水溶液；2根据步骤1中丙酮酸粗提物水溶液的摩尔浓度进行稀释，并继续加入一定量的邻苯二酚、醋酸铵、EDTA、亚硫酸钠，调pH，配制成酶催化底物溶液，根据步骤1中丙酮酸粗提物水溶液的摩尔浓度加入一定量的邻苯二酚，配制成补料溶液；3利用酪氨酸酚裂解酶基因工程菌发酵获得酪氨酸酚裂解酶菌液，离心收菌体，高压均质机破胞，离心，收集酶液；4在步骤3得到的酶液10-100g中加入步骤2配制的酶催化底物溶液0.5L，加三磷酸吡哆醛至100mgL，搅匀，25℃，密封震荡反应；随着反应进行流加入步骤2配制的补料溶液控制邻苯二酚的浓度0-10gL，产物达到120gL以上，停止流加补料溶液并继续反应，当反应液中邻苯二酚含量低于0.2gL，停止反应，此时L-多巴浓度累积至130gL以上；反应料液用稀硫酸或稀盐酸酸化溶解晶体，再离心除菌体，离心上清滴加稀氨水析晶，离心收集晶体，粗晶进行酸溶碱析重结晶，重结晶一次获得产品；所述步骤1中选用的发酵培养基为：10％葡萄糖、0.1％大豆蛋白胨、0.6％NH42SO4、0.1％KH2PO4、0.05％MgSO4·7H2O、8mgL烟酸、1mgL吡哆醛、20μgL生物素、20μgL硫胺素和4％CaCO3、pH5.5；步骤1中发酵罐发酵过程如下：添加15％的葡萄糖，不添加CaCO3，其他成分与发酵培养基相同，用5MNaOH调节pH5.5，转速为500，通氧量1：1，不控制溶氧，在相应温度的条件下进行发酵，培养50-72h，丙酮酸达到75gL以上，产物不再增加，停止发酵；步骤2中配制成催化底物溶液的具体过程如下：将步骤1中得到的丙酮酸粗提物水溶液稀释至含丙酮酸12gL、再加入10gL的邻苯二酚、60gL的醋酸铵、2gL的亚硫酸钠、1gL的EDTA，调pH8.0；步骤2中配制补料溶液的具体过程如下：将步骤1中得到的丙酮酸粗提物水溶液反渗透膜浓缩至120gL，加入邻苯二酚至120gL。

全文数据：一种丙酮酸和左旋多巴联产工艺与应用技术领域本发明涉及一种丙酮酸和左旋多巴联产工艺与应用，属于发酵与酶催化工艺领域。背景技术左旋多巴3,4-dihydroxyphenyl-L-ananine，简称L-DOPA的化学名称为3,4-二羟基苯基丙氨酸，其结构式为：作为一种重要的生物活性物质，L-DOPA是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。上世纪60年代，国外许多学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。为了提高L-DOPA产量和底物转化率，研究者们对微生物酶法合成L-DOPA的工艺方法进行了大量研究。酪氨酸酚裂解酶Tyrosinephenollyase，TPL，E.C.4.1.99.2，又名β-酪氨酸酶，该酶分子量约200kDa，是一个四聚体酶。TPL酶以磷酸吡哆醛pyridoxal-phosphate，PLP为辅酶，以钾离子和氨离子为辅助因子，TPL可以催化L-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个反应是可逆的，将邻苯二酚代替苯酚后，可由邻苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-DOPA。左旋多巴的前体在较高浓度时对酶活都有抑制作用，其中邻苯二酚及丙酮酸除了有强抑制作用外，还会导致酶的不可逆失活，反应条件难以控制，副产物多，L-DOPA的产率低。印度R.KrishnaveniVandanaRathod等人利用真菌Acremoniumrutilum转化L-酪氨酸至L-多巴，酪氨酸酶比活达1095Umg。但目前产能较低，只有0.89gL。巴基斯坦Ikram-Ul-Haq等人对产酪氨酸酶的Aspergillusoryzae进行紫外诱变，诱变株最大产量达1.28gL。埃及DoaaA.R.Mahmoud·MagdaA.ElBendary利用Egyptianhalophilicblackyeast的酪氨酸酶转化生成L-DOPA，产量为66μgml。韩国研究人员使用酪氨酸酶进行转化时，利用电取代还原试剂，将多巴醌DOPAquinone还原为L-多巴，使转化率达95.9，生产强度47.27mgL*h。也有一些利用自然界中的细菌，如Escherichia、Proteus变形菌属、Stizolobiumhassjoo和Erwinia欧文氏菌属等，来合成L-DOPA，如左旋多巴酶法合成综述报道，TPL大肠杆菌基因工程菌转化30h，转化生成29.6gL的L-DOPA。又如，Jang-YoungLee等人克隆来源于EscherichiacoliWATCC11105的对羟基苯乙酸-3-羟基化酶p-hydroxyphenylacetate3-hydroxylase，PHAH，转化L-酪氨酸为L-DOPA，产物累积至10gL。研究者发现这些重组菌株虽然TPL的表达量高于野生菌株，但最终的L-DOPA合成能力却没有明显提高甚至低于野生菌株。这可能因为要获得较高的L-DOPA合成能力，菌株除了具备TPL高活性外，还要有相对完善的底物、产物出入细胞膜的转运机制以及对底物邻苯二酚抑制酶活的耐受力等。总体来说，反应条件难以控制，稳定性差，副产物多，L-DOPA的产率低。丙酮酸Pyruvicacid，又称2-氧代丙酸2-oxopropanoicacid、α-酮基丙酸α-ketopropionicacid。丙酮酸是最重要的有机酸之一，在制药、食品、化工、农用化学品等领域以及科学研究中都具有广泛的用途。丙酮酸在医药工业上用于合成治疗高血压的新药血管紧张肽Ⅱ、系列蛋白酶抑制剂、镇静剂、消炎镇痛药辛可芬、药物磷酸烯醇丙酮酸、4-甲唑甲酸、抗结核药异烟肼丙酮酸钙、解热药2-苯基喹啉-4-羧酸以及噻咪唑药物等。丙酮酸是在人体内三羧酸循环和合成氨基酸及其糖类中重要的中间体，研究人员发现，外界补充丙酮酸，能够通过刺激线粒体加速TCA循环,从而加速脂肪消耗以达到减肥的目的，使脂肪代谢率达到48％，同时可以减少因低脂肪饮食造成的蛋白质流失，对人体安全性非常高，近年来，发达国家利用丙酮酸这一特性，及其钙盐作为减肥保健类药品。丙酮酸的工业生产方法主要有化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。化学合成法：1977年日本研究所首次实现了以酒石酸为原料化学合成法生产丙酮酸的工业化，在液相或气相中将酒石酸或乳酸酯氧化为丙酮酸酯，水解成丙酮酸，但该方法污染重，成本高，缺乏竞争力。酶转化法：利用微生物细胞中的酶系将乳酸等脱氢氧化为丙酮酸，CarstenSchinsche和HelmutSimon研究发现变形杆菌属中的Proteusvulgaris和Proteusmirabilis能有效水解R-乳酸,产生丙酮酸；PingXu等人也从土壤中筛得一株属于Edwardisellatardabiogroup1的菌株KY6,可转化DL-乳酸为丙酮酸。DariushHek-mat等人采用酶膜反应器,利用Proteusvulgaris的细胞粗提物转化乳酸为丙酮酸，该方法转化率高、但底物成本高，没有实现工业化生产。微生物发酵法：自20世纪50年代以来，人们开始探索并利用生物发酵法生产丙酮酸。研究的微生物主要包括酵母、担子菌、放线菌和细菌等。日本学者经近四十多年的研究选育出了丙酮酸的高产菌株，并于1989年实现了工业化的发酵生产，发酵产酸水平最高达67.8gL，转化率0.494gg。发酵法的优势在于可以利用可持续的、低成本的葡萄糖作为底物，可以得到高的产量和产率，对环境友好，并且可以避免一些副产物，例如来自酶法反应所产生的H2O2等，是一条极具发展前景的工业生产丙酮酸的方法。目前，我国许多科研人员也在积极的研究用发酵法生产丙酮酸，积累了许多丰富的研究成果。李寅、陈坚等人曾报道过选育出了一株光滑球拟酵母TorulopsisglabrataWSH-IP303，于2.5L发酵罐中分批发酵，56h，丙酮酸的产量和转化率分别可达到69.4gL和0.636gg；该菌株在5L发酵罐上分批发酵，56h，可产丙酮酸达77.8gL，葡萄糖的转化率为0.651gg；许庆龙、刘立明等人又利用光滑球拟酵母TorulopsisglabrataCCTCCM202019，采用葡萄糖流加工艺在7L发酵罐中进行发酵，发酵83h，丙酮酸的产量和转化率分别达到83.1gL和0.621gg；天津科技大学的高年发等选育的高产丙酮酸菌TorulopsisglabrataTP19，在5L发酵罐上发酵48h丙酮酸最高产量为65.1gL，转化率为58.6％，生产强度为1.35gLh；高年发等随后又选育了光滑球拟酵母TorulopsisglabrataTP204，在5L发酵罐中丙酮酸的产量可达到71.23gL；中国微生物研究所的江宁、王钦宏等人选育了光滑球拟酵母TorulopsisglabrataIFO005-36，在5L发酵罐中发酵52h丙酮酸产量可达到82.2gL。以上均为我国目前在该领域研究的利用发酵法生产丙酮酸的较高水平。发明内容本发明的目的是发酵生产丙酮酸与酶催化生产左旋多巴进行联产。丙酮酸初步纯化后，被用于酪氨酸酚裂解酶催化生产左旋多巴，降低了生产左旋多巴成本。为此，本发明采取如下的技术方案：1利用光滑球拟酵母发酵获得丙酮酸料液，料液经过陶瓷膜除菌，超滤膜除蛋白、核酸、色素等大分子，滤液进行浓缩至丙酮酸浓度为150-300gL；2根据丙酮酸的摩尔量向丙酮酸浓缩液加入一定量的邻苯二酚、醋酸铵、EDTA、亚硫酸钠等化合物，调pH7.0-9.0，配制成酶催化底物溶液；3利用酪氨酸酚裂解酶基因工程菌发酵获得酪氨酸酚裂解酶菌液，离心收菌体，高压均质机破胞，离心，收集酶液；4酶液加入一定量的底物溶液，搅匀，25℃，密封震荡反应；所述底物溶液为丙酮酸浓缩液配制。通过流加底物溶液控制邻苯二酚的浓度0-10gL，产物达到120gL以上，停止流加底物溶液，当反应液中邻苯二酚含量低于0.2gL，停止反应。本发明的有益效果如下：本发明直接利用丙酮酸发酵液的粗提物为酪氨酸酚裂解酶催化底物，降低了原材料成本，降低三废，具有工业化生产的应用价值。具体实施方式下面结合实施例对本发明进一步加以说明。实例1：发酵获得丙酮酸活化培养基YPD液体培养基：1％酵母膏,2％蛋白胨，2％葡萄糖。种子培养基：10％葡萄糖，3％鱼蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，4mgL烟酸，400μgL吡哆醛，20μgL生物素和4％CaCO3，pH5.5。发酵培养基:10％葡萄糖，0.1％大豆蛋白胨，0.6％NH42SO4，0.1％KH2PO4，0.05％,MgSO4·7H2O，8mgL烟酸，1mgL吡哆醛，20μgL生物素，20μgL硫胺素和4％CaCO3，pH5.5。活化培养：将保存于-80℃冻存管中的菌株用枪头接种到装有5mlYPD液体培养基的30ml螺口瓶中，在30℃或40℃、220rmin条件下活化培养，约12h使菌体生长到对数期以备进行转接培养。种子培养：将活化好的菌液接种到装有一定体积10、15、25ml种子培养基的500ml摇瓶中，在30℃或40℃、220rmin条件下培养24h。发酵培养：将种子发酵液以10％的接种量转接到装有一定体积10、15、25ml发酵培养基的500ml摇瓶中，分别在30℃和40℃、220rmin条件下培养0-48h。发酵罐发酵：添加15％的葡萄糖，不添加CaCO3，其他成分与发酵培养基相同。用5MNaOH调节pH5.5，转速为500，通氧量1：1，不控制溶氧，在相应温度的条件下进行发酵，培养50-72h，丙酮酸达到75gL以上，产物不再增加，停止发酵。粗提取丙酮酸：发酵料液过陶瓷膜除菌体，滤液再过超滤膜除蛋白质、核酸、色素等大分子，获得丙酮酸粗提物水溶液。丙酮酸溶液稀释至12gL，加其他底物配制成底物溶液；丙酮酸溶液反渗透膜浓缩至120gL，加邻苯二酚等底物，配制成补料液。实例2：发酵产生酪氨酸酚裂解酶LB培养基：胰蛋白胨10gL、酵母提取物0.5gL、氯化钠10gL、纯水。发酵培养基：胰蛋白胨12gL、酵母提取物24gL、甘油5gL，磷酸二氢钾2.31gL、三水磷酸氢二钾16.43gL、纯水。1挑单菌落接种4mlLB培养基试管中，加卡那霉素50mgL，37℃，220rpm，培养12h，得到一级种子；2一级种子接种到100ml的发酵培养基的摇瓶中，37℃，220rpm，培养4h，加IPTG至终浓度1mM，25℃，220rpm，培养12h；3步骤2中菌液离心收菌体，放置-20℃冰箱。实例3：酪氨酸酚裂解酶的提取1菌体加3倍体积的水，高压匀浆机破胞；2高速离心，获得上清酶液；实例4：酪氨酸酚裂解酶转化产生L-多巴10.5L底物溶液：丙酮酸发酵后抽滤滤液稀释至含丙酮酸12gL、再加入10gL的邻苯二酚、60gL的醋酸铵、2gL的亚硫酸钠、1gL的EDTA，调pH8.0；20.5L补料液：丙酮酸发酵膜过滤后，反渗透膜浓缩至120gL，加入邻苯二酚至120gL。3酶液10-100g，加入0.5L底物溶液,加三磷酸吡哆醛至100mgL，搅匀，25℃，密封震荡反应；4流加补料溶液，控制两种底物浓度不高于10gL；5当产物浓度达到120gL以上时，停止流加补料液；6当邻苯二酚残留浓度至0.2gL以下，停止反应，L-多巴浓度累积至130gL以上。7反应料液用稀硫酸或稀盐酸酸化溶解晶体，再离心除菌体，离心上清滴加稀氨水析晶，离心收集晶体，粗晶进行酸溶碱析重结晶；8重结晶一次获得产品。

权利要求：1.一种丙酮酸和左旋多巴联产工艺，其特征在于：1利用光滑球拟酵母发酵获得丙酮酸料液，料液经过陶瓷膜除菌，超滤膜除蛋白、核酸、色素，滤液进行浓缩至丙酮酸浓度为150-300gL；2根据丙酮酸的摩尔量向丙酮酸浓缩液加入一定量的邻苯二酚、醋酸铵、EDTA、亚硫酸钠，调pH7.0-9.0，配制成酶催化底物溶液；3利用酪氨酸酚裂解酶基因工程菌发酵获得酪氨酸酚裂解酶菌液，离心收菌体，高压均质机破胞，离心，收集酶液；4酶液加入一定量的底物溶液，搅匀，25℃，密封震荡反应；所述底物溶液为丙酮酸浓缩液配制，过流加底物溶液控制邻苯二酚的浓度0-10gL，产物达到120gL以上，停止流加底物溶液，当反应液中邻苯二酚含量低于0.2gL，停止反应。2.根据权利要求1所述的一种丙酮酸和左旋多巴联产工艺，其特征在于，步骤1中发酵罐发酵过程如下：添加15％的葡萄糖，不添加CaCO3，其他成分与发酵培养基相同。用5MNaOH调节pH5.5，转速为500，通氧量1：1，不控制溶氧，在相应温度的条件下进行发酵，培养50-72h，丙酮酸达到75gL以上，产物不再增加，停止发酵。3.根据权利要求1所述的一种丙酮酸和左旋多巴联产工艺，其特征在于，步骤3中LB培养基：胰蛋白胨10gL、酵母提取物0.5gL、氯化钠10gL、纯水；发酵培养基：胰蛋白胨12gL、酵母提取物24gL、甘油5gL，磷酸二氢钾2.31gL、三水磷酸氢二钾16.43gL、纯水。4.根据权利要求3所述的一种丙酮酸和左旋多巴联产工艺，其特征在于，挑单菌落接种4mlLB培养基试管中，加卡那霉素50mgL，37℃，220rpm，培养12h，得到一级种子；一级种子接种到100ml的发酵培养基的摇瓶中，37℃，220rpm，培养4h，加IPTG至终浓度1mM，25℃，220rpm，培养12h；菌液离心收菌体，放置-20℃冰箱。5.根据权利要求4所述的一种丙酮酸和左旋多巴联产工艺，其特征在于酪氨酸酚裂解酶的提取是在菌体加3倍体积的水，高压匀浆机破胞；高速离心，获得上清酶液。6.根据权利要求5所述的一种丙酮酸和左旋多巴联产工艺，其特征在于，步骤4中酶液10-100g，加入0.5L底物溶液,加三磷酸吡哆醛至100mgL，搅匀，25℃，密封震荡反应。7.根据权利要求6所述的一种丙酮酸和左旋多巴联产工艺，其特征在于，步骤4当邻苯二酚残留浓度至0.2gL以下，停止反应，L-多巴浓度累积至130gL以上，反应料液用稀硫酸或稀盐酸酸化溶解晶体，再离心除菌体，离心上清滴加稀氨水析晶，离心收集晶体，粗晶进行酸溶碱析重结晶，重结晶一次获得产品。

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