申请/专利权人：北京恒峰铭成生物科技有限公司

申请日：2017-02-23

公开（公告）日：2020-06-23

公开（公告）号：CN106978394B

主分类号：C12N5/0775(20100101)

分类号：C12N5/0775(20100101);A61K35/28(20150101);A61K9/08(20060101);A61K47/42(20170101);A61K47/26(20060101);A61P29/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.06.23#授权;2017.08.18#实质审查的生效;2017.07.25#公开

摘要：本发明提供了一种抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法及其应用。所述抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法为将分离提取的间充质干细胞培养至融合达70～80％，抽掉间充质干细胞培养皿中的培养基，用磷酸缓冲液冲洗间充质干细胞；然后加入含50～200ngmL脂多糖的无血清培养基；然后调节低氧状态至氧含量5～10％，并将所述间充质干细胞在低氧状态下培养16～18小时。所述抗慢性炎症的间充质干细胞可用于治疗慢性炎症。

主权项：1.一种抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法，其包括的步骤为：a将间充质干细胞培养至70～80％的融合，抽掉间充质干细胞培养皿中的培养基，用磷酸缓冲液冲洗所述间充质干细胞；b加入含50～200ngmL脂多糖LPS的无血清培养基；然后c调节低氧状态至氧含量5～10％，并将所述间充质干细胞在低氧状态下培养16～18小时。

全文数据：一种抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法及其应用技术领域[0001]本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法，一种抗慢性炎症的间充质干细胞注射液及其用于抗慢性炎症的应用。背景技术[0002]慢性炎症可以引起多种疾病，例如糖尿病、心血管疾病等，是很多疾病的共同发病机制。二型糖尿病的发病机制是肥胖导致的慢性炎症而致的胰岛素抵抗，造成的高血糖、以及持续的高血糖并进而导致的糖代谢与脂代谢紊乱，从而对胰岛0细胞的进行性损伤。肥胖使细胞胀大，体内免疫系统将它识别为异常细胞，对其进行修饰，给体内造成过多的炎症，从而导致糖尿病。心血管疾病中，血管内皮细胞受到慢性炎症的刺激，遭受损伤，引起血管壁的硬化。[0003]越来越多的研宄证实间充质干细胞MSCs通过分泌的细胞因子可发挥免疫调节与降低炎症的作用。研究发现，间充质干细胞可以缓解炎症反应，它的这种促进炎症到增殖阶段转变的生物属性，在严重的炎症抑制治疗中是非常重要的。在脓毒症模型中，MSCs可以分泌某些生长因子增加修复M2巨噬细胞的百分比和增加器官功能。[0004]研宄显示对干细胞进行预处理会增强其修复效应。研究还发现把MSCs暴露给药理剂脂多糖LPS可以增加MSCs的营养作用和抵抗严酷的炎性环境的能力YaoY，ZhangF，WangL,ZhangG,ffangZ,ChenJ,GaoX.Lipopolysaccharidepreconditioningenhancestheefficacyofmesenchymalstemcellstransplantationinaratmodelofacutemyocardialinfarction.JBiomedSci.200916:74；CrisostomoPR,WangY,MarkelTA,ffangM,LahmT,MeldrumDR.HumanmesenchymalstemcellsstimulatedbyTNF-alpha，LPS，orhypoxiaproducegrowthfactorsbyanNFkappaB-butnotJNK-dependentmechanism.AmJPhysiolCellPhysiol.2008294:C675-82.;已经确定LPS处理过的MSCs比没有处理过的MSCs在糖尿病小鼠模型里对保存皮瓣存活方面有优越的治疗能力。因此脂多糖预处理MSCs被运用于增强干细胞治疗特性。[0005]在低氧条件下MSCs活性增强，治疗潜能也随之增强，这些特点被用于治疗缺血性疾病等（LiuJJ，HaoHJ，TongC，HuangH，TiDD，DongL，ChenDY，ZhaoYL，LiuHL，FuXB?HanWD.Hypoxiaregulatesthetherapeuticpotentialofmesenchymalstemcellsthroughenhancedautophagy.IntJLowExtremWounds，2015;14l:63_72〇[0006]由于MSCs受体内环境的影响，治疗效果不确定，因此目前干细胞对慢性炎症的修复技术是仍是亟待解决的问题。发明内容[0007]针对MSCs受体内环境的影响，治疗效果不确定，效率不高的问题，本发明提供了一种抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法，一种抗慢性炎症的间充质干细胞注射液及其用于抗慢性炎症的应用。[0008]为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：[0009]一种抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法，其包括的步骤为:a将间充质干细胞培养至70〜80%的融合，抽掉间充质干细胞培养皿中的培养基，用磷酸缓冲液冲洗间充质千细胞;b加入含50〜2〇OngmL脂多糖LPS的无血清培养基;然后c调节低氧状态至氧含量5〜10%，并将所述间充质干细胞在低氧状态下培养16〜18小时。[0010]进一步的，所述步骤b中所述无血清培养基中脂多糖浓度为5〇ngmL、l〇〇ngmL或200ngmL;所述步骤c中所述氧含量为5%或者10%。[0011]所述步骤a中采用0.01M的磷酸缓冲液冲洗间充质干细胞三次;所述步骤c中无血清培养基为DMEM培养基;所述培养条件为3rC、5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱;所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞。[0012]一种抗慢性炎症的间充质千细胞注射液，其包括以下组分:数量为5X105〜2X106个mL的抗慢性炎症的间充质干细胞，质量体积比为1〜5%的人血白蛋白、质量体积比为丄〜5%的复方维生素、质量体积比为1〜8%的甘露醇、质量体积比为〇.5〜2•5%的葡萄糖和余量的生理盐水，其中所述抗慢性炎症的间充质干细胞为脂多糖和低氧预处理的间充质千细胞。[0013]一种抗慢性炎症的间充质干细胞注射液，所述抗慢性炎症的间充质千细胞为脂多糖和低氧预处理的间充质干细胞，其制备方法为:a将间充质干细胞培养至70〜80%的融合，抽掉间充质干细胞培养皿中的培养基，用磷酸缓冲液冲洗间充质千细胞;b加入含50〜200ngmL脂多糖LPS的无血清培养基;然后c调节低氧状态至氧含量5〜10%，并将所述间充质干细胞在低氧状态下培养16〜18小时。[00M]进一步的，所述抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法的步骤b中所述无血清培养基中脂多糖浓度为5〇ngmL、100ngmL或200ngmL;所述抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法的步骤c所述氧含量为5%或者10%。所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞。[0015]上述抗慢性炎症的间充质干细胞在制备治疗慢性炎症等疾病中的应用。[0016]上述抗慢性炎症的间充质干细胞注射液在治疗慢性炎症等疾病中的应用。[0017]本发明的有益效果：[0018]本发明采用LPS和低氧的微环境对脐带间充质干细胞进行预处理，激活干细胞抗炎机制，明显增强了间充质干细胞发挥抗炎的效应，降低炎性反应中促炎因子的生成和增加抗炎因子的生成，让预处理的MSCs在慢性低浓度炎症里面发挥更强的治疗效应。本发明制备的LPS和低氧预处理的间充质干细胞，经过简单的预处理，干细胞特性未见变化，本制备体系易于质量控制，易于产业化。本发明采用激活的间充质干细胞注射液优化治疗方案，采用多次输注治疗的策略，显著降低了炎性反应。[0019]详细描述:[0020]作为炎症组织损伤的主要效应器，巨噬细胞根据微环境信号的不同可以分化成“传统激活”的Ml表型或者“选择性激活”的M2表型。Ml巨噬细胞的促炎反应通常依赖样受体TLRs和NFkB的激活，导致病原体吞噬作用，氧化破裂和细胞内死亡。相反的，激活M2巨噬细胞导致STAT3或者其他转录因子的聚集，从而抑制炎症并且促进组织重建。之前的研宄显示在糖尿病小鼠模型中，高糖可以增强Ml细胞，减少M2细胞的极化，产生大量的炎性因子和慢性炎症，并且在糖尿病里特异性表达的炎症用于Ml巨噬细胞的超诱导和诱导的一氧化氮合成酶的异常产生，导致创新组织破坏和重现慢性创口（BannonP，WoodS，RestivoT,CampbellL，HardmanMJ,MaceKA.Diabetesinducesstableintrinsicchangestomyeloidcellsthatcontributetochronicinflammationduringwoundhealinginmice.DisModelMech.2013;6:1434-47。因此，巨噬细胞极化适当的平衡在调节炎症和随后加速组织修复和体内平衡中起着至关重要的作用。本发明实施例中将巨噬细胞极化的平衡作为MSCs治疗效果的一个指标。[0021]NLRP3是最具良好表征的炎性小体。我们发现人体间充质干细胞负调控NLRP3炎性小体在人体和暴露过LPS的小鼠巨噬细胞的激活。人体MSCs对NLRP3在mRNA水平上的表达没有影响，但是会显著地抑制线粒体活性氧的产生，这对NLRP3炎性小体的激活起到至关重要的作用。因此本发明实施例中通过检测NLRP3炎性小体来检测LPS低氧预处理的MSCs是否产生作用。[0022]本发明以高糖创造慢性低浓度的炎症环境。附图说明：[0023]图1.采用免疫印迹法测定的大鼠巨噬细胞中IL-1I3和胱冬肽酶-1的表达量。左图为免疫印迹法测量的MSCs共同培养的巨噬细胞培养上清中11^1|3的表达量。右图为免疫印迹法测定的MSCs共同培养的巨噬细胞培养上清中胱冬肽酶-1的表达量。[0024]图2:RT-PCR检测的THP-1细胞与不同MSC共同培养24h和48h后上清液中促炎因子IL-1，IL-6，TNF-a和抗炎因子（IL-10，TGF-0的相对表达量。具体实施方式[0025]下面以具体实施方式对发明作进一步详细说明[0026]本发明参照特定的实施例进行了描述，但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不违背本发明的精神和范围。因此，本发明的说明书和附图应该认为是说明性的而非限制性的。[0027]实施例1.脐带间充质干细胞的制备[0028]在超净工作台中进行操作，取新鲜足月健康胎儿脐带，用含2倍100UmL青霉素和链霉素的生理盐水冲洗去除血渍，将华尔通氏胶剥离，剪成1立方毫米以下块状，均匀涂布，缓慢加入10mL无血清培养基，置37°C、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。将原代细胞培养7天后，更换无血清培养液，培养至细胞达到70%的融合，移去无血清培养液，添加浓度分别为0.25%和0•1%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸钠⑽TA消化lmin，脐带MSC收缩脱离瓶壁，此时加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA溶液，并使用移液管轻轻吹打，将胳带MSC悬液移入50mL离心管。lOOOrpm离心8min，去除上清液;重新加入无血清完全培养基将MSC重悬，并计数。按照1传1.5接种10cm培养皿。MSC培养融合70%左右时参照上述方法传代培养。[0029]选择第四代培养的MSC，在对数生长期，且细胞融合程度不超过80%时按照传代的要求消化、中和、洗涤、收集细胞，采用细胞冻存液90%胎牛血清和10%二甲亚砜DMS0重悬MSC，充分混匀，每管lmL分装于冻存管密封。将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中，于一so°c冰箱过夜，次日移入液氮罐保存。[0030]MSC复苏的步骤为:取出MSC冻存管，立即浸入37。：温水中溶解;取适量无血清培养基混悬细胞并呙心，弃去上清液;细胞重悬于无血清培养基中，并接种于培养皿中，于37。〇、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。[0031]实施例2.LPS低氧预处理脐带间充质干细胞[0032]抗慢性炎症的间充质干细胞为Lps低氧预处理的间充质干细胞，所述抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法包括的步骤为:a将间充质干细胞培养至70〜80%的融合，抽掉间充质干细胞培养皿中的培养基，用磷酸缓冲液冲洗间充质干细胞；b加入含50〜200ngmL脂多糖LPS的无血清培养基;然后c调节低氧状态至氧含量5〜10%，并将所述间充质干细胞在低氧状态下培养16_18小时，测量培养的间充质干细胞数量，如果间充质干细胞的数量能够达到5X105〜2X106个mL，表明为有效的LPS和低氧预处理的间充质干细胞。[0033]1[0034]每15cm的细胞培养皿接种1•5X1〇6个脐带MSCs，培养约24小时达到70〜80%的融合;抽掉MSCs培养皿中的培养基，然后使用〇_01M的磷酸缓冲液PBS冲洗脐带MSCs三次；用含50ngmLLPS的DMEM培养基培养;然后调节低氧状态至氧含量5%，并将所述间充质干细胞在低氧状态下培养16小时，培养条件为37°C、5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱，间充质干细胞的数量为7X1〇5个mL，表明终浓度50ngmLLPS和氧含量5%的低氧预处理，能够获得有效的LPS和低氧预处理的间充质干细胞，即抗慢性炎症的间充质干细胞。[0035]⑵[0036]每15cm的细胞培养皿接种1.5X1〇6个脐带MSCs，培养约24小时达到70〜80%的融合;抽掉MSCs培养皿中的培养基，然后使用〇.01M的磷酸缓冲液PBS冲洗脐带MSCs三次;加入含100ngmLLPS的DMEM培养基;然后调节低氧状态至氧含量1〇%，并将所述间充质干细胞在低氧状态下培养I7小时，培养条件为37°C、5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱，间充质干细胞的数量为8X105个mL，表明终浓度lOOngmLLPS和氧含量10%的低氧预处理，能够获得有效的LPS和低氧预处理的间充质干细胞，即抗慢性炎症的间充质干细胞。[0037]⑶[0038]每15cm的细胞培养皿接种1•5X1〇6个脐带MSCs，培养约24小时达到70〜80%的融合;抽掉MSCs培养皿中的培养基，然后使用0•01M的磷酸缓冲液PBS冲洗脐带MSCs三次;用含200ngmLLPS的DMEM无血清培养基培养;然后调节低氧状态至氧含量10%，并将所述间充质干细胞在低氧状态下培养I8小时，培养条件为37°C、5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱，间充质干细胞的浓度为1X106个mL，表明终浓度200ngmLLPS和氧含量10%的低氧共同处理，能够获得有效的LPS和低氧共同处理的间充质干细胞，即抗慢性炎症的间充质干细胞。[0039]实施例3.抗慢性炎症的间充质干细胞注射液的制备[0040]一种抗慢性炎症的间充质干细胞注射液，其包括以下组分:数量为5X1〇5〜2X1〇6个mL的LPS低氧预处理的间充质干细胞，质量体积比为1〜5%人血白蛋白，质量体积比为1〜8%甘露醇注射液，质量体积比为1〜5%复方维生素注射液，质量体积比为1〜5%的50%葡萄糖注射液和余量为生理盐水，其中所述抗慢性炎症的间充质干细胞为脂多糖和低氧预处理的间充质干细胞。[0041]如配制lOOtnL抗慢性炎症的间充干细胞注射液，该注射液包括人血白蛋白原液5mL质量体积比终浓度为1%、甘露醇注射液2mL、复方维生素注射液3mL、50%葡萄糖注射液5mL、生理盐水8f5mL、LPS低氧预处理的MSC。除LPS低氧预处理的MSC外，注射液其余成分需提前配制，并4°C预冷备用。MSC最终重悬注射液中，制成单细胞悬液，每毫升注射液中LPS低氧预处理的MSC的数量为5X1〇5〜2X1〇6个。该制备好的LPS低氧预处理的MSC在2〜1TC条件中，2小时内细胞保持为单细胞悬液状态，且细胞活力（台盼蓝染色计活力保持在95%以上。本发明所述质量体积比均代表质量g与体积ml的比例。[0042]实施例4.LPS低氧预处理的MSCs抑制巨噬细胞中NLRP3炎性小体的激活[0043]一、NLRP3炎性小体的激活[0044]将大鼠巨噬细胞RAW264.7细胞在添加10%的热灭活牛血清FBS和1%的青-链霉素高糖细胞培养基DMEM中在37°C，5%二氧化碳条件下培养;然后将巨噬细胞以5000个cm2的浓度接种在六孔盘上，2小时以后，用2ygmL的LPS在包含2%热灭活FBS的高糖约4•5gL细胞培养基DMEM里处理细胞5个小时，以此来创造炎性的环境，激活NLRP3炎性小体，诱导NLRP3的表达；用0.01MPBS冲洗巨噬细胞三遍并且在5mMATP里孵化30min来激活NLRP3炎性小体;再次在用〇•01M的PBS冲洗之后，将细胞用2%热灭活的FBS和1%青霉素-链霉素双抗PS在37°C、5%二氧化碳环境下在DMEM培养液里培养约48h直到进一步分析。[0045]二、LPS低氧预处理的MSCs和巨噬细胞联合培养[0046]将LPS低氧预处理的MSCs以10,000个cm2的浓度接种在六孔盘上并用完全培养液CCM培养24小时；用0.01M的PBS冲洗LPS低氧预处理的MSCs三遍，然后与巨噬细胞在巨噬细胞培养基中一起联合培养约16h。[0047]三、结果：[0048]LPS低氧预处理的MSCs抑制巨噬细胞里NLRP3炎性小体介导的胱冬肽酶-1caspase-1的激活和IL-1P的分泌。[0049]采用免疫印迹法测定胱冬肽酶-1的表达量，如图1右图所示，LPS低氧预处理的MSCs共同培养的巨噬细胞培养上清液中胱冬肽酶-1caspase-D的激活被明显抑制了。通过ELISA测量发现在上清液中的IL-W的水平也明显降低图1左图）。为了排除IL-1P可能从LPS低氧预处理MSCs分泌的可能，采用LPS和ATP刺激了LPS低氧预处理MSCs，但在上清中没有检测到IL-1I3。这表明NLRP3炎性小体在LPS低氧预处理MSCs没有被激活。所有这些数据表明LPS低氧预处理MSCs抑制巨噬细胞里NLRP3炎性小体的激活。[0050]实施例5.LPS低氧预处理的MSCs促进THP-1细胞向M2巨噬细胞表型的转变[0051]一、THP-1细胞的培养和处理[0052]从美国标准菌库购买人体单核细胞系THP-1。在添加10%的FBS的RPMI1640培养基里培养THP-1细胞。细胞在3\105-6父105^113此的密度下生长。之后，1'耶-1细胞在六孔板上和两种不同浓度（5和30mM的葡萄糖一起培养，并且通过佛波醇（ph〇rbol12-豆蔻酸12-myristate13-醋酸盐（13-acetate处理来分化诱导。三天后，用〇.〇im的PBS冲洗掉未粘连细胞三次。粘连细胞与LPS低氧预处理的MSCs干细胞数量为5X1〇5〜2X1〇6个mL进一步培养48小时。[0053]为了用荧光显微检查术追踪LPS低氧预处理的MSCs,细胞被Dil染色标记、在0.01M的PBS里4°C以100,000乂8的速度离心一个小时。之后，〇丨1标记的1^低氧预处理的]^〇3和THP-1细胞一起共同培养。6小时后，用Hoechst33342给细胞染色8分钟并且用0.01M的PBS冲洗。[0054]二、结果：[0055]LPS低氧预处理的MSCs可以促进THP-1细胞向M2巨噬细胞表型的转变[0056]高糖诱导巨噬细胞成为促炎型的状态，我们检测了LPS低氧预处理的MSCs对THP-1细胞的在高糖环境下的影响。如图2所示，RT-PCR结果显示在用LPS低氧预处理MSCs处理之后，THP-1细胞明显的产生了更多的抗炎细胞因子IL-l〇,TGF-0和M2巨噬细胞表面标记物CD163，并且减少了包括IL-1、IL-6和TNFa在内的促炎细胞因子的产生。不仅如此，荧光染色显示M2巨噬细胞的密度和分布明显增多，在LPS低氧预处理MSCs组，Ml巨噬细胞显著减少。综上所述，这些数据表明LPS低氧预处理的MSCs是巨噬细胞极化的平衡调节器并且促进巨噬细胞向M2而不是Ml分化。

权利要求：1.一种抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法，其包括的步骤为:a将间充质干细胞培养至70〜80%的融合，抽掉间充质干细胞培养皿中的培养基，用磷酸缓冲液冲洗所述间充质干细胞;b加入含5〇〜200ngmL脂多糖LPS的无血清培养基;然后c调节低氧状态至氧含量5〜10%，并将所述间充质干细胞在低氧状态下培养ie〜18小时。^2.如权利要求1所述的抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法，所述步骤b中所述无血清培养基中脂多糖浓度为50ngmL、100ngmL或200ngmL。3.如权利要求1所述的抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法，所述步骤c中所述氧含量为5%或者10%。4.如权利要求1-3任一所述的抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法，所述步骤b中无血清培养基为DMEM培养基。5.如权利要求1-3任一所述的抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法，所述培养条件为37°C、5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱。6.如权利要求1-3任一所述的抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法，所述间充质千细胞是脐带间充质干细胞。7.—种抗慢性炎症的间充质干细胞注射液，其包括以下组分:数量为5X105〜2X106个mL的抗慢性炎症的间充质干细胞，质量体积比为1〜5%的人血白蛋白、质量体积比为1〜5%的复方维生素、质量体积比为1〜8%的甘露醇、质量体积比为0.5〜2.5%的葡萄糖和余量的生理盐水，其中所述抗慢性炎症的间充质干细胞为脂多糖和低氧预处理的间充质干细胞。8.如权利要求7所述的一种抗慢性炎症的间充质干细胞注射液，所述抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法包括:a将间充质干细胞培养至70〜80%的融合，抽掉间充质干细胞培养皿中的培养基，用磷酸缓冲液冲洗间充质干细胞；b加入含50〜200ngniL脂多糖LPS的无血清培养基;然后c调节低氧状态至氧含量5〜10%，并将所述间充质干细胞在低氧状态下培养16〜18小时。9.如权利要求8所述的一种抗慢性炎症的间充质干细胞注射液，所述抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法的步骤b中所述无血清培养基中脂多糖浓度为5〇ngmL、100ngmL或200ngmL。10.如权利要求8所述的一种抗慢性炎症的间充质干细胞注射液，所述抗慢性炎症的间充质干细胞的制备方法的步骤c所述氧含量为5%或者10%。

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