申请/专利权人：上海市计划生育科学研究所;中国人民解放军第二军医大学

申请日：2016-11-22

公开（公告）日：2020-06-23

公开（公告）号：CN106699894B

主分类号：C07K19/00(20060101)

分类号：C07K19/00(20060101);A61K38/17(20060101);A61P31/10(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.06.23#授权;2017.06.16#实质审查的生效;2017.05.24#公开

摘要：本发明通过免疫共沉淀实验证明IP3R3型与人Sec5蛋白结合，并通过Pulldown实验证明人Sec5蛋白‑2片段、人Sec5蛋白‑4片段与IP3R1的H1段有结合，而且证明了人Sec5‑2片段对RAW264.7细胞的吞噬功能有促进作用；在这基础上，本发明公开了人Sec5蛋白和人Sec5蛋白‑2片段在制备抗真菌感染的药物中的应用，且在抗感染药物领域有着良好的开发应用前景。

主权项：1.人Sec5蛋白-2片段的应用，其特征在于，用于制备抗真菌感染的药物，其中，所述人Sec5蛋白-2片段的序列如SEQIDNO:11所示。

全文数据：一种人Sec5蛋白的应用技术领域[0001]本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于人Sec5蛋白的应用。背景技术[0002]随着发病率和死亡率的上升，侵袭性真菌感染逐渐受到人们的关注，I⑶的感染患者中19%为真菌感染，其中白念珠菌占80%，排院内获得性血液感染的第4位。高等哺乳动物免疫系统分为固有免疫系统和适应性免疫系统，其中固有免疫系统在病菌侵入前期发挥着重要作用。固有免疫细胞如巨噬细胞，树突状细胞通过细胞表面的模式识别受体结合病原菌表面的病原相关分子模式，进而激活免疫细胞对入侵病原菌的杀伤。当免疫细胞表面的^式识别受体与病原菌表面的病原相关分子模式结合后，激活胞内信号传导，将病原菌包裹内吞形成吞噬小体，吞噬小体与胞内溶酶体融合后将病原菌杀伤，并体呈抗原，激活适应性免疫反应。[0003]大量研究表明免疫细胞表面的模式识别受体如toll样受体，C型凝集素受体，补体受体等与相应的配体集合后激活胞内磷脂酶CphospholipaseC，PLC，隣脂酶C产生1，4,5-三磷酸肌醇（inositoll,4,5-triphosphate，IP3，IP3再用于IP3受体，引起钙离子的释放导致胞内钙离子的升高，钙离子作为广泛存在的一种第二信使，参与多种生理活动，免疫细胞中胞内钙离子的升高可以影响肌动蛋白的聚合进而影响对病原菌的吞噬，影响吞噬小体和溶酶体的融合，影响活性氧的产生等多种生理功能，进而影响免疫细胞对病原菌的杀伤。对于钙离子信号参与免疫细胞吞噬过程的分子机制研究，会给抗感染药物的研宄提供新的理论基础和方向。[0004]目前，已有研究发现IP3R-C端胞内段对于IP3R离子通道的活性发挥重要作用。Taylor,C.ff.,daFonSeca,P.C.,andMorris,E.P.2004.IP3receptors:thesearchforstructure.TrendsBiochem.Sci.29,210-219.Uchida,K.,Miyauchi,H.,Furuichi,T.,Michikawa,T.,andMikoshiba,K.2003.Criticalregionsforactivationgatingoftheinositol1,4,5-trisphosphatereceptor.J.Biol.Chem.278,16551-16560.[0005]人Sec5蛋白是外包囊复合物的组分，由924个氨基酸长度的0RF开放阅读框编码，分子量约一百多个KDa，等电点约为7.0左右，在其氨基端处含有一21个氨基酸区域，形成一个卷曲螺旋域。Sec5蛋白存在与哺乳动物的各组组织，例如脑、肺及肾中。[0006]TAT蛋白是HIV编码的一个调控蛋白，HIV侵染细胞的早期即表达出该蛋白，细胞内TAT参与HIV转染激活，促进HIV复制。TAT蛋白的基因包含2个外显子和一个含有2334个核苷酸的内含子组成。在HIV-1的各亚型中，TAT蛋白的氨基酸组成有所不同。TAT蛋白中具有穿膜功能的序列是位于47〜57的11个氨基酸YGRKKRRQRRR，富含碱性氨基酸8个），被称为蛋白转导域PTD。发明内容[0007]本发明通过筛选与IP3R-C端相互作用的蛋白发现人Sec5蛋白与IP3R-C端结合，并通过免疫共沉淀实验证明IP3R3型与人Sec5蛋白结合，在这基础上，发明人通过Pul1down实验鉴定人Sec5蛋白与IP3R-C端的结合区域，结果显示人Sec5-2片段和人Sec5-4片段与IP3R的H1段有结合;接着，本申请的发明人将人Sec5-2片段和人Sec5-4片段分别融合穿膜多肽，转化获得融合蛋白，并研究该融合蛋白的功能，结果证实人Sec5-2片段对RAW264.7细胞的吞噬功能有促进作用。[0008]因此，本发明的第一个目的在于，提供一种人Sec5蛋白的应用，用于制备抗真菌感染的药物。[0009]进一步的，所述人Sec5蛋白具有SEQIDN0:9所示的序列。[0010]本发明的第二个目的在于，提供一种人Sec5蛋白-2片段的应用，用于制备抗真菌感染的药物，其中，所述人Sec5蛋白-2片段的序列如SEQIDN0:11所示。[0011]本发明的第三个目的在于，提供一种融合蛋白，包括人Sec5蛋白-2片段和穿膜多肽HIV-TAT，所述人Sec5蛋白-2片段的氨基酸序列如SEQID^.11所示，穿膜多肽111¥-丁八丁的氨基酸序列如SEQIDN0.14所示。[0012]进一步的，所述的融合蛋白在制备抗真菌感染的药物中的应用。[0013]本发明的第四个目的在于，提供一种抗真菌感染的药物组合物，所述药物组合物包括人Sec5蛋白。[0014]本发明的第五个目的在于，提供一种抗真菌感染的药物组合物，所述药物组合物包括人36〇5蛋白-2片段，所述人36〇5蛋白-2片段的序列如3£010从:11所示。[0015]本发明的第六个目的在于，提供一种抗真菌感染的药物组合物，所述药物组合物包括上述所述的融合蛋白。[0016]本发明的有益效果是：基于人Sec5蛋白-2片段可以促进免疫细胞吞噬真菌的能力，因此人Sec5蛋白、人Sec5蛋白-2片段可以用于制备抗真菌感染的药物，在抗感染药物领域有着良好的开发应用前景。附图说明[0017]图1为IP3R3型受体与人Sec5蛋白免疫共沉淀试验结果图。[0018]图2为IP3R的结构示意图，IP3R1-H12571aa-2614aa，IP3R1-H22606aa-2655aa，IP3R1-H32655aa-2689aa，IP3R1-H42692aa-2733aa，IP3R1-H2+H32606aa-2689aa。[0019]图3为GST融合的GST-H1H2H3H4H2+3大肠杆菌诱导纯化考马斯亮蓝染色结果图。[0020]图4为GST-H1H2H3H4H2+3与小鼠巨噬细胞RAW264.7裂解液孵育Pulldown实验的实验结果图。[0021]图5为Sec5的结构示意图，Sec5_llaa_140aa，Sec5-2lllaa_400aa，Sec5_3370aa-690aa，Sec5-4669aa-924aa〇[0022]图6为His标签融合人Sec5蛋白片段大肠杆菌诱导表达结果图。[0023]图7为His标签融合的Sec5蛋白片段的大肠杆菌裂解液与〇31'，051'-111，681'-脱孵育进行Pulldown实验的实验结果图。[0024]图8为TAT-Sec5-2大肠杆菌诱导表达后，用镍柱纯化结果图。[0025]图9为RAW264.7细胞经融合蛋白TAT-Sec5-2处理后以及经对照处理后，RAW264•7细胞对白色念珠菌的吞噬能力图。具体实施方式[0026]以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。[0027]以下实施例，除另有说明外，人Sec5蛋白_2片段是指人Sec5蛋白的第120-410位片段。[0028]实施例1、人Sec5蛋白与IP3R的相互作用研宄[0029]1酵母双杂交实验，筛选与IP3R-C端相互作用的蛋白[0030]将InsP3R-l蛋白（大鼠）C末端的最后163个氨基酸的cDNA序列克隆到pLexAclontech公司）载体中，以此用做“鱼傅”，从人的脑cDNA库筛选结合蛋白（Invitrogen。大约筛选6X106原始transformants。用clontech公司提供的质粒提取试剂盒，抽提阳性酵母细胞中与鱼饵结合蛋白的质粒。然后通过DNA序列分析，确定结合蛋白的DNA序列，最后从NIH网站的Blast中确定对应的结合蛋白名称和序列，编码结合蛋白的DNA序列如SEQIDN0:1所示，对应的结合蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。最后用返回转化的方法验证阳性克隆，并用空载体做对照。[0031]实验结论:从与IP3R-C端相互作用的蛋白质的序列，推测该相互作用的蛋白为人Sec5蛋白。[0032]⑵免疫共沉淀试验[0033]用1倍的PBS溶液，含1%Triton-X100和蛋白酶抑制剂做为裂解液。将大鼠大脑用裂解液裂解，将裂解液中的总蛋白浓度用细胞裂解液调整到5mgml。取1.2ml溶液，加入抗体实验组为IP3三型受体一抗，对照组为IgG细胞裂解液与抗体的体积比为1:200。在4°C混合3小时，加入20微升的蛋白G树脂，在4°C混合1小时，在4°C，2krpm离心5分钟，去掉上清液，用裂解液洗蛋白G树脂2次。用1倍westernblotting上样溶液洗脱蛋白G树脂结合蛋白，用6%的SDS-PAGE胶分离洗脱蛋白，将胶上蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用Sec5抗体验证人Sec5蛋白。结果如图1所示。图1为利用大鼠脑裂解液与IP3三型受体一抗孵育，共沉淀检测Sec5蛋白，小鼠IgG作为对照。[0034]实验结论：IP3R3型受体与Sec5共沉淀，而对照组IgG不能与Sec5结合，从而证明IP3R3型受体与Sec5结合。[0035]实施例2、IP3R与人Sec5蛋白结合区域鉴定[0036]1IP3R的结构示意图[0037]如图2所示，IP：3R-C端有4个a螺旋结构，即HI，H2，H3，H4。其中，IP3R1的氨基酸序列如SEQIDN0:3所示。[0038]⑵GST-H1、GST-H2、GST-H3、GST-H4、GST-H2+3的构建和诱导纯化[0039]以大鼠一型IP3受体为模板，利用PCR技术分别获得HI，H2，H3，H4，H2+3序列，双酶切BamHIXhoIPCR产物和载体质粒Pgex-6P-1GE公司），胶回收各酶切产物，用T4连接酶将目的序列和载体链接插入目的序列片段与载体质粒的摩尔比为5:1，于室温下链接lh后，转化DH5a感受态细胞;涂板，37°C培养过夜;第二天挑选克隆PCR鉴定后测序，选取测序正确的克隆摇菌，抽取质粒备用；接着将质粒在大肠杆菌中诱导纯化获得^1'-沿、65丁-H2、GST-H3、GST-H4、GST-H2+3，结果如图3所示。其中所述GST-H1、GST-H2、GST-H3、GST-H2+3、GST-H4的氨基酸序列如SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDNO:8所示。[0040]实验结论:GST-H1H2H3H4H2+3蛋白成功表达纯化，虽然有部分降解但目的蛋白条带突出，可以用于后续实验。[0041]3GST_HlH2H3H4H2+3蛋白与小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞裂解液孵育进行pulldown实验[0042]将小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞（l〇cm细胞培养皿）裂解，加入裂解液2〇mMTrispH7.4，150mMNacl，l%TritonX100，12000rpm，离心15min，收集上清；然后分别加入结合有15〜20yg的InsP3R-Hl，H2，H2+3，H3，H4GS^T融合蛋白的珠子，4°C旋转孵育lh;离心收集珠子，用裂解液（2〇mMTrispH7_4，l5〇mMNacl,l%TritonX100洗3次，加入蛋白上样缓冲液碧云天），l〇〇°C，lOmin将珠子上结合的蛋白解离，离心收集上清，-2TC保存备用或直接继续用westernblotting检测验证。结果如图4所示。[0043]实验结论:只有GST-H1片段结合Sec5蛋白，其它片段无明显结合。[0044]⑷His标签融合人Sec5蛋白的构建[0045]如图5所示，人Sec5蛋白全长有924个氨基酸，其中，人Sec5蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:9所示，其中人Sec5蛋白-1片段、人Sec5蛋白-2片段、人Sec5蛋白-3片段和人36〇5蛋白-4片段的氨基酸序列如3£010冊：10、8£010购：11、3£010冊：12和3£010N0:13所示。[0046]以人Sec5序列为模板，利用PCR技术分别获得Sec5-1、Sec5-2、Sec5-3、Sec5-4序列。双酶切（Sec5-l、Sec5-2用SacIXhoI双酶切，Sec5-3、Sec5-4用EcoRIXhoI双酶切）PCR产物和载体质粒pet28aNovagen公司），胶回收各酶切产物，用T4连接酶将目的序列和载体链接插入片段与载体质粒的摩尔比为5:1，于室温下链接lh后，转化DH5a感受态细胞;涂板，37°C培养过夜;第二天挑选克隆PCR鉴定后测序，选取测序正确的克隆摇菌，抽取质粒（pet28a-Sec5、pet28a-Sec5-l、pet28a-Sec5-2、pet28a_Sec5-3、pet28a-Sec5_4转化大肠杆菌BL21DE3pLys菌株北京全式金生物），备用。[0047]⑹His标签融合Sec5蛋白片段在大肠杆菌中诱导表达[0048]A、在37°C，200rpm振荡条件下培养400ml1L培养瓶实施例25中的携带了克隆有目标基因载体的大肠杆菌BL21DE3pLys菌株，直至A600达到0•4。[0049]B、当A600达到0.4时降低温度至24°C，200rpm振荡培养至A6〇0达到0_6。[0050]C、加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG至0.5-ImML诱导表达3_4小时。[0051]D、诱导3-4小时后，7000g，15分钟离心收集细胞，弃上清，记录湿菌重量，-8〇°C保存备用，获得His标签融合Sec5蛋白片段。结果如图6所示。[0052]实验结论：[0053]利用His标签特异性抗体在相应的分子量上检测到相关蛋白的表达，说明His融合的Sec5及其片段均能诱导表达，尽管Sec5和Sec5-3表达相对较弱，但满足相关实验要求。[0054]⑺His标签融合的Sec5蛋白片段的大肠杆菌裂解液与GST，GST-H1，GST-H4孵育进行pulldown实验[0055]向不同His标签融合的Sec5蛋白片段的大肠杆菌（约60mg湿菌）加入lml裂解液20mMTrispH7.4，150mMNacl，l%TritonX100，30%功率超声裂解，12000rpm，离心30min，收集上清;然后没300ul—组分别加入结合有15〜20ug的InsP3R-Hl，H4GST融合蛋白及GST蛋白的珠子，4°C旋转孵育90min;离心收集珠子，用裂解液20mMTrispH7•4，150mMNacl,l%TritonX100洗3次，加入蛋白上样缓冲液来源碧云天），100°C，10min将珠子上结合的蛋白解离，离心收集上清，-20°C保存备用或直接继续用westernblotting检测验证。[0056]如图7所示，his标签融合的Sec5蛋白片段的大肠杆菌裂解液与GST，GST-H1，GST-H4孵育进行Pul1down实验，GST为对照。[0057]实验结论:GST-H1段可以与Sec5_2B和Sec5-4D段结合，而与Sec5_lA和Sec5-3C没有结合。阴性对照组GST和GST-H4与各片段都不结合。[0058]实施例3TAT-Sec5-2融合蛋白的制备、诱导表达和纯化[0059]1TAT-Sec5-2融合蛋白的制备[0060]将人86〇5蛋白-2片段融合穿膜多肽111¥-1々1'丫01?111?1^1^1?，如3£010^:14所示），转化大肠杆菌诱导纯化获得TAT-Sec5-2融合蛋白（如图8所示）。具体步骤如下：[0061]以人Sec5序列为模板，利用PCR技术分别获得TAT-Sec5-2序列，双酶切Sec5-2用NdelXhoI双酶切PCR产物和载体质粒pet28aNovagen公司），胶回收各酶切产物，用T4连接酶将目的序列和载体质粒pet28a链接插入片段与载体质粒的摩尔比为5:1，于室温下链接lh后，转化DH5a感受态细胞;涂板，37°C培养过夜;第二天挑选克隆PCR鉴定后测序，选取测序正确的克隆摇菌，抽取质粒pet28a-TAT-Sec5-2转化大肠杆菌BL21DE3pLys菌株，涂板，挑单克隆37°C，200rpm振荡培养过夜，获得了携带pet28a-TAT-Sec5_2质粒的大肠杆菌BL21DE3pLys菌株，第二天扩大体系进行诱导表达。[0062]2TAT-Sec5-2融合蛋白的诱导表达[0063]A、在37°C，200rpm振荡条件下培养400ml1L培养瓶）实施例31中所述的携带pet28a-TAT-Sec5-2质粒的大肠杆菌BL21DE3pLys菌株，直至A600达到0.4。[0064]B、当A600达到0.4时降低温度至24°C，200rpm振荡培养至A600达到0•6。[0065]C、加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG至0.5-lmML诱导表达3-4小时。[0066]D、诱导3-4小时后。7000g，15分钟离心收集细胞，弃上清，获得诱导表达TAT-SEC5-2的细菌，记录湿菌重量，-80°C保存备用。[0067]⑶TAT-Sec5-2融合蛋白的纯化[0068]该实施例所采用的裂解液、漂洗液、洗脱液、透析液具体如下：[0069]裂解液：50mMTrispH7.9，150mMNacl，l%TritonX100，10%Giycerol;[0070]漂洗液：50mMTrispH7.9，150mMNacl，l%TritonX100，10%Giycerol，20mM咪唑；[0071]洗脱液：50mMTrispH7_9，150mMNacl，l%TritonX100，10%Giycerol，200mM咪唑；[0072]透析液：50mMTrispH7.9，150mMNacl;[0073]A、将l-2g实施例3⑵中的诱导表达TAT-Sec5-2的细菌用30ml裂解液重悬，然后用60%的功率超声10次，每次9s，间隔9s，取80ul裂解样品留样TAT-Sec5_2总）；[0074]B、12000rpm，离心30min，同时进行镍柱处理，2L菌体用4mlbeads，用10倍柱体积的裂解液洗三次，离心结束后收集上清，取8〇ul留样TAT-Sec5-2上清），重悬沉淀取80ul留样TAT-Sec5-2沉淀）；[0075]C、将收集的裂解液上清过镍柱结合，重复三次过柱，三次后取8〇ul流出液留样TAT-Sec5-2流出）；[0076]D、用十倍柱体积的漂洗液洗柱子三次，收集洗涤下来的液体测㈤280，使其0•01;[0077]E、加入洗脱液，每次1倍柱体积，EP管收集流出液，用BI0-RAD法检测蛋白浓度，留下蛋白含量高的管，取80ul留样TAT-Sec5-2洗脱12，加入到透析袋中，在1L透析液中透析24小时后，换透析液继续透析24小时，收集透析的样品检测蛋白浓度。[0078]如图8为TAT-Sec5-2大肠杆菌诱导表达后，用镍柱纯化结果图。[0079]实验结论：[0080]TAT-SEC5-2洗脱12组分，目的蛋带条带单一，说明蛋白纯度较高可以用于后续实验。[0081]实施例4TAT-Sec5-2融合蛋白对真菌的吞噬作用[0082]A、将5*105个RAW264.7细胞铺板到35mm玻底皿中，培养箱中培养6小时让细胞帖壁；[0083]B、细胞帖壁后分别加入2uMTAT-Sec5-2蛋白（实验组）、2uMTAT-ECFP蛋白（TAT-荧光蛋白组或不做处理空白对照组CTR组），孵育16h。第二天进行拍照实验；[0084]C、16小时后取出玻底皿置于活细胞工作台上TOKAIHIT，加入白色念珠菌标准株SC5314ATCC，M0I二1:10,白光下用显微镜实时拍摄，间隔20s拍摄一次，共90分钟；[0085]D、拍摄完成后，分析记录发生吞噬的RAW264.7的细胞个数和每个细胞吞噬的白色念珠菌的个数。[0086]Sc5314的培养:挑取冻存的SC5314的菌液接种到lmlYPD培养基中，培养过夜活化一次），第二天将取一次活化的菌液接种到一定体积的YPD培养基中，培养16小时，6000rpm离心lOmin，弃上清，无菌PBS洗三次，lmlPBS重悬后计数用于后续实验。[0087]如图9所示，用2uMTAT-SEC5-2处理RAW264•7细胞16小时，用白色念珠菌SC5314刺激M0I=1:10观察RAW2M•7细胞对白色念珠菌的吞噬能力。A、吞噬指数=100个RAW264•7细胞吞噬白念珠菌的个数100;B、吞噬率=发生吞噬的细胞个数总的细胞个数，n=3。[0088]实验结论:TAT-ECFP组与空白对照组比影响不明显，说明TAT多肽对RAW264•7细胞的吞噬功能无影响，而TAT-SEC5-2处理组发生吞噬的RAW264•7的细胞以及吞噬的白色念珠菌的个数较对照组明显升高，说明Sec5-2蛋白对RAW264•7细胞的吞噬功能有促进作用。[0089]采用实施类似的步骤，建立TAT-Sec5-4融合蛋白实验组、TAT-荧光蛋白组和空白对照组，结果显示，TAT-Sec5-4融合蛋白抑制RAW264•7细胞吞噬真菌。[0090]综上所述，本发明的TAT-Sec5-2融合蛋白能够促进RAW264.7细胞的吞噬作用，而且所述TAT-Sec5-2融合蛋白可采用本领域中已知的方法，进一步制成融合蛋白的药物组合物，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。[0091]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

权利要求：1.人Sec5蛋白的应用，其特征在于，用于制备抗真菌感染的药物。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人Sec5蛋白具有SEQIDN0:9所示的序列。3.人Sec5蛋白_2片段的应用，其特征在于，用于制备抗真菌感染的药物，其中，所述人56〇5蛋白-2片段的序列如8£010冊:11所示。4.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括人Sec5蛋白-2片段和穿膜多肽hiv-TAT，所述人Sec5蛋白_2片段的氨基酸序列如SEQID齡.11所示，穿膜多肽111¥-141'的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示。5.如权利要求4所述的融合蛋白在制备抗真菌感染的药物中的应用。6.—种抗真菌感染的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括人Sec5蛋白。7.—种抗真菌感染的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括人Sec5蛋白_2片段，所述人Sec5蛋白_2片段的序列如SEQIDNO:11所示。8.—种抗真菌感染的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求4所述的融合蛋白。

百度查询： 上海市计划生育科学研究所;中国人民解放军第二军医大学 一种人Sec5蛋白的应用

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