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【发明授权】顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统_中国科学院武汉病毒研究所_201610976085.6 

申请/专利权人:中国科学院武汉病毒研究所

申请日:2016-11-07

公开(公告)日:2020-06-26

公开(公告)号:CN106544326B

主分类号:C12N7/01(20060101)

分类号:C12N7/01(20060101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2020.06.26#授权;2017.04.26#实质审查的生效;2017.03.29#公开

摘要:本发明提供了一个重组单纯疱疹病毒1型HSV‑1毒株H129衍生的H129‑derived顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统;所述示踪系统是一个重组单纯疱疹病毒1型HSV‑1毒株H129,包括两个或两个以上的荧光表达盒fluorescenceexpressioncassette,插入到H129基因组的不同位点,其中每个荧光表达盒包含至少两个拷贝的荧光蛋白编码序列fluorescentprotein‑encodingsequence,所述荧光蛋白编码序列前后排列,和至少一个连接子编码序列,两个荧光蛋白编码序列之间插入至少一个连接子编码序列,以便荧光蛋白编码序列和连接子序列转录成一个转录子;所述连接子编码序列编码一个连接子多肽;所述连接子多肽含有至少两个相邻氨基酸,他们间的肽键形成是非常低效的;因此,所述转录子被翻译时,由于所述连接子多肽阻碍肽键的形成,能够计量地产生至少两个非融合荧光蛋白。

主权项:1.重组单纯疱疹病毒1型HSV-1毒株H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统,其特征在于,所述H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统是一个重组单纯疱疹病毒1型HSV-1毒株H129,包括两个或两个以上的荧光表达盒,插入到H129基因组的不同位点,其中每个荧光表达盒包含至少两个拷贝的荧光蛋白编码序列,所述荧光蛋白编码序列前后排列,和至少一个连接子编码序列,两个荧光蛋白编码序列之间插入所述至少一个连接子编码序列,以便荧光蛋白编码序列和连接子编码序列转录成一个转录子;所述荧光表达盒中的至少两个拷贝的荧光蛋白编码序列中一个拷贝编码膜结合荧光蛋白,另一个拷贝编码不与膜结合的荧光蛋白,所述膜结合荧光蛋白编码序列和不与膜结合的荧光蛋白的编码序列表达相同的荧光蛋白;所述连接子编码序列编码一个连接子多肽;所述连接子多肽含有至少两个相邻氨基酸,他们间的肽键形成是非常低效的;所述至少两个相邻氨基酸是甘氨酸和脯氨酸;因此,所述转录子被翻译时,由于所述连接子多肽阻碍肽键的形成,能够计量地产生膜结合荧光蛋白和荧光蛋白。

全文数据:顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统技术领域[0001]本发明一般涉及神经生物学,并且更具体地涉及顺行anterograde跨多级突触、跨神经元的multi-synaptictransneuronal病毒示踪系统。背景技术[0002]绘制大脑连接组对了解大脑是如何工作来说是必不可少的。作为神经功能的基本单位,神经环路在宏观结构功能和微分子信号环路间起到桥梁的作用。然而,许多特定的功能神经环路的结构,包括组件,联接和分布,仍有待阐明。新的示踪技术和示踪工具,特别是病毒示踪工具,有助于发现新的环路和揭示已知的经典环路的新联结和功能。[0003]病毒示踪工具已经用于神经科学研究。狂犬病病毒RV和伪狂犬病病毒PRV的衍生病毒示踪工具可以逆行追踪神经环路从而标记输入神经网络(1。重组水泡口炎病毒VSV用于顺行或逆行跨突触环路示踪2,3。人单纯疱疹病毒1型HSV-1毒株H129H129是一个潜在的顺行跨突触神经环路的示踪工具4,5。[0004]然而,高效和高分辨率地绘制顺行输出神经环路的细节仍然是一个挑战。因此,开发具有高跨突触标记效率的顺行示踪工具是迫切需要的。发明内容[0005]本发明提供了一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV-1毒株H129衍生的(H129-derived顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统。在一个实施例中,所述H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统是一个重组单纯疱疹病毒1型HSV-1毒株H129,包括两个或两个以上的焚光表达盒fluorescenceexpressioncassette,插入到H129基因组的不同位点,其中每个荧光表达盒包含至少两个拷贝的荧光蛋白编码序列fluorescentprotein-encodingsequence,所述焚光蛋白编码序列前后排列,和至少一个连接子编码序列,两个荧光蛋白编码序列之间插入至少一个连接子编码序列,以便荧光蛋白编码序列和连接子编码序列转录成一个转录子;所述连接子编码序列编码一个连接子多肽;所述连接子多肽含有至少两个相邻氨基酸,他们间的肽键形成是非常低效的;因此,所述转录子被翻译时,由于所述连接子多肽阻碍肽键的形成,能够计量地产生至少两个非融合焚光蛋白。[0006]在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中,所述荧光表达盒包括一个启动子;所述启动子调节所述荧光蛋白编码序列和连接子编码序列的转录。[0007]在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中,所述启动子在神经元细胞中可操作,包括CMV启动子,SV40启动子,CAG启动子,EFla启动子,TH启动子,Synl启动子.[0008]在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中,所述在一个表达盒中的荧光蛋白编码序列编码相同的或不同的荧光蛋白。[0009]在所述重组HI29衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中,所述荧光蛋白编码序列编码一个由氨基酸序列(SEQIDN02代表的荧光蛋白,或其变体。[0010]在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中,所述荧光蛋白编码序列编码一个由氨基酸序列(SEQIDN04代表的膜结合绿色荧光蛋白mGFP,或其变体。[0011]在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中,所述连接子多肽含有的至少两个相邻氨基酸是甘氨酸和脯氨酸。[0012]在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中,所述连接子编码序列编码一个由氨基酸序列(SEQIDN06代表的多肽或其变体。[0013]在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中,所述荧光蛋白编码序列和连接子编码序列编码一个氨基酸序列(SEQIDN08或其变体。[0014]在所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统的另一个实施例中,进一步含有BAC序列。[0015]通过如下结合附图对优选实施例的详细描述,本发明的目的和优点是显而易见的。附图说明[0016]本发明的优选实施方案现在将参考附图进行说明,其中类似的附图标记表示相同的元件。[0017]图1所示的结构示意图(aH129-Wt基因组的结构示意图,(bH129-G1基因组结构示意图,(cH129-G3基因组结构示意图,(dH129-G4基因组结构示意图,(e构建pUS-F6,和f构建H129-BAC即H129-G1。[0018]图2所示:(aH129-G1单克隆的PCR验证结果;(b伴随病毒复制的GFP表达和细胞病变;(c通过Westernblot显示病毒蛋白;(dH129_wt和H129-G1生长曲线;(eH129_wt、HI29-G1、HI29-G3和HI29-G4在VER0细胞中的生长曲线。[0019]图3所示a图像和bH129-G1、H129-G3和H129-G4体外荧光强度。[0020]图4显示微流控系统的结构示意图。[0021]图5显示H129-G4在培养的神经元中的顺行传播;(a-bH129-G4的胞体进入和顺行标记;(c-dH129-G4顺行跨神经突触标记。[0022]图6显示用H129-G3示踪VPM-S1环路[0023]图7显示使用H129-G4绘制Ml区输出的信号。[0024]图8显示使用HI29-G4绘制树駒中Ml区输出的信号。[0025]图9显示使用H129-G4示踪视觉环路。[0026]图10显示使用H129-G4示踪嗅觉环路。具体实施方式[0027]可以通过引用以下的本发明的某些实施例的详细描述而更容易地理解本发明。[0028]在本申请中,为了更充分地描述本发明所涉及领域状态,当出版物被引用,这些出版物的公开内容的全部经引用而并入本申请。[0029]除非另有说明,在本发明的实践将采用分子生物学包括重组技术),微生物学,细胞生物学,生物化学,核酸化学和免疫学的现有技术,这些是在本领域的技能之内。这些技术在文献中已有完全解释,如分子克隆:实验室说明书,第三版(Sambrook和Russel,2001年);分子生物学当代程序FMAusubel等主编,1987年,包括补充至2001年)。[0030]单纯疱疹病毒1型HSV-1是一种普遍存在的、条件致病病原。其自然神经嗜性和跨神经突触的传播能力使其成为潜在的神经环路示踪工具。[0031]HSV-1毒株Mclntyre-B逆行传播,而HSV-1毒株H129优先顺行跨神经突触传播[6-8]。许多研究在不同的途径和不同的动物模型中的应用了这种病毒[6,9-12]。特别是,表达遗传改变的荧光蛋白(FP的H129的研发促使了探索该病毒株在顺行神经环路中的示踪[3,13]。然而,由于有限的标记强度,这些H129衍生的示踪工具无法让突触环路可视化,也无法显示神经元形态的细节[5,14][0032]本发明提供H129衍生的(H129-derived顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统,用于绘制跨多级突触、跨神经元的环路,所述H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统标记强度高,足以让精细神经结构可视化,包括神经元轴突纤维和树突棘,同时与荧光显微光学切片成像fMOST兼容。简而言之,H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的示踪系统是一个重组单纯疱疹病毒1型(HSV-1毒株H129,包括两个或两个以上的荧光表达盒fluorescenceexpressioncassette,插入到H129基因组的不同位点,其中每个焚光表达盒包含至少两个拷贝的焚光编码构件fluorescence-encodingconstruct,所述焚光蛋白编码序列前后排列,和至少一个连接子编码序列,两个荧光蛋白编码序列之间插入所述至少一个连接子编码序列,以便荧光蛋白编码序列和连接子序列转录成一个转录子;所述连接子编码序列编码一个连接子多肽;所述连接子多肽含有至少两个相邻氨基酸,他们间的肽键形成是非常低效的;因此,所述转录子被翻译时,由于所述连接子多肽阻碍肽键的形成,能够计量地产生至少两个非融合荧光蛋白。例如,当翻译由连接序列耦合的两荧光编码构件时,计量地产生两个荧光蛋白(而不是一个融合蛋白)。[0033]在一些实施例中,单纯疱疹病毒1型(HSV-1毒株H129具有一个大的基因组的6他&1^;1]734772.1。如图1&所示,!1129-¥七具有典型的单纯疱疹病毒的结构,包括一个单一的长序列和一个单一的短序列,每个独特组件两端分别是反向重复序列,因此可以形成4个同分异构体。[0034]在一些实施例中,焚光表达盒包括一个启动子,至少两个串联排列的焚光蛋白编码序列,以及至少一个连接子编码序列,在两个荧光蛋白编码序列之间插入至少一个连接子编码序列,以便荧光蛋白编码序列和连接子编码序列被转录为一个单一转录子。[0035]在一些实施例中,启动子可以是任何在神经元细胞中可操作的启动子。在一些实施例中,启动子包括CMV启动子,SV40启动子,CAG启动子,EFla启动子,TH启动子,Syn1启动子。[0036]在一些实施例中,适用于本发明的荧光蛋白编码序列可以是目前和未来在该领域中可用的任何荧光基因。荧光基因可以是野生型或重组变体物,只要他们的荧光强度没有减少。例如,焚光基因包括GFPgreenfluorescentprotein,eGFPenhancedgreenfluorescentprotein,mGFPmembraneboundformofEGFP,sfGFPsuperfoldergreenfluorescentprotein,EYFPenhancedyellowfluorescentprotein,ECFPenhancedcyanfluorescentprotein,EBFP2enhancedbluefluorescentprotein2,tdTomato,MRFPmonomerredfluorescentprotein,mCherry,Ypet,mK0,mkate,等等。在一些实施例中,在一个表达盒中的至少两个荧光蛋白编码序列可以是相同的或不同的。在一些实施例中,核苷酸序列(SEQIDNO1代表的荧光蛋白编码序列编码由氨基酸序列SEQIDNO2代表的绿色荧光蛋白(GFP。在一些实施例中,核苷酸序列(SEQIDNO3代表的荧光蛋白编码序列编码由氨基酸序列(SEQIDNO4代表的膜结合绿色荧光蛋白mGFP。在一些实施例中,它们的变体可以用;"变体"的定义为一个蛋白与一个由序列号代表的氨基酸序列有至少90%,优选95%,更优选98%,甚至更优选99%的同一性,只要变体中的变化不影响其功能。[0037]在一些实施例中,连接子编码序列编码一个连接子多肽,其中该连接子多肽包含至少两个相邻的氨基酸,在它们之间形成肽键是非常低效的。在一些实施例中,所述至少两个相邻的氨基酸是甘氨酸和脯氨酸。在一些实施例中,由一个核苷酸序列SEQIDN05所代表的连接子编码序列编码一个由氨基酸序列(SEQIDNO6代表的连接子多肽。在一些实施例中,它们的变体可以用;"变体"的定义为一个多肽与一个由序列号代表的氨基酸序列有至少90%,优选95%,更优选98%,甚至更优选99%的同一性,只要变体中的变化不影响其功能。[0038]在一些实施例中,至少两拷贝荧光蛋白编码序列和至少一个连接子编码序列由核苷酸序列(SEQIDN07代表,编码一个由氨基酸序列(SEQIDN08代表的多肽。在一些实施例中,它们的变体可以用;"变体"的定义为一个多肽与一个由序列号代表的氨基酸序列有至少90%,优选95%,更优选98%,甚至更优选99%的同一性,只要变体中的变化不影响其功能。[0039]在一些实施例中,荧光表达盒插入到H129基因组任何位点,只要插入不干扰病毒复制。在一些实施例中,插入位点位于任意两个相邻基因的非编码区。在一些实施例中,BAC骨架的插入位点是46616-46617,H129-G3中mGFP的插入位点是24671-24672。[0040]在一些实施例中,该重组H129基因组含有细菌人工染色体BAC序列;从而重组H129基因组可以在细菌中操作。BAC序列可以被插入到H129基因组的合适位点;例如,BAC序列插入到病毒基因组的46616-46617。大的病毒基因组可以保持在细菌人工染色体BAC上,便于在大肠杆菌内进行同源重组操作以达到插入或者缺失基因的目的,将其转染真核细胞能产生感染性病毒。[18,19][0041]实施例[0042]提供下面实施例的唯一目的是说明本发明的原理;它们决不旨在限制或缩小本发明的范围[0043]实施例1[0044]细胞和细胞培养[0045]VER0-E6细胞(VER0,ATCC#CRL-1586培养在Dulbecco培养基(DMEM含10%胎牛血清FBS和青霉素-链霉素100单位毫升青霉素和100微克毫升链霉素、Gibco。[0046]沿用常规程序,分离和培养来源于小鼠胚胎的海马神经元[20,21]。简而言之,在胚胎18.5天E18.5从C57BL6小鼠的幼崽中解剖出海马,切片,进一步用胰酶DNA酶I在37°C消化15分钟。分离的神经元用无菌汉克平衡盐溶液洗涤HBSS洗涤,悬浮和培养在添加了2%B27,glutamax25μπι和青霉素-链霉素(100单位毫升和100微克毫升)(GIBCO神经细胞基本培养基中。每隔一天换一次培养基。[0047]实施例2[0048]构建H129-G1[0049]将HSV-1-H129基因组克隆至带有绿色荧光蛋白基因的细菌人工染色体上,得到H129-BAC即H129-G1。如附图le和If所示,具体主要步骤如下:[0050]2.1H129-wt病毒基因组的提取[0051]用H129-wt病毒[22]以感染复数为1的病毒量感染VER0细胞,感染12小时后,刮下细胞,离心收集细胞沉淀,用solutionI10mMTris,10mMEDTA,pH8.0溶液清洗一遍,再用0.5ml的solutionI溶液(包含有0.25mgProteinaseKml美国Roche公司);0.6%十二烷基硫酸钠(SDS国药集团);终浓度为1M的氯化钠重悬细胞沉淀,50°C孵育2小时,加入终浓度为l〇mgml的RNaseI日本TaKaRa公司)37°C孵育1小时,最后再用酚氯仿(1:1进行抽提获得DNA沉淀,干燥后用一定量的无菌去离子水(lOOul重悬核酸沉淀。这样溶解后的DNA中含有大量的野生型的H129-wt病毒基因组DNA。[0052]2.2PCR分别扩增左右同源臂[0053]以野生型H129-wt病毒基因组为模版PCR分别扩增左右同源重组臂,其中左臂(L-arm序列全长1605bp,位于HSV-1-H129基因组(GenBank:GU734772.1中的No.45011-46616,右臂(R-arm序列全长1953bp,位于基因组中的No.46617-4857040?反应体系PrimeStarDNAPolymerase,TaKaRa公司)的总体积为50μ1,包含10μ15Xbuffer,4μ1dNTP,1.5yl正向引物,1·5μ1反向引物,0·5μ1PrimeStar酶,ΙμL模板,和31·5μ1水。其中左臂正向引物序列为:5'-cgggatccagactgacacattaaaaaacac-3'(SEQIDN09,左臂反向引物序列:为5'-cccaagcttataacttcgtataatgtatgctatacgaagttataacacggaaggagacaataccg-3'(SEQIDNO10,右臂正向引物序列为5'_cccaagcttataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattcagttagcctcccccatctc-3'(SEQIDNO11,右臂反向引物序列为:5'_cgggatcccttcggacctcgcgggggccgc-3'(SEQIDNO12。扩增条件为:194。〇2111;[11;298。015s;355°C15s;472°C2min;572°C10min;616°C10min;步骤2-4循环30次。然后将PCR产物进行1%琼脂糖(西班牙Biowest公司)凝胶电泳,纯化左右同源重组臂,纯化步骤完全按照试剂盒美国omega公司说明书来做。[0054]2.3连接左右同源臂[0055]将纯化后的左右臂DNA分别用限制性内切酶BamHITaKaRa公司)进行单酶切,酶切反应的总体积为50yl,DNA量为2yg,37°C水浴反应约4小时后,再用1%琼脂糖凝胶电泳进行纯化,所得酶切纯化后的左右同源臂DNA直接进行连接反应,其连接反应总体积为10μ1,包含ΙμLΤ4DNALigaseTaKaRa公司),1μ110Χbuffer,8yl左右臂DNA浓度比为1:1,16°C反应约4小时后,PCR扩增全长的左臂和右臂L+R,其PCR扩增反应总体积为50μ1,包含10μ15Xbuffer,4μ1dNTP,1·5μ1左臂正向引物(5'-cgggatccagactgacacattaaaaaacac-3SEQIDNO13,1·5μ1右臂反向引物(5'_cgggatcccttcggacctcgcgggggccgc_3'(SEQIDNO14,0·5μ1PrimeStar酶,ΙμL模板,31·5μ1水。扩增条件为:194°C2min;298°C15s;355。:15s;472°C4min;572°ClOmin;616°ClOmin;步骤2-4循环30次。用1%琼脂糖凝胶电泳纯化全长同源重组臂L+RDNA片段。[0056]2·4构建pUS-F6[0057]将上述纯化的全长同源重组臂(L+RDNA片段和环状pUS-F5SEQIDNO59载体分别用HindlllTaKaRa公司)限制性内切酶进行酶切;酶切反应的总体积为50μ1,包含2ygDNA,37°C水浴反应约4小时后,再用1%琼脂糖凝胶电泳,分别进行纯化;所得纯化的线性PUS-F5载体和L+RDNA片段进行连接反应,其连接反应总体积为10μ1,包含ΙμLT4DNALigaseTaKaRa公司),1μ110Χbuffer,4ylL+RDNA片段和4μ1线性pUS-F5载体;16°C反应约4小时后直接转化进感受态E.coliDH5a细胞中,37°C过夜培养,PCR鉴定及测序,带有左右臂同源序列的PUS-F5质粒命名为pUS-F6.[0058]2·5pUS-F6的线性化[0059]使用质粒抽提试剂盒美国Promega公司)提取pUS-F6质粒,得到环状的pUS-F6质粒后,接着用限制性内切酶为BamHI进行酶切反应;酶切反应的总体积为50μ1,包含2ygDNA,平行设置4管酶切反应,37°C水浴反应约4小时后,直接向每管酶切反应中加入2倍的无水乙醇和20μ1的醋酸钠3M,混匀后放-80°C大约10分钟,用少量的(20μ1无菌去离子水重悬DNA沉淀,最后使用NanoDrop2000美国ThermoScientific公司)测定其浓度。[0060]2·6将线性化PUS-F6质粒DNA转染至293T细胞[0061]转染前一天将细胞接种于6孔板后孵育过夜,转染当天细胞达到50-80%融合度。将2yg线性化pUS-F6质粒DNA与不含血清和抗生素的DMEM培养基(美国GIBC0公司)混匀,再加入10μ1转染试剂(SuperFectTransfectionReagent,德国Qiagen公司),室温孵育10-15分钟,将转染混合液加入6孔板,培养3-4小时后,PBS清洗一次,加入DMEM完全培养基GIBC0,C02培养箱中于37°C培养。[0062]2.7H129_wt病毒的感染[0063]上述步骤2.6的质粒转染5-6小时后,用H129-wt病毒感染293T细胞,感染复数为1-3Μ0Ι=1-3,即刻放入37°C,5%的C〇2培养箱ThermoScientific中培养。[0064]2.8流式细胞分选[0065]上述步骤2.7中病毒感染后24小时,在倒置荧光显微镜下(日本Nikon公司)观察绿色荧光蛋白的表达情况,若阳性率大于1%即可准备细胞的分选。首先用胰酶GIBC0消化293T细胞,PBS清洗一遍,然后用灭菌处理的300目滤膜过滤细胞悬浮液,将流过300目滤膜的293T细胞进行流式分选,GFP表达阳性的293T细胞单独分选出来,与铺好的VER0细胞共培养。[0066]2.9H129-G1重组病毒基因组DNA的制备[0067]上述步骤2.8中流式分选GFP阳性的293T细胞与VER0细胞共培养大约48小时后,观察绿色荧光蛋白的表达情况。当GFP阳性率大于20%,H129-G1重组病毒基因组DNA通过上述步骤2.1所描述的方法制备。[0068]2.10H129-G1感染性单克隆的初步筛选和鉴定[0069]将上述步骤2.9中制备的!1129-61重组病毒0祖电转化(1.61.81^,25沾,200〇,1mm进感受态细胞DH10B美国Invitrogen公司)中,涂布在含有氯霉素抗性科密欧公司)的LB平板,37°C中培养36-48小时。PCR鉴定单克隆,所有的PCR反应条件参照上述步骤2.2,鉴定的序列为H129-WT的基因,包括讥3、讥14、1^26、讥37、此38、讥50、1^3、1]58和US12,它们的引物分别是UL3-F:TCGGTTTGAAAGGCATCGSEQIDNO15,UL3-R:GACAAGGTCGCCATCTGCTSEQIDNO16;UL14-F:GGGCACGCGAGACTATCAGAGSEQIDNO17,UL14-R:TCATTCGCCATCGGGATAGTCSEQIDNO18;UL26-F:ATGGAGGAGCCCCTACCAGASEQIDNO19,UL26-R:TACCAAAGACCGGGGCGAATSEQIDNO20;UL37-F:TGGTAACTAGTTAACGGCAAGTCCGSEQIDNO21,UL37-R:ATGCCGGGACTTAAGTGGCCGTATASEQIDNO22;UL38-F:ATGAAGACCAATCCGCTACCCGCASEQIDNO23,UL38_R:AACACTCGCGTTTCGGGTTTCAGTSEQIDNO24;UL5〇-F:ATGAGTCAGTGGGGATCCGGSEQIDNO25,UL50-R:CCCGGAACGAACCCCAAGCTSEQIDNO26;US3-F:GCCAACGACCACATCCCTSEQIDNO27,US3R:CAGCGGCAAACAAAGCAGSEQIDNO28;US8-F:GGGGTTTCTTCTCGGTGTTTGSEQIDNO29,US8-R:GCGGTGCTGATGGTAATGTGSEQIDNO30;US12-F:AAATTGCCCTAGCACAGGGGSEQIDNO31,US12-R:GGTCTCTCCGGCGCACATAASEQIDNO32,以H129-WT阳性对照,鉴定结果如图2a所示。[0070]2.11拯救!1129-61感染性病毒[0071]转染前一天将VERO细胞传代至6孔板,待细胞融合度为80%左右。以上述步骤2.10中鉴定的H129-G1感染性单克隆的DNA转染VER0细胞。转染混合液的制备如下:2yg环状H129-G1DNA,10ylSuperFectTransfectionReagent,和无血清和抗生素的DMEM培养基配成1〇〇μ1混合液,室温放置5-10分钟后,再加入600μ1无血清和抗生素的DMEM稀释成转染混合液。去掉细胞培养基,用预热的PBS洗一遍细胞,然后直接加上转染混合液,置于细胞培养箱培养。2-3小时后,吸去转染混合液,用PBS清洗一次,最后加入DMEM完全培养基;H129-G1感染性单克隆转染后48小时后开始出现细胞病变现象,置于倒置荧光显微镜下观察,发现病变处都可以观察到绿色荧光,说明我们的感染性单克隆的拯救是成功的,如图2b所示。然后继续培养直到细胞全部病变后,收集细胞培养液,即获得H129-G1重组病毒,加入1%的DMS0于-80°C冻存。[0072]2.12检测重组病毒蛋白表达[0073]VER0细胞种在100mm培养皿中后,在37°C,5%C02条件下培养,待细胞完全贴壁后,分别用H129-wt病毒和H129-G1重组病毒以M0I=1感染细胞。37°C、5%⑶2培养箱中吸附2h后,用含2%胎牛血清的MEM培养基替换培养皿中的病毒接种液,感染24小时后,用胰酶消化细胞,收集细胞在l〇〇〇rmp离心5分钟。用预冷的PBS洗涤细胞一遍,继续离心去掉上清液。收集细胞沉淀放入液氮中冰冻10秒,作为检测样品,准备进行WesternBlot实验。[0074]WesternBlot实验的操作如下:往细胞沉淀中加入50μ1裂解缓冲液,利用超声破碎细胞,接着测定蛋白含量,加入5χ上样Buffer,按照同等蛋白量上样(20yg,进行SDS-聚丙稀酰胺凝胶PAGE电泳。之后进行转膜反应,先用甲醇处理尼龙膜2分钟,然后在转膜缓冲液中浸泡15分钟后,开始转膜。转膜条件为恒流200mA,90分钟(美国Bio-Red公司)。转膜完毕后,即刻用TBST液洗膜3分钟,再用5%的牛奶TBST封闭1小时。接着用TBST洗膜3次后,分别孵育gD和gB特异性的单克隆抗体美国Abeam公司),洗膜后孵育二抗后并再次洗膜。最后进行化学发光显影美国Alpha公司),结果如图2c所示。[0075]2.13H129-wt和重组病毒H129-G1的生长对比[0076]将VER0细胞传代至6孔板美国corning公司),细胞融合度为60-80%。待细胞完全贴壁后,用H129-wt和H129-G1感染复数MOI为0.1的病毒量分别感染细胞此时设为感染后Ο小时)。孵育2小时后换掉培养基。用DMEM完全培养基开始培养感染后的细胞;然后分别在病毒感染后不同时间点2,6,12,24,36,481!收取样本并保存于-80°:。当所有的病毒样品收集完成后按照以下步骤测定每个样本的病毒滴度。[0077]病毒滴度测定步骤如下:将VER0细胞传代至12孔板,待细胞长满,用培养基梯度稀释H129-wt和H129-G1病毒,每个浓度做3个重复,吸去12孔板里的培养基,PBS清洗一次,每孔加200μ1病毒液。1~1.5h后,吸去病毒液,PBS清洗3次,再补加2ml完全培养基含2%FBS培养24~48h,密切观察,直至最低浓度出现的噬斑数不再增加。弃去培养基,每孔中加入300μ1染色剂,孵育后,用双蒸水反复洗,然后数空斑计算滴度,结果如图2d所示。[0078]实施例3[0079]构建H129-G3[0080]基于H129-G1同源重组改造得到H129-G3。图1c显示H129-G3的结构构造。[0081]3·1Cassette构建[0082]通过PCR、酶切、连接、转化将zeoR克隆至载体pRK-GFP,构建CassetteCMVpromoter-GFP-ZeoR,正向引物为F:CGGGATCCCAAGTTTCGAGGTCGAGTGTC-SEQIDNO33,反向引物为R:GCGAATTCGGAACGGACCGTGTTGACAASEQIDNO34;同样的方法,将mGFP克隆至载体pRK-kan,构建CassetteCMVpromoter-mGFP-kanR,正向弓丨物为F:GCGTCGACATGCTGTGCTGTATGAGAAGSEQIDNO35,反向弓|物为R:CGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCSEQIDNO36〇[0083]3.2含有H129-G1的活化大肠杆菌细胞的制备[0084]⑴将含有H129-G1的E.coliDY380在含有相应抗性的LB固体平板上划线,32°C培养过夜;[0085]ii挑取单克隆放入5mlLB培养基中培养,摇床,32°C培养过夜;[0086]iii以1:100的比例将其转移到100ml液体培养基中,摇床,32°C培养,0D600值在0.4-0.6左右0.55-0.6最佳),大约需要3小时;[0087]iv42Γ水浴15分钟;[0088]v取出细菌悬浮液置于冰上10分钟左右;[0089]vi4000rpm,4°C,10分钟,离心去上清;[0090]vii用超纯水重悬细菌沉淀,4000rpm,4°C,10分钟,离心去上清;[0091]viii用含有10%的甘油重悬细菌沉淀,4000rpm,4°C,10分钟,离心去上清;[0092]ix重复步骤viii-遍。[0093]χ800μ1含有10%的甘油的纯净水重悬细菌沉淀,以8^1每管分装细菌悬浮液,液氮处理冷冻,放入-80°C冻存备用。[0094]3·3PCR扩增各cassettes[0095]PCR的反应体系(PrimeStarDNAPolymerase,日本TaKaRa公司)总体积为50μ1,包括10μ15Xbuffer,4yldNTP,1.5yl正向引物,1,5μ1反向引物,0·5μ1PrimeStar酶,ΙμL模板,31.5μ1水。引物序列如下表1所示。扩增条件为:l94°C2min,298°C15s,355°C15s,472°C3min,572°C10min,616°C10min,步骤2-4循环30次。然后将PCR产物进行1%琼脂糖西班牙Biowest公司)凝胶电泳,纯化步骤完全按照试剂盒美国Omega公司)说明书,最后用去离子水来洗脱DNA。[0096]表1.PCR扩增cassettes的正向和反向引物序列[0097][0098]3.4电转化CassettepRK-CMV-GFP-zeo和同源重组得到H129-G2[0099]将300ng的CassetteDNA约5-15μ1加入步骤2制备的含有H129-G1的活化大肠杆菌细胞中混匀;电击条件为:1.61.8kv,25uF,200Ω,1mm;电击完毕后迅速加入培养基混匀细菌并转移到1.5ml的EP管中在32°C培养1-2小时;将细菌均匀的涂布在固体LB平板含有相应筛选抗性),32°C培养36-48h;挑取单克隆进行PCR验证。[0100]3.5含有H129-G2的活化大肠杆菌细胞的制备[0101]制备含有H129-G2的活化大肠杆菌细胞的方法与步骤3.2相同。[0102]3.6电转化CassettepRK-CMV-GFP-kan和同源重组得到H129-G3[0103]电转化CassettepRK-CMV-GFP-kan和同源重组得到H129-G3的方法与步骤(3.4相似;在电转化中,用了在步骤3.5中制备的含有H129-G2的活化大肠杆菌细胞。[0104]3·7拯救H129_G3病毒[0105]将鉴定正确的含有H129-G3单克隆细菌细胞分别接种200ml的LB培养基,32°C培养过夜,然后用试剂盒购自丽公司)提取DNA,按照说明书操作,最后用100μΙ去离子水溶解。转染前一天将VER0细胞传代至6孔板,待细胞融合度为80%左右。以上述提取的DNA转染VER0细胞。转染混合液的制备如下:2yg环状H129-G3DNA,10ylSuperFectTransfectionReagent,和无血清和抗生素的DMEM培养基配成100μΙ混合液,室温放置5-10分钟后,再加入600μ1无血清和抗生素的DMEM稀释成转染混合液。去掉细胞培养基,用预热的roS洗一遍细胞,然后直接加上转染混合液,置于细胞培养箱培养。2-3小时后,吸去转染混合液,用PBS清洗一次,最后加入DMEM完全培养基;H129-G3感染性单克隆转染后48小时后开始出现细胞病变现象,置于倒置荧光显微镜下观察,发现病变处都可以观察到绿色荧光,说明我们的感染性单克隆的拯救是成功的,如图2b所示。然后继续培养直到细胞全部病变后,收集细胞培养液,即获得HI29-G3重组病毒,加入1%的DMS0于-80°C冻存。[0106]实施例4[0107]构建H129-G4[0108]基于H129-G1构建H129-G4。[0109]4.1敲除BAC序列左端的loxp序列[0110]4.1.1PCR扩增Cassettekan,即kanR基因,模板来源于质粒PGBK-T7Clonetech,K1612_l,用于替换BAC序列左端的loxp及camR基因,正向引物(F为:tttattgccgtcatagcgcgggttccttccggtattgtctccttccgtgttcgctcagaagaactcgtcaagaaggcSEQIDNO41;反向引物(R为:cgggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatgattgaacaagatggattgcacgcSEQIDNO42;PCR反应体系(PrimeStarDNAPolymerase,TaKaRa公司)总体积为50μ1,包括10μ15Xbuffer,4yldNTP,1.5yl正向引物,1·5μ1反向引物,0·5μ1PrimeStar酶,ΙμL模板,31·5μ1Η20。扩增条件为:194°C2min,298°C15s,355°C15s,472°Clmin,572°C1〇111;[11,616€10111;[11,步骤2-4循环30次。然后将?0?产物进行1%琼脂糖(西班牙13;[0¥681:公司)凝胶电泳,纯化步骤完全按照试剂盒美国Omega公司)说明书来做,最后用30μ1去离子水来洗脱DNA。[0111]4.1.2含有H129-G1的活化大肠杆菌细胞的制备[0112]制备含有H129-G1的活化大肠杆菌细胞的方法与步骤3.2相同。[0113]4.1.3电转化Cassettekan,同源重组得到H129-BAC-DLloxp克隆[0114]电转化Cassettekan和同源重组得到H129-BAC_DLloxp克隆的方法与步骤3.4相似;在电转化中,用了在步骤4.1.ii中制备的含有H129-BAC的活化大肠杆菌细胞。PCR鉴定,正向引物(F为:caacacccgtgcgttttattcSEQIDN043,反向引物(R为:gtaagaggttccaactttcaccSEQIDNO44.[0115]4·2构建H129-BAC-mGFP-2A-GFP,敲除BAC序列右端的loxp序列[0116]4·2·1构建CassetteCMV-promoter-mGFP-2A-GFP_ZeoR,用于替换BAC序列右端的loxp序列和SV4〇-promoter_GFP[0117]构建载体pRK-GFP-zeo:在载体pRK-GFP的BamHI和EcoRI之间插入抗性基因zeocin,zeocin有独立的EM7启动子;正向引物(F为:cgggatcccaagtttcgaggtcgagtgtcSEQIDNO45;反向引物(R为:gcgaattcggaacggaccgtgttgacaaSEQIDNO46。构建载体pRK-mGFP-2A-GFP_zeo:在载体pRK-GFP-zeo的HindΙΠ和SalI之间插入mGFP_2A序列去掉了mGFP的终止密码子);正向引物(F为:cccaagcttatgctgtgctgtatgagaagSEQIDNO47;反向引物(R为:cggtcgactgggccaggattctcctcgacgtcaccgcatgttagcagacttcctctgccctccttgtacagctcgtccSEQIDNO48〇[0118]4·2·2PCR扩增CassetteCMV-promoter-mGFP-2A-GFP-ZeoR[0119]模板为质粒pRK-mGFP-2A-GFP_zeo,正向引物F为:aggtaccttctgaggcggaaagaaccagctgtggaatgtgtgtcagttagacattgattattgactagttattaatagSEQIDNO49;反向弓|物R为:tctgcgacctggcgcgcacgtttgcccgggagatgggggaggctaactgaggaacggaccgtgttgacaattaatcSEQIDNO50;PCR的反应和DNA产物的纯化与步骤4.1.1类似。[0120]4.2.3含有H129-BAC-DLl〇xp的活化大肠杆菌细胞的制备[0121]制备含有H129-BAC-DLl〇xp的活化大肠杆菌细胞的方法与步骤3.2相同。[0122]4.2.4电转化,同源重组得到H129-BAC-mGFP-2A-GFP克隆[0123]电转化CassetteCMV-promoter-mGFP-2A-GFP-ZeoR和同源重组得到H129-BAC-mGFP-2A-GFP克隆的方法与步骤(3.4相似。PCR鉴定,正向引物(F为:acctctgaaagaggaacttggSEQIDNOf51,反向引物(R为:gatggtccagacccacgtcacSEQIDNO52.[0124]4·3构建H129-mGFP-2A-GFP-BAC-mGFP-2A-GFP即H129-G4[0125]4·3·1构建CassetteCMV-promoter-mGFP-2A-GFP-camR[0126]在载体pRK-mGFP-2A_GFP-zeo的BamHI之后插入抗性基因cam,cam有独立的cat启动子;正向引物(F为:cgggatcctgatcggcacgtaagaggttcSEQIDNO53,反向引物(R为:cgggatccttacgccccgccctgccactcatSEQIDNO54〇[0127]4.3·2PCR扩增CassetteCMVpromoter-mGFP-2A-GFP-camR[0128]模板为质粒pRK-mGFP-2A-GFP_cam,正向引物F为:caaagaatggatgggaggagttcaggaagccggggagagggcccgcggcgacattgattattgactagttattaatagSEQIDNO55;反向弓|物R为:ccgcaccaacccgccagaagagccaaagtcaacacaacaacgccttaaatgtgatcggcacgtaagaggtt^&33細010从)56;?〇?的反应和0嫩产物的纯化与步骤4.1.1类似。[0129]4.3.3含有H129-BAC-mGFP-2A-GFP的活化大肠杆菌细胞的制备[0130]制备含有H129-BAC-mGFP-2A-GFP的活化大肠杆菌细胞的方法与步骤3.2相同。[0131]4.3.4电转化,同源重组得到H129-G4克隆[0132]电转化CassetteCMVpromoter-mGFP-2A-GFP-camR和同源重组得到H129-G4克隆的方法与步骤(3.4相似。PCR鉴定,正向引物(F为:cggaaaccaaagaaggaagcSEQIDN057,反向引物(R为:gggagcccaacaaacagcacSEQIDNO58.[0133]4.3.5拯救!1129-64病毒[0134]拯救H129-G4病毒的操作与步骤3.7相同。[0135]4.3.6HI29-wt和重组病毒的生长对比[0136]生长曲线对比的操作参照步骤(2.13。现参照图2e,图示H129-wt,H129-Gl,H129-G3和H129-G4在VER0细胞中生长曲线。H129-wt,-Gl,-G3or-G4感染VER0细胞的M0I为3,在指定的时间的上清液中的子代病毒,由空斑形成试验标准检测。所显示的是从3个独立实验的平均值标准差)。如图2e所示,H129-wt,-Gl,-G3or-G4的复制动力学相似,这表明在H129基因组插入位置灵活。[0137]实施例5[0138]H129-G1,H129-G3和H129-G4在VER0细胞中的荧光强度[0139]现参照图3,(a图像显示和b图示H129-G1,H129-G3和H129-G4的体外荧光强度。H129-G1,H129-G3和H129-G4感染VER0细胞的Μ0Ι为1,感染后24小时观察GFP信号。在相同条件下拍摄的图像。比例尺=50μπι,如图3b所示,H129-G4是H129-G1的5.3倍,H129-G3是H129-G1的2.3倍;这意味着荧光强度并不是一个荧光基因的简单相加。[0140]实施例6[0141]微流体装置[0142]现参照图4,给出了微流体装置的原理结构示意图。如图4所示,微流体装置包括两分离培养室,由多个微通道的连接,所述多个微通道只允许轴突生长通过,但是完全阻碍树突。微流体装置的制作按照先前描述的程序[21,23,24]。[0143]实施例7[0144]在微流体装置中培养神经细胞[0145]在微流体装置中培养神经元,新鲜分离的鼠胚海马神经元(2.5χ106,500μ1培养基被植入一个腔室(图5a和b中的蓝腔)(第1天)。双室培养,在第5天的时候,当第一批植入的神经元的轴突长入微通道时,一批新的神经元2.5χ106,250μ1加入到相反腔室(图5c和d中的红腔)。每天更新培养基,在传出和传入端室的体积始终分别保持在500μ1和250μ1。为了引导轴突在微通道中定向生长,较高的静水压力是由传出室较大的介质体积产生;为了防止轴突逆行生长,减少4天后接种神经元的数量第5天)。感染时,H129-G4被加入到如图5a和c所示的任意一个腔室,在指定的时间点达到终浓度为lxl07pfuml。为了避免病毒扩散到相反腔室,在感染腔室中的介质体积保持小于相反腔室的一半。在感染24小时后hpi获取图像。[0146]实施例8[0147]脑内注射病毒[0148]用立体定位系统,在BSL-2动物实验室,按照批准的S0P,对成年野生型C57BL6,DAT-Cre小鼠,PV-Cre小鼠,和树駒进行脑内注射病毒。DAT-Cre转基因小鼠在多巴胺DA神经元中特异表达Cre重组酶,表达受多巴胺转运体DAT启动子的控制;PVCre转基因小鼠在PV中间神经元表达Cre重组酶。都是C57BL6背景。麻醉动物的脑内注射病毒用到机动立体定向器(StoeltingCo.。根据小鼠脑立体定位图谱,用内外侧ML,前后AP和背腹DV与Bregma的距离测定小鼠核团的确切位置7;树駆]核团的坐标根据树調脑立体定位图谱决定8。当有注明时,AlexaFluor594共辄霍乱毒素B亚单位CTBInvitrogen是随着注入病毒。注入细节列在表1中。[0149]表1.注射位点和H129衍生的示踪系统[0150][0151]*双耳代替AP[0152]脑内注射病毒,应用到8-10周龄的雄性小鼠和成年雄性树駒时,没有随机化或致盲。病毒注射后每天监测动物,如果观察到严重的疾病,实验将被终止,动物将被排除在外。[0153]实施例9[0154]双光子荧光显微光学切片成像fMOST[0155]fMOST成像标本嵌入Tcchnovit®9100甲基丙稀酸甲酯(MMA,ElectronMicroscopySciences,如前所述([27]。简而言之,PFA固定的动物大脑用0.01MPBS冲洗12h,用一系列醇50%,75%,95%,100%和100%的乙醇,每个浓度2h完全脱水,接着浸泡在二甲苯两次每次2h以至透明。然后渗透标本,转移到明胶胶囊和浸渍在聚合溶液中。最后,带试样的胶囊被封闭和保存在干燥室,暗处,4°C,72h。聚合完成后,使用fMOST系统全脑成像,数据采集率的像素大小为〇·5μπιX0·5μπιXΙμπι[28]。最后,对获得的数据集的图像叠加转化为大数据,应用Amira软件VisageSoftware,USA进行三维图像重建[29]。[0156]实施例10[0157]HI29-G4在培养的神经元中的顺行传播[0158]现参照图5,显示H129-G4在培养的神经元中的顺行传播。(a-bH129-G4的胞体进入和顺行标记。新鲜分离的小鼠胚胎海马神经元接种到微流体装置的一个腔室,开始24h称之为1天,在第8天,H129-G4加到胞体(蓝色)或轴突终端腔室(红色)至终浓度107pfumla。左和右图分别显示胞体和轴突的终端侧感染的代表结果。GFP信号图像上图)和相位对比(下图),感染后24小时hpi。虚线表示腔室和微通道之间的边界。标尺,100μπιb。(c-dH129-G4顺行跨神经突触标记。神经元依次在第1天和第5天分别接种到两个腔室,然后在第12天H129-G4添加到传出(蓝色)或传入室(红色)至终浓度107pfumlc。左和右图分别显示传出和传入侧感染的代表结果。GFP信号图像(上图)和相位对比(下图),感染后24小时。虚线表示腔室和微通道之间的边界。尺度杆,100μπιd。[0159]当H129-G4添加到胞体侧(图5a,神经元及其轴突,感染后24小时hpi显示GFP标记(图5b。然而,当病毒被添加到轴突终端侧时,没有绿色荧光蛋白标记的神经元被观察到(图5b,右图)。这些数据表明,H129-G4只在特定的病毒剂量特定的观测时间微乎其微地通过神经远末端感染神经元。[0160]当H129-G4添加到传出神经元,H129-G4能够通过在微通道内的轴突传播和用GFP标记相反腔室的传入神经元(图5d,左侧图)。然而,当H129-G4添加到传入腔室内,只在同一腔室内观察到GFP阳性神经元,在传出腔室无神经元标记(图5d,右面图)。这些数据表明,H129-G4在微流体装置所培养的神经元之间,在特定的病毒剂量特定的观测时间以一种严格的顺行跨突触的方式传播。[0161]实施例11[0162]使用HI29-G3示踪VPM-S1环路的时间过程[0163]现参照图6,显示使用H129-G3示踪VPM-S1环路的时间过程。(aVPM-Sl环路架构。VPM,丘脑腹后内侧核;nRT,网状丘脑核;S1,初级体感皮层;L4和L6,皮质IV和VI层。(c-gH129-G3示踪VPM-S1环路的代表结果。H129-G3lxl06PFU,300nl和AlexaFluor594共辄CTBCTB,红色),被注入到野生型C57BL6小鼠的VPM。显示感染后第2c,3d,4e和5f的示踪结果。框内区域被放大并呈现在右图上。在cl中分散的GFP阳性神经元为白色箭头指示。(h-个有代表性的GFP标记的单神经元。感染后第4天,在S1,一个锥体神经元树突树被完整的标记。显示心尖段hi和h2和基底树突h3的放大图像。[0164]H129-G3106pfu,300nl和AlexaFluor594标记霍乱毒素B亚单位CTB-起注入VPM,标示注射部位和通过轴突末端吸收逆行标记神经元胞体。通过感染时间过程的确定,我们评估了H129-G3的标记方向、效率、和跨突触传播。在接种病毒后2天2dpi,CTB红色)和GFP双阳性细胞存在于注射部位。在附近的nRT也观察到GFP阳性神经元(图6c。在接种病毒后3天,除了在nRT的GFP信号外(图6d,在皮层观察到少量的GFP阳性神经元(图6dl〇在接种病毒后4天,两个分离的细胞群在同侧S1明显标记:GFP阳性细胞群在L4和CTB标记的细胞群在L6。两个细胞群之间没有重叠(图6e。这些数据表明,H129-G3顺行和跨突触地标记L4神经元,但不经过在VPM的轴突末梢逆行标记L6神经元。在次级体感皮层的L4也观察到较小的GFP阳性细胞群S2图6f,提示可能直接VPM-S2投射。在接种病毒后5天,H129-G3蔓延到其他皮质层包括L6图6g,而CTB阳性细胞保留在L6。这些结果证实,H129-G3是跨神经元的,多突触的,和严格地顺行。[0165]一个有代表性的锥体神经元,有很好的标记的顶端和基底树突显示在图6h,其中个别树突棘可以很容易地在GFP信号的基础上检测到。值得注意的是,虽然H129-G3标记强度足够让神经元结构可视化,但是,它是不够的,因为单个轴突不是清晰可辨。[0166]实施例12[0167]使用H129-G4绘制Ml投射输出信号[0168]现参照图7,显示使用H129-G4绘制Ml投射输出信号。(a对Ml投射环路架构。Ml,初级运动皮层;contMl,对侧Ml;S1,初级躯体感觉皮层;PRh,边缘皮层;STh,丘脑底核;CPu,尾状核。(b-cMl投影示踪的代表结果。!1129-64106?如,200111被注入到野生型0578176小鼠的Ml,在病毒感染后第4天,获取脑冠状切片图像。框内区域显示具有较高的放大倍率。dH129-G4标记的单个神经元代表。显示一个具有代表性的在PRh内GFP标记的神经元,具有个体棘dl和d2和轴突(d3的树突段的放大图像在右边显示。(e-jfMOST和H129-G4示踪相结合。在病毒感染后第4天获取的大脑进一步处理至fMOST成像。全脑的三维图像重建e。[神经支配的代表性脑区,包括contMlf、纹状体g和SIh,显示其细节。同时显示在同侧SIi和contMlj的单个神经元代表。[0169]初级运动皮层Ml是主要的皮层区域,生成并发送运动控制信号至下游靶点。自Ml的直接投射已经被很好的定义(图7aA129-G4应用于该途径来验证其顺行示踪能力和效率。野生型0578176小鼠在脑内組区域注射!1129-64106?作,200111,然后在病毒感染后第4天检查。在Ml的注射位置,HI29-G4标记大量的神经元。在对侧Ml有相当一批神经元也被标记(图7b-c。此外,连接双侧Ml的纤维清晰可见(图7b2。在同侧S1也观察到GFP标记的神经元(图7c2,反映出从Ml投影到SUM1神经支配的其他脑区也被标记,包括丘脑、丘脑下核(STh,边缘皮层(PRh,和尾壳核(CPu数据未显示)。除了宏观环路示踪,H129-G4还揭示了神经元的详细结构(图7d。[0170]荧光显微光学切片成像fMOST是一个功能强大的高通量成像系统,自动重建全脑神经环路,达到亚微米级的高分辨率[30]。到目前为止,H129-G4是唯一顺行跨突触病毒示踪系统,标记强度高到足够应用fMOST。重建全脑fMOST图像所显示的H129-G4的一般追踪和标记模式(图7e与激光共聚焦显微镜检测一致(图7b-d。在接种的Ml,对侧Ml图7f,和同侧S1图7h,一大群神经元被标记。突出的轴突纤维也清晰可见(图7g。即使在长距离区域,H129-G4仍然稀疏标记神经元,具有高荧光强度,可以获得单神经元及其突起的详细结构(图7i-j。因此,H129-G4是一种高效的顺行跨多级突触病毒示踪工具,一般可用于示踪神经环路和绘制连接组。[0171]实施例13[0172]使用H129-G4绘制树駒Ml投射输出信号[0173]现参照图8,显示使用H129-G4绘制树駒Ml投射输出信号。(a小鼠和树駒脑比较。在灌注、固定和脱水后,成年小鼠和树駒脑的前左或侧视图(中)。(b-gH129-G4示踪树駒Ml投影输出结果。H129-G42X106pfu,300nl与CTB红色一起注射到树駒Ml,在病毒感染后第6天获取大脑。显示冠状脑切片的有代表性的图像,框内区域显示具有较高的放大倍率。(hHI29-G4标记的树駆]单个神经元。显示注射周围的一个代表性的GFP标记的神经元,右边显示被放大的顶端hl-h3和基底树突h4。[0174]树駆]Tupaiabelangerichinensis,一个较小的尺寸原猴亚目灵长类动物,在行为、解剖、基因组和进化水平更接近于其他灵长类动物而不是啮齿类动物[26]。它的大脑结构和神经元环路也更类似于其他灵长类动物而不是啮齿类动物。到目前为止,没有病毒示踪系统,跨神经突触地绘制树駒的神经环路。测试在树駒的适用性,HI29-G4与CTB-起脑内注射到树駒脑Ml。由于树駒脑比老鼠的大脑体积大(图8a,注入的病毒量增加到2X106pfu,300nl。在感染后第6天(图8b,GFP和CTB同时标记注射部位。类似于小鼠Ml输出,GFP标记的细胞在对侧Ml,SI,CPu图8d-e、丘脑(图8f-g中也观察到。有趣的是,H129-G4注射到树駒脑Ml导致GFP阳性细胞出现在梨状皮质中(Pir图8c,;[1^瓜瓜1丨3七3足(11?1图83-1,屏状核:1和初级视觉皮层¥1图88,而这些大脑区域在小鼠中未被标记。H129-G4标记强度在树駒比小鼠降低,但仍足以揭示单个神经元的结构(图8h,包括的心尖和基树突。[0175]实施例14[0176]使用H129-G4示踪视觉环路[0177]现参照图9,显示使用H129-G4示踪视觉环路。(a老鼠视觉环路架构。LGN,外侧膝状体核;LP,丘脑后外侧核;SC,上丘;VI和V2,初级和次级视皮层;(b-dH129-G4示踪视觉环路代表结果。11129-64106?如,以1注入野生型0578176小鼠的视网膜下,图像在感染后第6天获得。显示在LGN和LPb以及视觉皮层c的代表图像,框内区域相应地放大。[0178]实施例15[0179]使用H129-G4示踪嗅觉环路[0180]现参照图10,显示使用H129-G4示踪嗅觉环路。(a小鼠嗅觉环路的架构。Μ0Β,主嗅球;GCL,颗粒细胞层;MCL、僧帽细胞层;AON,前嗅核;APC,前梨状皮层;PPC,后梨状皮质;(b-fH129-G4示踪嗅觉环路代表结果。!1129-64106?化,200111注射到野生型0578176小鼠GCL,图像在感染后第4天获取。显示MOBb,A0Nc,APCd、PPCe和Amyf的代表图像,框内区域被放大。[0181]尽管本发明参照特异的实施方式来描述,但是将被理解的是,实施例是说明性的,本发明的范围并不局限于此。本发明的替代实施例对本发明涉及的领域的普通技术人员将变得显而易见。这样的替代实施例都被认为是包含在本发明的精神和范围之内。因此,本发明的范围由所附的权利要求被描述,由前面的描述所支持。[0182]参考文献[0183]l.NassiJJ,CepkoCL,BornRT,BeierKT.2015.Neuroanatomygoesviral!FrontNeuroanat9:80.[0184]2.BeierKT,SaundersAB,OldenburgIA,SabatiniBL,CepkoCL.2013.Vesicularstomatitisviruswiththerabiesvirusglycoproteindirectsretrogradetranssynaptictransportamongneuronsinvivo.FrontNeuralCircuits7:11.[0185]3.BeierKT,SaundersA,01denburgIA,MiyamichiK,AkhtarN,LuoL,ffhelanSP,SabatiniB,CepkoCL.2011.AnterogradeorretrogradetranssynapticlabelingofCNSneuronswithvesicularstomatitisvirusvectors.ProcNatlAcadSciUSA108:15414-15419.[0186]4.McGovernAE,DriessenAK,SimmonsDG,PowellJ,Davis-PoynterN,FarrellMJ,MazzoneSB.2015.Distinctbrainstemandforebraincircuitsreceivingtrachealsensoryneuroninputsrevealedusinganovelconditionalanterogradetranssynapticviraltracingsystem.JNeurosci35:7041-7055.[0187]5.LoL,AndersonDJ.2011.ACre-dependent,anterogradetranssynapticviraltracerformappingoutputpathwaysofgeneticallymarkedneurons.Neuron72:938-950.[0188]6.ZemanickMC,StrickPL,DixRD.1991.Directionoftransneuronaltransportofherpessimplexvirus1intheprimatemotorsystemisstrain-dependent.ProcNatlAcadSciUSA88:8048-8051.[0189]7.LaVailJH,ToppKS,GiblinPA,GarnerJA.1997.Factorsthatcontributetothetransneuronalspreadofherpessimplexvirus.JNeurosciRes49:485-496.[0190]8.SunN,CassellMD,PerlmanS.1996.Anterograde,transneuronaltransportofherpessimplexvirustype1strainH129inthemurinevisualsystem.JVirol70:5405-5413.[0191]9.BarnettEM,EvansGD,SunN,PerlmanS,CassellMD.1995.Anterogradetracingoftrigeminalafferentpathwaysfromthemurinetoothpulptocortexusingherpessimplexvirustype1.JNeurosci15:2972-2984.[0192]lO.RinamanL,SchwartzG.2004.Anterogradetransneuronalviraltracingofcentralviscerosensorypathwaysinrats.JournalofNeuroscience24:2782-2786.[0193]11.KellyRM,StrickPL.2003.Cerebellarloopswithmotorcortexandprefrontalcortexofanonhumanprimate.JNeurosci23:8432-8444.[0194]12.ArchinNM,AthertonSS.2002.RapidspreadofaneurovirulentstrainofHSV-1throughtheCNSofBALBcmicefollowinganteriorchamberinoculation.JNeurovirol8:122-135.[0195]13.BeierKT,MundellNA,PanYA,CepkoCL.2016.AnterogradeorRetrogradeTranssynapticCircuitTracinginVertebrateswithVesicularStomatitisVirusVectors.CurrProtocNeurosci74:12621-212627.[0196]14.McGovernAE,Davis-PoynterN,RakoczyJ,PhippsS,SimmonsDG,MazzoneSB.2012.AnterogradeneuronalcircuittracingusingageneticallymodifiedherpessimplexvirusexpressingEGFP.JNeurosciMethods209:158-167.[0197]15.WadsworthS,JacobRJ,RoizmanB.1975.AnatomyofherpessimplexvirusDNA.II.Size,composition,andarrangementofinvertedterminalrepetitions.JVirol15:1487-1497.[0198]16.DeliusH,ClementsJB.1976.Apartialdenaturationmapofherpessimplexvirustype1DNA:evidenceforinversionsoftheuniqueDNAregions.JGenVirol33:125-133.[0199]17.HeB,ChouJ,BrandimartiR,MohrI,GluzmanY,RoizmanB.1997.Suppressionofthephenotypeofgamma134.5-her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权利要求:1.重组单纯疱疹病毒1型HSV-1毒株H129衍生H129-derived的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统,其特征在于,所述H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统是一个重组单纯疱疹病毒1型HSV-1毒株H129,包括两个或两个以上的荧光表达盒fluorescenceexpressioncassette,插入到H129基因组的不同位点,其中每个焚光表达盒包含至少两个拷贝的焚光蛋白编码序列(fluorescentprotein-encodingsequence,所述荧光蛋白编码序列前后排列,和至少一个连接子编码序列,两个荧光蛋白编码序列之间插入所述至少一个连接子编码序列,以便荧光蛋白编码序列和连接子编码序列转录成一个转录子;所述连接子编码序列编码一个连接子多肽;所述连接子多肽含有至少两个相邻氨基酸,他们间的肽键形成是非常低效的;因此,所述转录子被翻译时,由于所述连接子多肽阻碍肽键的形成,能够计量地产生至少两个非融合荧光蛋白。2.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统,其特征在于,所述荧光表达盒包括一个启动子;所述启动子调节所述荧光蛋白编码序列和连接子序列的转录。3.根据权利要求2所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统,其特征在于,所述启动子在神经元细胞中可操作,包括CMV启动子,SV40启动子,CAG启动子,EFla启动子,TH启动子,Synl启动子。4.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统,其特征在于,所述在一个表达盒中的荧光蛋白编码序列编码相同的或不同的荧光蛋白。5.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统,其特征在于,所述荧光蛋白编码序列编码一个由氨基酸序列(SEQIDNO2代表的荧光蛋白,或其变体。6.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统,其特征在于,所述荧光蛋白编码序列编码一个由氨基酸序列(SEQIDNO4代表的膜结合绿色荧光蛋白mGFP,或其变体。7.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统,其特征在于,所述连接子多肽含有的至少两个相邻氨基酸是甘氨酸和脯氨酸。8.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统,其特征在于,所述连接子编码序列编码一个由氨基酸序列(SEQIDNO6代表的多肽或其变体。9.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统,其特征在于,所述荧光蛋白编码序列和连接子编码序列编码一个氨基酸序列(SEQIDNO8或其变体。10.根据权利要求1所述重组H129衍生的顺行跨多级突触、跨神经元的病毒示踪系统,其特征在于,进一步含有BAC序列。

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