申请/专利权人：孙镧

申请日：2017-04-05

公开（公告）日：2020-06-30

公开（公告）号：CN107267578B

主分类号：C07K14/805(20060101)

分类号：C07K14/805(20060101)

优先权：["20160405 CN 2016102082039"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.06.30#授权;2017.11.17#实质审查的生效;2017.10.20#公开

摘要：本发明公开了通过微生物发酵生产N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖和或D‑氨基葡萄糖盐的方法。该方法主要通过在微生物内表达透明颤菌血红蛋白，以更高效率和更高产量生产N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖和或D‑氨基葡萄糖盐。

主权项：1.一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物用编码透明颤菌血红蛋白的核酸序列的重组核酸分子转化，编码透明颤菌血红蛋白的核酸序列含有增加透明颤菌血红蛋白的活性的遗传修饰，所述遗传修饰为在对应于氨基酸序列SEQIDNO：61的第45位甲硫氨酸被亮氨酸取代、第86位半胱氨酸被甘氨酸取代和第95位酪氨酸被丝氨酸取代；和B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖。

全文数据：微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和或D-氨基葡萄糖盐的方法技术领域[0001]本发明属于微生物发酵领域。具体地说，本发明涉及微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖以及进一步制备D-氨基葡萄糖盐的方法。背景技术[0002]N-乙酰-D-氨基葡萄糖N-Acetyl-D-glucosamine，NAG或GlcNAc，又称N-乙酰-氨基葡萄糖、N-乙酰葡糖胺，是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，在生物体内具有重要生理功能。N-乙酰-D-氨基葡萄糖在临床上可用于:增强人体免疫系统的功能；抑制恶性肿瘤或纤维细胞的生长;有效治疗各种炎症;作为糖尿病患者低热量甜味剂和婴幼儿食品添加剂等。水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖可用于生产D-氨基葡萄糖盐酸盐，后者可作为抗癌、防癌、降血脂、降血压的食品补充剂，是目前壳多糖保健食品系列中第三代保健功能性食品添加剂。此外，N-乙酰-D-氨基葡萄糖在医药行业中是合成抗癌药物氯脲霉素的主要原料；作为生化试剂还可用作抗细菌感染的免疫佐剂和人体抗流感病毒的活化剂。[0003]当今世界各地，有大量患者忍受不同程度关节炎痛苦，仅美国就有3300万人忍受骨关节炎及关节疼痛，我国有1.5亿人以上。由于D-氨基葡萄糖产品在关节炎及关节疼痛的治疗与保健方面具有特别功效，因而得到广泛应用，已成为目前国外市场非常重要的原料药品种。[0004]N-乙酰-D-氨基葡萄糖据认为具有与D-氨基葡萄糖相似的效果，已知摄取N-乙酰-D-氨基葡萄糖能诱导产生新的软骨，并阻止骨关节炎的发作，或在一些病例中，用来治疗骨关节炎。由于D-氨基葡萄糖有苦味，而N-乙酰-D-氨基葡萄糖有蔗糖50%的甜味，并且很容易被摄取，因此，N-乙酰-D-氨基葡萄糖作为D-氨基葡萄糖的替代物质已引起关注。[0005]目前，国内外氨基葡萄糖的来源主要以生物提取为主。生物提取主要是从虾蟹壳中提取甲壳素或壳聚糖，再经浓盐酸水解制备，或用柠檬酸渣经酸碱提取而得。年生产量在2万吨左右。但是，用虾蟹壳提取时，每获得1吨产品将产生大量废渣和100吨以上废水;用柠檬酸渣提取时，每获得1吨产品将产生30-50吨废酸渣，是高污染工艺，在许多地方已禁止使用。而且，来自水产品壳提取的氨基葡萄糖对许多有水产品过敏的患者不适宜，有水产品过敏的人使用后可能会造成严重的过敏问题，甚至危及生命。此外，生物提取纯化工艺复杂，产品有鱼腥味，不稳定。另外，由于环境污染，从虾蟹壳中提取得到的氨基葡萄糖不可避免的受到重金属污染。[0006]因此，生物提取方法生产氨基葡萄糖，从数量和质量上都难以满足人们的需求，须开辟新的替代方法。若采用化学合成方法来制备，更存在如下三个缺点：生产成本高;严重的环境污染;有安全性隐患。该方法目前国内外已不采用。相比较而言，微生物发酵法生产氨基葡萄糖是一条良好的途径，微生物发酵法是以葡萄糖和无机盐为原料，选用优良菌种进行液体发酵，并经分离、浓缩、纯化直接生产氨基葡萄糖。生产过程中无有害气体产生。发酵法生产的氨基葡萄糖无鱼腥味，生产不受资源限制。而且利用代谢工程进行菌种改良，产量高，工业化大生产潜力大。因此，微生物发酵法生产氨基葡萄糖在技术工艺上有重大变革，替代传统的生物提取，不仅在成本方面占有优势，在减少三废污染方面也具有一定的环保贡献。[0007]微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖常规方法包括:涉及用微生物产生的酶降解来自虾壳原料产生的甲壳素生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法（例如，US5998173，“ProcessforproducingN-acetyl-D-glucosamine”）；用微生物（木霉菌）产生的酶酶解或用酸部分水解纯化来自真菌渣如柠檬酸发酵使用的黑曲霉菌的菌渣）的甲壳素生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法（例如，US20030073666A1，“N-acetyl-D-glucosamineandprocessforproducingN-acetyl-D-glucosamine”）；用木霉菌直接使用葡萄糖为碳源，不需要来自真菌渣或虾壳产生的甲壳素和壳多糖寡糖为碳源，发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法（例如，US20110059489A1，“MethodforfermentativeproductionofN-acetyl-D-glucosaminebymicroorganism”）；通过培养绿藻病毒（Chlorovirus感染的小球藻细胞或者导入了源自绿藻病毒的基因的重组大肠杆菌来生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法（例如，JP2004283144A，“MethodforproducingglucosamineandN-acetylglucosamine”）；使用遗传修饰的微生物，特别是遗传修饰的大肠杆菌，发酵生产D-氨基葡萄糖或N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法例如，US6,372,457,“Processandmaterialsforproductionofglucosamine”；W02004003175，“ProcessandmaterialsforproductionofglucosamineandN-acetylglucosamine”）。[0008]用微生物或微生物产生的酶来降解源自甲壳类动物如蟹、虾类的壳的甲壳素生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，较为传统，存在产量低、成本高和动物源不足等问题。通过培养用绿藻病毒感染的小球藻细胞生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，涉及压碎细胞获取N-乙酰-D-氨基葡萄糖的步骤，存在操作复杂等问题。用木霉菌直接使用葡萄糖为碳源发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，具有不需要使用来自甲壳类动物壳或真菌渣产生的甲壳素或壳多糖寡糖等碳源的优点，但木霉菌等真菌发酵温度低27°C、时间长10天）、产量偏低（15mgml，从而存在生产周期长、成本高、易污染杂菌等缺点，严重限制了该方法的工业化应用。[0009]显然，针对氨基葡萄糖不断增长的市场需求，用遗传修饰的微生物生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖，是实现大规模工业化生产的一条有应用前景的重要方法。而新的遗传修饰的微生物可通过基因重组、基因转移、基因突变、基因删除、基因超表达、代谢途径改变等许多方式获得。[0010]美国专利US6，372，457中公开了通过微生物发酵生产D-氨基葡萄糖的方法和材料。该发明包括用于该发明生产氨基葡萄糖之方法的遗传修饰的微生物，以及重组核酸分子和由所述重组核酸分子产生的蛋白质。该发明所述遗传修饰的微生物，主要针对能提高氨基葡萄糖-6-磷酸合酶活性的遗传修饰，包括多种基因突变或氨基酸缺失和取代。但该专利未涉及通过内源性氨基葡萄糖-6-磷酸合酶基因启动子更换或缺失等改变，导致氨基葡萄糖-6-磷酸合酶活性的提高或降低。另外，该专利主要通过氨基葡萄糖-6-磷酸合酶的遗传修饰生产的目的产物仅为D-氨基葡萄糖，未涉及N-乙酰-D-氨基葡萄糖生产。而且，由于D-氨基葡萄糖在发酵液中很不稳定，降解产物可能对微生物有毒性，这种通过遗传修饰生产D-氨基葡萄糖的方式，其产量很低，实际应用存在局限性。[0011]W02004003175中公开了用于生产D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖的生物合成方法。该方法通过发酵基因修饰微生物以产生氨基葡萄糖和或N-乙酰-D-氨基葡萄糖。该发明还公开了用于生产氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖的基因修饰微生物。此夕卜，该发明还描述了回收通过发酵法生产的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，包括产生高纯度N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法。该发明还公开了由N-乙酰-D-氨基葡萄糖生产D-氨基葡萄糖的方法。该发明所述遗传修饰的微生物，主要针对增加氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶活性的遗传修饰。酵母氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶基因（GNAl在大肠杆菌中表达可将氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化为乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸，在先前的文献中也已有报道和证实MioTl,Yamada-OkabeT,ArisawaM，Yamada—OkabeH:SaccharomycescerevisiaeGNAl,anessentialgeneencodinganovelacetyltransferaseinvolvedinUDP-N-acetylglucosaminesynthesis，JBiolChem.,1999JanI;274I:424-9·〇[0012]利用微生物发酵生产N-乙酰-氨基葡萄糖时，因高密度发酵微生物需氧量大，需要持续进行搅拌从而增加能耗，而且持续搅拌会产生大量泡沫进而影响发酵，从而影响产量。发明内容[0013]本发明通过用遗传修饰方法改造微生物，提高其利用溶氧的能力，使微生物以更高效率和更高产量生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐，从而降低工业规模生产的生产成本。[0014]具体而言，本发明通过在微生物内表达透明颤菌血红蛋白（vitreoscillahemoglobin，Vhb，提高微生物利用溶氧的能力，加快蛋白质和代谢产物的合成，促进微生物生长，增加发酵效价和水平，从而使该微生物在有限氧条件下以更高效率和更高产量生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐。[0015]本发明在上述内容的基础上还进一步涉及如下内容中的一种或多种：[0016]1·通过提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶N-acetylmannosaminekinase，NanK的作用，加强微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖N-acetyl-D_mannosamine，ManNAc磷酸化为N-乙酰-D-氨基甘露糖-6_磷酸N-acetyl-D-mannosamine-6-phosphate，ManNAc_6-P，从而使该微生物以更高效率和更高产量生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐。[0017]2.通过提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶〇_acetylmannosamine-6-phosphateepimerase，NanE的作用，加强微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖_6_憐酸N-acetyl-D-mannosamine-6-phosphate，ManNAc_6_P转变为N-乙醜-D-氛基葡萄糖_6_磷酸N-acetyl-D-glucosamine-6-phosphate，GlcNAc_6_P，排出细胞外成为N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc，从而使该微生物以更高效率和更高产量生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐。[0018]3.通过提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶D-Glucosamine-6-phosphatedeaminase，NagB的作用，优选同时降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶Glucosamine-e-phosphatesynthase，GlmS，又称作L-谷氨酰胺-6-磷酸果糖转氨酶，L-gIutamine:D-fructose-6-phosphateaminotransferase的作用，加强微生物中葡萄糖_6_磷酸Glucose-6-phosphate，Glc_6_P氨基化为D-氨基葡萄糖_6_磷酸（D-glucosamine-6-phosphate，GlcN-6-PC3D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB所催化的反应是可逆的，氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS所催化的反应虽是不可逆的，但有严重的产物抑制问题，当NagB催化的反应向由Glc-6-P生成GlcN-6-P的方向进行时，其和GlmS功能相同，可替代GlmS，而且无产物抑制问题。提高NagB的作用，加快NagB催化反应向由Glc-6-P生成GlcN-6-P的方向进行，优选同时降低GlmS的作用，减弱GlmS的产物抑制问题，达到增加GlcN-6-P的目的，从而使该微生物以更高效率和更高产量生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc和或D-氨基葡萄糖盐。[0019]4.通过提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶（Glucosamine-6-phosphatesynthase，GlmS，又称作L-谷氨酰胺-6-磷酸果糖转氨酶，1^-811^3!11；[116:0-;1^1101:086-6-phosphateaminotransferase的作用，并同时降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶（D-Glucosamine-6-phosphatedeaminase，NagB的作用，加强微生物中葡萄糖_6_磷酸Glucose-6-phosphate，Glc_6_P氨基化为D-氨基葡萄糖_6_磷酸（0_8111308111；[116-6-phosphate，GlcN-6_PC3D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB所催化的反应是可逆的，当NagB催化的反应向由GlcN-6-P生成Glc-6-P的方向进行时，其和GlmS功能相反，会抵消GlmS的作用。降低NagB的作用，阻止NagB催化反应向由GlcN-6-P生成Glc-6-P的方向进行，并同时超表达GlmS，加快GlmS催化Glc-6-P氨基化为GlcN-6-P，达到增加GlcN-6-P的目的，从而使该微生物以更高效率和更高产量生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc和或D-氨基葡萄糖盐。[0020]5.通过提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶UDP-N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase，WecB的作用，加强微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖110卩-N-acety1-D-glucosamine，UDP-G1cNAc转变为N-乙酰-D-氨基甘露糖（N-acetyI-D-mannosamine，ManNAc，从而使该微生物以更高效率和更高产量生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc和或D-氨基葡萄糖盐。[0021]6.降低微生物中与目标产物再次被摄入细胞内或有益中间产物被降解相关的酶或者蛋白的作用，提高微生物中糖转化率和N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量，从而使该微生物以更高效率和更高产量生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc和或D-氨基葡萄糖盐。包括但不限于如下内容中的一种或多种：[0022]1降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，PIIImanMannosetransporterEIIM，PIIIMan，ManXYZ的作用，阻止N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc等己糖转运回细胞内降解。[0023]⑵降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶N-acetylneuraminatelyase，NanA的作用，阻止微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖N-acetyl-D_mannosamine，ManNAc降解。[0024]3降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶（N-acetylglucosamine-6-phosphatedeacetylase，NagA的作用，阻止微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖_6_磷酸（N-acetyl-D-glucosamine-6-phosphate，GlcNAc_6_P转变为D-氨基葡萄糖_6_磷酸D-glucosamine-6-phosphate，GlcN-6_P。[0025]4降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagN-acetylglucosaminespecificenzymeIINag，NagE的作用，阻止N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc被转入微生物细胞内降解。[0026]5通过提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶phosphoglucosaminemutase，GlmM的作用，加强微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸D-glucosamine-6-phosphate，GlcN-6_P转变为D-氨基葡萄糖磷酸D-glucosamine-l-phosphate，GlcN-l_P。[0027]6通过提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶bifunctionalN-acetylglucosamine-1-phosphateuridyltransferaseglucosamine-1-phosphateacetyltransferase，GlmU的作用，加强微生物中D-氨基葡萄糖-I-磷酸D-glucosamine-l-phosphate，GlcN_l_P转变为N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸（N-acetyl-D-glucosamine-1-phosphate，GlcNAc_l_P，并进一步转变为UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖UDP-N-acetyl-D-glucosamine，UDP_GlcNAc〇[0028]根据本发明的一个实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0029]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;和[0030]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0031]优选，进一步包括C由N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc脱乙酰化得到D-氨基葡萄糖盐。[0032]在本发明中，微生物用至少一种包含编码透明颤菌血红蛋白（Vhb的核酸序列的重组核酸分子转化。[0033]本发明以透明颤菌血红蛋白（Vhb为对象，通过错误倾向PCR随机诱变法，引进随机的碱基替换，进行DNA改组，筛选该蛋白的理想突变体。错误倾向PCR引进突变的随机诱变法是通过引进随机的碱基替换筛选理想的突变体，而DNA改组比随机诱变能更显著地提高良性突变的概率，从而能获得更有应用价值的突变体。为提高透明颤菌血红蛋白（Vhb的活性，将易错PCR与DNA改组相结合，对其进行改造，并将突变基因置于受氧调控的启动子之下进行表达和筛选，以获得在限氧条件下比野生型具有更强活性的突变蛋白。[0034]在一个方面，编码透明颤菌血红蛋白（Vhb的核酸序列含有至少一种增加透明颤菌血红蛋白（Vhb的活性的遗传修饰。优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDN0:61的下述位置处的取代中的一种或多种:第45位甲硫氨酸被亮氨酸取代、第86位半胱氨酸被甘氨酸取代和第95位酪氨酸被丝氨酸取代。进一步优选，编码所述透明颤菌血红蛋白Vhb的核酸序列为SEQIDN0:64;所述透明颤菌血红蛋白（Vhb的氨基酸序列为SEQIDN0：65〇[0035]在另一个方面，所述的透明颤菌血红蛋白（Vhb具有与SEQIDN0:61的氨基酸序列至少约30%相同，优选至少约50%相同，进一步优选至少约70%相同，进一步优选至少约80%相同，更进一步优选至少约90%相同，最优选至少约95%相同的氨基酸序列，其中所述的透明颤菌血红蛋白（Vhb具有活性。[0036]在另一个方面，所述的透明颤菌血红蛋白（Vhb具有SEQIDN0:61的氨基酸序列。[0037]在另一个方面，重组核酸分子中编码透明颤菌血红蛋白（Vhb的基因拷贝数大于或等于1。[0038]在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子、具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子、增强子、融合序列等。优选，重组核酸分子中包含具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，重组核酸分子中包含trc启动子。trc启动子是trp启动子和Iac启动子的拼合启动子，具有比trp更高的转录效率和受IacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。[0039]在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型（即重组核酸分子被装入质粒中）和整合型（即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中）。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。[0040]根据本发明的优选实施方案，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：[0041]1包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰；[0042]2包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰；[0043]⑶包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰，优选同时包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶；GlmS作用的遗传修饰；[0044]4包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰，并同时包含至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰；[0045]⑶包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。[0046]在上述第（1个方面中，提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰选自a微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的酶活性增加;和或b微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK被过量表达。[0047]本领域技术人员可以理解，为提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的作用，可以通过筛选编码具有N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的酶活性增加的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK基因突变体来实现。筛选NanK基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK来实现。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。[0048]在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的核酸序列的重组核酸分子转化。[0049]在一个方面，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的核酸序列含有至少一种增加N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的酶活性的遗传修饰。优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDNO:17的下述位置处的取代中的一种或多种:第36位赖氨酸被精氨酸取代、第103位异亮氨酸被蛋氨酸取代和第223位精氨酸被丝氨酸取代。进一步优选，编码所述N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的核酸序列为SEQIDN0:26;所述N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的氨基酸序列为SEQIDNO:27。[0050]在另一个方面，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK具有与SEQIDNO:17的氨基酸序列至少约30%相同，优选至少约50%相同，进一步优选至少约70%相同，进一步优选至少约80%相同，更进一步优选至少约90%相同，最优选至少约95%相同的氨基酸序列，其中所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK具有酶活性。[0051]在另一个方面，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK具有SEQIDNO:17的氨基酸序列。[0052]在另一个方面，重组核酸分子中编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的基因拷贝数增加。[0053]在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子、具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子、增强子、融合序列等。优选，重组核酸分子中包含具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，重组核酸分子中包含trc启动子。trc启动子是trp启动子和Iac启动子的拼合启动子，具有比trp更高的转录效率和受IacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。[0054]在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型（即重组核酸分子被装入质粒中）和整合型（即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中）。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。[0055]在另一个优选的实施方案中，微生物包括至少一种对编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等;更优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的基因的内源性天然启动子被trc启动子替换。[0056]在上述第（2个方面中，提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰选自a微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE的酶活性增加;和或b微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE被过量表达。[0057]本领域技术人员可以理解，为提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE的作用，可以通过筛选编码具有N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE的酶活性增加的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE基因突变体来实现。筛选NanE基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE来实现。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。[0058]在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE的核酸序列的重组核酸分子转化。[0059]在一个方面，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE的核酸序列含有至少一种增加N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE的酶活性的遗传修饰。优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDNO:29的下述位置处的取代中的一种或两种:第133位半胱氨酸被精氨酸取代和第187位酪氨酸被组氨酸取代。进一步优选，编码所述N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE的核酸序列为SEQIDNO:56;所述N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE的氨基酸序列为SEQIDNO:57。[0060]在另一个方面，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE具有与SEQIDNO:29的氨基酸序列至少约30%相同，优选至少约50%相同，进一步优选至少约70%相同，进一步优选至少约80%相同，更进一步优选至少约90%相同，最优选至少约95%相同的氨基酸序列，其中所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE具有酶活性。[0061]在另一个方面中，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE具有SEQIDNO:29的氨基酸序列。[0062]在另一个方面，重组核酸分子中编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE的基因拷贝数增加。[0063]在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子、具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子、增强子、融合序列等。优选，重组核酸分子中包含具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，重组核酸分子中包含trc启动子。[0064]在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型（即重组核酸分子被装入质粒中）和整合型（即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中）。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。[0065]在另一个优选的实施方案中，微生物包括至少一种对编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等;更优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE的基因的内源性天然启动子被trc启动子替换。[0066]在上述第3个方面中，提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰选自a微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的酶活性增加;和或b微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB被过量表达。[0067]本领域技术人员可以理解，为提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的作用，可以通过筛选编码具有D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的酶活性增加的D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB基因突变体来实现。筛选NagB基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB来实现。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。[0068]在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的核酸序列的重组核酸分子转化。[0069]在一个方面，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的核酸序列含有至少一种增加D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的酶活性的遗传修饰。[0070]在另一个方面，重组核酸分子中编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的基因拷贝数增加。[0071]在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子、具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子、增强子、融合序列等。优选，重组核酸分子中包含具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，重组核酸分子中包含trc启动子。[0072]在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型（即重组核酸分子被装入质粒中）和整合型（即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中）。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。[0073]在另一个优选的实施方案中，微生物包括至少一种对编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等;更优选，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的基因的内源性天然启动子被trc启动子替换。[0074]在本发明中，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰选自a微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的酶活性降低;和或b微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的表达减少，包括但不限于:编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶®lmS的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。优选，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰为编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。[0075]在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶®lmS作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。[0076]在上述第4个方面中，提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰选自a微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的酶活性增加;和或b微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS被过量表达。[0077]本领域技术人员可以理解，为提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的作用，可以通过筛选编码具有氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的酶活性增加的氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS基因突变体来实现。筛选GlmS基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS来实现。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。[0078]在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的核酸序列的重组核酸分子转化。[0079]在一个方面，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的核酸序列含有至少一种增加氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的酶活性的遗传修饰。[0080]在另一个方面，重组核酸分子中编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的基因拷贝数增加。[0081]在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子、具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子、增强子、融合序列等。优选，重组核酸分子中包含具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，重组核酸分子中包含trc启动子。[0082]在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型（即重组核酸分子被装入质粒中）和整合型（即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中）。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。[0083]在另一个优选的实施方案中，微生物包括至少一种对编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等;更优选，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的基因的内源性天然启动子被trc启动子替换。[0084]在本发明中，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰选自a微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的酶活性降低;和或b微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的表达减少，包括但不限于:编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。优选，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰为编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。[0085]在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。[0086]在上述第（5个方面中，提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰选自a微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的酶活性增加;和或b微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB被过量表达。[0087]本领域技术人员可以理解，为提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的作用，可以通过筛选编码具有UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的酶活性增加的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB基因突变体来实现。筛选WecB基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB来实现。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。[0088]在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的核酸序列的重组核酸分子转化。[0089]在一个方面，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的核酸序列含有至少一种增加UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的酶活性的遗传修饰。优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDNO:50的下述位置处的取代中的一种或多种:第34位半胱氨酸被丝氨酸取代、第145位组氨酸被天冬氨酸取代、第226位半胱氨酸被苯丙氨酸取代和245位缴氨酸被甘氨酸取代;更优选，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的核酸序列为SEQIDN0:58;所述UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的氨基酸序列为SEQIDNO:59。[0090]在另一个方面，所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB具有与SEQIDNO:50的氨基酸序列至少约30%相同，优选至少约50%相同，进一步优选至少约70%相同，进一步优选至少约80%相同，更进一步优选至少约90%相同，最优选至少约95%相同的氨基酸序列，其中所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB具有酶活性。[0091]在另一个方面中，所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB具有SEQIDNO:50的氨基酸序列。[0092]在另一个方面，重组核酸分子中编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的基因拷贝数增加。[0093]在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子、具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子、增强子、融合序列等。优选，重组核酸分子中包含具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，重组核酸分子中包含trc启动子。[0094]在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型（即重组核酸分子被装入质粒中）和整合型（即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中）。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。[0095]在另一个优选的实施方案中，微生物包括至少一种对编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等;更优选，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的基因的内源性天然启动子被trc启动子替换。[0096]根据本发明的优选实施方案，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：[0097]1包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EnM，PIIImanManXYZ作用的遗传修饰；[0098]2包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰；[0099]3包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰；[0100]4包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE作用的遗传修饰；[0101]5包含至少一种能提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶GlmM作用的遗传修饰；[0102]6包含至少一种能提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶®lmU作用的遗传修饰。[0103]在上述第⑴个方面中，降低微生物中甘露糖转运蛋白EnM，PIIImanManXYZ作用的遗传修饰包括但不限于:编码微生物中甘露糖转运蛋白ΕΠΜ，PIIImanManXYZ的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，PIIImanManXYZ基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。优选，降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，PIIImanManXYZ作用的遗传修饰为编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，PIIImanManXYZ的内源性基因完全缺失，即被删除。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，PIIImanManXYZ作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。[0104]在上述第⑵个方面中，降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰包括但不限于:编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。优选，降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA的内源性基因完全缺失，即被删除。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。[0105]在上述第（3个方面中，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰包括但不限于:编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA的内源性基因完全缺失，即被删除。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。[0106]在上述第⑷个方面中，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE作用的遗传修饰包括但不限于:编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE的内源性基因完全缺失，即被删除。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。[0107]在上述第5个方面中，提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶GlmM作用的遗传修饰选自a微生物中磷酸葡糖胺变位酶GlmM的酶活性增加;和或b微生物中磷酸葡糖胺变位酶®ImM被过量表达。[0108]本领域技术人员可以理解，为提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶GlmM的作用，可以通过筛选编码具有磷酸葡糖胺变位酶GlmM的酶活性增加的磷酸葡糖胺变位酶GlmM基因突变体来实现。筛选GlmM基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶GlmM的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达磷酸葡糖胺变位酶GlmM来实现。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶GlmM作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。[0109]在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的核酸序列的重组核酸分子转化。[0110]在一个方面，编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的核酸序列含有至少一种增加磷酸葡糖胺变位酶®lmM的酶活性的遗传修饰。[0111]在另一个方面，重组核酸分子中编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的基因拷贝数增加。[0112]在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子、具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子、增强子、融合序列等。优选，重组核酸分子中包含具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，重组核酸分子中包含trc启动子。[0113]在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型（即重组核酸分子被装入质粒中）和整合型（即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中）。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。[0114]在另一个优选的实施方案中，微生物包括至少一种对编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等;更优选，编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的基因的内源性天然启动子被trc启动子替换。[0115]在上述第6个方面中，提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU作用的遗传修饰选自a微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的酶活性增加;和或b微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶®lmU被过量表达。[0116]本领域技术人员可以理解，为提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的作用，可以通过筛选编码具有双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的酶活性增加的双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU基因突变体来实现。筛选GlmU基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU来实现。在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。[0117]在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的核酸序列的重组核酸分子转化。[0118]在一个方面，编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的核酸序列含有至少一种增加双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的酶活性的遗传修饰。[0119]在另一个方面，重组核酸分子中编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的基因拷贝数增加。[0120]在另一个方面，重组核酸分子中包含内源性天然启动子、具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子、增强子、融合序列等。优选，重组核酸分子中包含具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，重组核酸分子中包含trc启动子。[0121]在本发明中，重组核酸分子转化微生物，选自游离型（即重组核酸分子被装入质粒中）和整合型（即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中）。优选，重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。[0122]在另一个优选的实施方案中，微生物包括至少一种对编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换，例如HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子等；更优选，编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的基因的内源性天然启动子被trc启动子替换。[0123]本发明进一步涉及如下优选的实施方案：[0124]1.根据本发明的一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0125]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;和[0126]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0127]2.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0128]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰；至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;和[0129]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0130]3.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0131]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和[0132]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0133]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0134]4.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0135]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰;和至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和[0136]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0137]5.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0138]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰；至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰;和[0139]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[omo]6.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0141]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;和[0142]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc。[0143]7.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0144]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和[0145]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc。[0146]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0147]8.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0148]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶；GlmS作用的遗传修饰;和至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和[0149]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc。[0150]9.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0151]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰;和[0152]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0153]10.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0154]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰；至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和[0155]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0156]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0157]11.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0158]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰；至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰;和至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和[0159]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0160]12.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0161]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰；至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰;和[0162]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0163]13.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0164]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰;和[0165]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0166]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0167]14.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0168]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰;和至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰;和[0169]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0170]15.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0171]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰；和[0172]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0173]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0174]16.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0175]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶；GlmS作用的遗传修饰;和至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和[0176]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0177]17.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0178]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰;和[0179]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0180]18.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0181]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰；和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰；和[0182]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0183]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0184]19.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0185]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶；GlmS作用的遗传修饰;至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰;和[0186]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0187]20.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0188]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰；至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰;和[0189]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0190]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0191]21.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0192]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰；至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰;至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰;和[0193]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0194]22.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0195]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰;和[0196]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0197]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0198]23.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖®lcNAc和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：[0199]A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰;至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰;和[0200]B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。[0201]在上述优选的实施方案中，进一步包括C由N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc脱乙酰化得到D-氨基葡萄糖盐。[0202]在上述优选的实施方案中，所述微生物进一步包含:至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EnM，PIIImanManXYZ作用的遗传修饰;至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰;至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰;和至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE作用的遗传修饰。[0203]在上述任意实施方案的一个方面中，上述任意重组核酸分子的表达是可诱导的，包括但不限于被乳糖诱导，例如，通过在培养液中添加乳糖等可实现被乳糖诱导表达。[0204]本领域技术人员可以理解，本发明中可以使用本领域已知的各种常规发酵培养基。在一个方面中，发酵培养基中包含碳源。在另一个方面中，发酵培养基中包含氮源。在另一个方面中，发酵培养基中包含碳源和氮源。在另一个方面中，发酵培养基中包含碳源、氮源和无机盐。[0205]本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种碳源均可用于本发明，包括有机碳源和或无机碳源。优选，碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和糖蜜中的一种或多种。优选，碳源的浓度维持在约〇.1%-约5%。本领域技术人员可以理解，本领域已知的各种氮源均可用于本发明，包括有机氮源和或无机氮源。优选，氮源选自氨水、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵、硝酸钠、尿素、酵母浸膏、肉类浸膏、蛋白胨、鱼粉、豆粉、麦芽、玉米浆和棉籽粉中的一种或多种。[0206]优选，本发明采用补料发酵法。根据本发明的一个方面，补糖液包含葡萄糖和核糖，优选，葡萄糖浓度为1〇%_85%wv，核糖浓度为0.5%-15%wv，进一步优选，葡萄糖浓度为55%-75%wv，核糖浓度为5%-7%wv;根据本发明的另一个方面，补糖液包含葡萄糖和葡萄糖酸盐，优选，葡萄糖浓度为1〇%_85%wv，葡萄糖酸盐浓度为0.5%-15%wv，进一步优选，葡萄糖浓度为55%-75%wv，葡萄糖酸盐浓度为2%-3%wv;根据本发明的另一个方面，补糖液包含葡萄糖、核糖和葡糖酸盐，优选，葡萄糖浓度为10%-85%wv，核糖浓度为0.5%-15%wv，葡萄糖酸盐浓度为0.5%-15%wv，进一步优选，葡萄糖浓度为55%-75%wv，核糖浓度为5%-7%wv，葡萄糖酸盐浓度为2%-3%wv。优选，葡萄糖酸盐为葡萄糖酸钠。[0207]在优选的实施方案中，在约20°C_约45°C进行所述培养步骤，进一步优选，在约33°C-约37°C进行所述培养步骤。[0208]在优选的实施方案中，在约pH4.5-约pH8.5进行所述培养步骤。进一步优选，在约pH6.7-约pH7.2进行所述培养步骤。[0209]本领域技术人员可以理解，本发明中可以使用本领域已知的各种常规方法收集N-乙酰-D-氨基葡萄糖GlcNAc。优选，可以从发酵培养基中的胞外产物中收集N-乙酰-D-氨基葡萄糖。进一步优选，该收集步骤包括选自如下的步骤：（a从去除微生物的发酵液中沉淀N-乙酰-D-氨基葡萄糖；（b从去除微生物的发酵液中结晶N-乙酰-D-氨基葡萄糖。[0210]根据本发明，收集步骤进一步包括将发酵液脱色的步骤。脱色步骤可以包括但不限于在对发酵液进行沉淀或结晶之前、在对发酵液进行一次或多次沉淀或结晶重溶解之后进行，脱色包括活性炭处理和或色谱脱色。所述色谱脱色包括使所述发酵液与离子交换树脂接触的步骤，离子交换树脂包括但不限于阴离子交换树脂和或阳离子交换树脂，例如使发酵液与阴离子和阳离子交换树脂的混合床接触。[0211]根据本发明，可以通过使N-乙酰-D-氨基葡萄糖脱乙酰化得到D-氨基葡萄糖盐，所述盐包括但不限于盐酸盐、硫酸盐、钠盐、磷酸盐和硫酸氢盐等。例如，可以在酸性和加热条件下脱乙酰化水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖得到D-氨基葡萄糖盐，优选，在30%-37%盐酸溶液中、60°C-90°C下脱乙酰化水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖得到D-氨基葡萄糖盐酸盐;也可以在UDP-3-0-N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶作用下水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖得到D-氨基葡萄糖，并进一步成盐。[0212]根据本发明的另一个实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰。上文已经对这一遗传修饰进行了详细描述。[0213]根据本发明的优选实施方案，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：[0214]1包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰；[0215]⑵包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰；[0216]⑶包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰，优选同时包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶；GlmS作用的遗传修饰；[0217]4包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰，并同时包含至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰；[0218]⑶包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。上文已经对这些遗传修饰进行了详细描述。[0219]根据本发明的优选实施方案，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：[0220]1包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EnM，PIIImanManXYZ作用的遗传修饰；[0221]2包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰；[0222]⑶包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰；[0223]4包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE作用的遗传修饰；[0224]5包含至少一种能提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶GlmM作用的遗传修饰；[0225]6包含至少一种能提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU作用的遗传修饰。上文已经对这些遗传修饰进行了详细描述。[0226]本发明进一步涉及如下优选的实施方案：[0227]1.根据本发明的一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰。[0228]2.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰。[0229]3.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰。[0230]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0231]4.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰;和至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰。[0232]5.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。[0233]6.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰。[0234]7.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰。[0235]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0236]8.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶；GlmS作用的遗传修饰;和至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶Nag©作用的遗传修饰。[0237]9.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。[0238]10.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰。[0239]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0240]11.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰;和至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰。[0241]12.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。[0242]13.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。[0243]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0244]14.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含:至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰;和至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。[0245]15.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰。[0246]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0247]16.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰;和至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰。[0248]17.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。[0249]18.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。[0250]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0251]19.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰;至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。[0252]20.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。[0253]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0254]21.根据本发明的另一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰;至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。[0255]22.根据本发明的一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。[0256]优选，所述微生物还包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰。[0257]23.根据本发明的一个优选实施方案，本发明涉及一种微生物，所述微生物包含：至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE作用的遗传修饰;至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS作用的遗传修饰;至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB作用的遗传修饰;和至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。[0258]在上述优选的实施方案中，所述微生物进一步包含:至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EnM，PIIImanManXYZ作用的遗传修饰;至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰;至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰;和至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE作用的遗传修饰。[0259]根据本发明的另一个实施方案，本发明涉及一种具有更高活性的透明颤菌血红蛋白，其具有SEQIDN0:65所示的氨基酸序列。本发明进一步涉及编码上述透明颤菌血红蛋白的核酸分子，所述核酸分子具有SEQIDNO:64所示的核酸序列。本发明进一步涉及包含上述核酸分子的载体。本发明进一步涉及包含上述载体的微生物。本发明进一步涉及基因组中包含上述核酸分子的微生物。[0260]在本发明中，微生物可以是任意的微生物例如细菌、原生生物、藻类、真菌或其它微生物）。在优选的实施方案中，微生物包括但不限于细菌、酵母或真菌。优选，所述的微生物选自细菌或酵母。进一步优选，细菌包括但不限于选自埃希氏菌属Bscherichia、芽孢杆菌属Bacillus、乳杆菌属Lactobacillus、假单胞菌属Pseudomonas或链霉菌属Streptomyces的属的细菌；更优选，细菌包括但不限于选自大肠杆菌（Escherichiacoli、枯草芽抱杆菌Bacillussubtilis、地衣芽抱杆菌Bacilluslicheniformis、短乳杆菌Lactobacillusbrevis、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa或浅青紫链霉菌（StreptomycesIividans的种的细菌。进一步优选，酵母包括但不限于选自糖酵母属Saccharomyces、裂殖糖酵母属Schizosaccharomyces、念珠菌属Candida、汉逊酵母属（Hansenula、毕赤酵母属（Pichia、克鲁维酵母属（Kluveromyces和红法夫属Phaffia的酵母；更优选，酵母包括但不限于选自酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe、白色念珠菌（Candidaalbicans、多形汉逊酵母Hansenulapolymorpha、巴氏毕赤酵母Pichiapastoris、加拿大毕赤酵母Pichiacanadensis、马克斯克鲁维酵母Kluyveromycesmarxianus或红法夫酵母Phaffiarohodozyma。优选，所述的微生物为真菌;进一步优选，真菌包括但不限于选自曲霉属（Aspergillus、犁头霉属（Absidia、根霉属（Rhizopus、金孢子菌属Chrysosporium、脉孢霉属Neurospora或木霉属Trichoderma的属的真菌;更优选，真菌包括但不限于选自黑曲霉Aspergillusniger、构巢曲霉Aspergillusnidulans、蓝色犁头霉（Absidiacoerulea、米根霉（Rhizopusoryzae、劳肯诺温斯金孢子菌ChrysosporiumIucknowense、粗糖脉抱霉（Neurosporacrassa、间型脉抱霉Neurosporaintermedia或里氏木霉Trichodermareesei。特别优选的大肠杆菌菌株包括K-12、B和W，最优选K-12。尽管大肠杆菌作为优选的微生物且用作本发明各种实施方案的实例，但是应理解在本发明方法中可以使用产生N-乙酰-D-氨基葡萄糖且可以通过遗传修饰以提高N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的任意其它微生物。用于本发明的微生物也可以称作生产生物体。[0261]在本发明中，术语N-乙酰-D-氨基葡萄糖可以称作2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖。术语N-乙酰-D-氨基葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸可以分别缩写为GlcNAc、GlcNAc-6-P和GlcNAc-I-P乙酰-D-氨基葡萄糖也缩写为NAG。与N-乙酰-D-氨基葡萄糖和衍生物类似，术语D-氨基葡萄糖、D-氨基葡萄糖-6-磷酸和D-氨基葡萄糖-1-磷酸可以分别缩写为GlcN、GlcN-6-P和GlcN-1-P。类似地，术语N-乙酰-D-氨基甘露糖、N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸可以分别缩写为ManNAc、ManNAc-6-P、GIc、G1c-6-P、Fru-6-P。[0262]术语提高微生物中酶的作用是指微生物中该酶的活性增加和或该酶被过量表达，从而提高了微生物中由该酶所催化的底物生成产物的量。[0263]术语降低微生物中酶的作用是指微生物中该酶的活性降低和或该酶的表达减少，从而降低了微生物中由该酶所催化的底物生成产物的量。[0264]术语酶活性增加是指酶催化一定化学反应的能力增加。其涵盖了在酶受产物抑制作用和酶对底物亲合力不变的情况下酶自身催化化学反应的能力增加，和或由于酶受产物抑制作用降低导致和或酶对底物亲合力增加所导致的酶催化化学反应的能力增加。术语酶受产物抑制作用降低是指催化反应的酶的活性受其终产物特异抑制作用而降低。术语酶对底物亲合力增加是指酶对所催化的底物的亲合力增加。[0265]图1以大肠杆菌为例解释了本发明公开的用于大规模生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的氨基糖代谢途经中遗传修饰的主要方面。就图1而言，粗体箭头表示本发明涉及的通过遗传改造产生和或增加代谢流量。图1公开了数种用于合成N-乙酰-D-氨基葡萄糖的不同方法，除了包括对Vhb的修饰可进一步包括对似111、似1^、他88、611113、16〇8或其组合的修饰，还可以进一步包括对ManXYZ、NanA、NagA、NagE、GlmM、GlmU或其组合的修饰。本领域技术人员可以理解，其它微生物具有类似的糖代谢途经，且在这类途经中基因和蛋白质具有类似的结构和功能。因此，本发明所讨论的除适用于大肠杆菌外同样适用于其它微生物且其它微生物显然包括在本发明中。[0266]本领域中已知具有相同生物活性的酶可以具有不同的名称，这取决于该酶来源于什么样的微生物。下面是本文涉及的许多酶的可选名称和来自一些生物体的编码这类酶的具体基因名称。这些酶的名称可以互换使用或如果合适用于给定的序列或生物体，但本发明意图包括来自任意生物体的指定功能的酶。[0267]例如，本文一般称作“N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶”的酶催化由N-乙酰-D-氨基甘露糖磷酸化为N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P。来自大肠杆菌的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶一般称作NanK。来自各种生物体的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶是本领域中公知的，且可用于本发明遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶具有由SEQIDNO:16表示的核酸序列编码、由SEQIDNO:17表示的氨基酸序列。[0268]本文一般称作“N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶”的酶催化由N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P转变为N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-P。来自大肠杆菌的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶一般称作NanE。来自各种生物体的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶是本领域中公知的，且可用于本发明遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-P异构酶具有由SEQIDNO:28表示的核酸序列编码、由SEQIDNO:29表示的氨基酸序列。[0269]本文一般称作“UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶”的酶催化由UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖转变为N-乙酰-D-氨基甘露糖。来自大肠杆菌的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶一般称作WecB。来自各种生物体的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶是本领域中公知的，且可用于本发明遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的UDP-N-乙酰_D-氨基葡萄糖-2-异构酶具有由SEQIDNO:49表示的核酸序列编码、由SEQIDNO:50表示的氨基酸序列。[0270]本文一般称作“D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶”的酶催化D-氨基葡萄糖-6-磷酸和水形成葡萄糖-6-磷酸和铵的可逆反应。该酶也称作D-氨基葡萄糖-6-磷酸异构酶、GlcN6P脱氨酶、磷酸D-氨基葡萄糖异构酶、磷酸D-氨基葡萄糖异构酶、D-氨基葡萄糖磷酸酯脱氨酶和2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖-6-磷酸乙酮醇异构酶脱氨）。来自各种生物体的D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶是本领域中公知的，且可用于本发明遗传改造策略中。在大肠杆菌和其它细菌中，该酶一般称作NagB。[0271]本文一般称作“D-氨基葡萄糖-6-磷酸合酶”的酶催化由葡萄糖-6-磷酸和谷氨酰胺形成D-氨基葡萄糖-6-磷酸和谷氨酸。该酶也称作D-氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸氨基转移酶异构化、磷酸己糖氨基转移酶、D-果糖-6-磷酸转酰胺酶、D-氨基葡萄糖-6-磷酸异构酶形成谷氨酰胺）、L-谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转酰胺酶和GlcN6P合酶。来自各种生物体的D-氨基葡萄糖-6-磷酸合酶是本领域中公知的，且可用于本发明遗传改造策略中。来自大肠杆菌和其它细菌的D-氨基葡萄糖-6-磷酸合酶一般称作GlmS。[0272]本文一般称作“N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶”的酶将N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸水解成D-氨基葡萄糖-6-磷酸和乙酸酯。来自各种生物体的N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的称作NagA。[0273]本文一般称作“N-乙酰神经氨酸裂解酶”的酶催化N-乙酰-D-氨基甘露糖降解为N-乙酰神经氨酸。来自各种生物体的N-乙酰神经氨酸裂解酶是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的N-乙酰神经氨酸裂解酶称作NanA。[0274]本文一般称作“磷酸葡糖胺变位酶”的酶催化D-氨基葡萄糖-6-磷酸转化为D-氨基葡萄糖-1-磷酸。来自各种生物体的磷酸D-氨基葡萄糖变位酶是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。该酶在大肠杆菌和其它细菌的磷酸葡糖胺变位酶一般称作GlmM。[0275]本文一般称作“D-氨基葡萄糖-1-磷酸N-乙酰转移酶”的酶将D-氨基葡萄糖-1-磷酸和乙酰辅酶A转化成N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸，并释放CoA。作为一种双功能酶，它还具有N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的功能，也称作UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖二磷酸化酶，将N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸进一步转化为UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖。来自各种生物体的D-氨基葡萄糖-1-磷酸N-乙酰转移酶和N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。该酶在大肠杆菌和其它细菌中称作GlmU。[0276]“Trc启动子”经过巧妙的设计可用于原核表达，例如大肠杆菌表达系统。Trc启动子是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。例如，本文描述了的Trcpromoter具有SEQIDNO:32表示的核苷酸序列。[0277]正如W02004003175发明公开的，D-氨基葡萄糖在用于大肠杆菌生长的一般pH范围内极不稳定。D-氨基葡萄糖和或其降解产物对菌株产生毒性作用。甚至当在进行细胞接种前将浓度低至20gL的D-氨基葡萄糖在培养基pH7.0中预保温3.5小时的时候也观察到毒性。毒性至少部分是由于起始pH为7.0的培养基中的D-氨基葡萄糖降解产物所致。GlcN在较低PH条件下更为稳定，D-氨基葡萄糖在pH4.7以下不会降解。但是，大肠杆菌在低于6-7的pH条件下生长缓慢。因此，在相对低pH下在发酵罐内进行D-氨基葡萄糖生产的方案难以施行。[0278]根据本发明，通过在微生物内表达透明颤菌血红蛋白（vitreoscillahemoglobin，Vhb，提高微生物利用溶氧的能力，加快蛋白质和代谢产物的合成，促进微生物生长，增加发酵效价和水平，另外，在细胞内将由D-氨基葡萄糖-6-PGlcN-6-P在GlmM和GlmU催化生成UDP-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖UDP-GlcNAc，在UDP-N-乙酰-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB催化下变成N-乙酰基-D-氨基甘露糖ManNAc，通过超表达NanK和NanE，进一步转变为N-乙酰基-D-氨基葡萄糖-6-磷酸GlcNAc-6-P，在磷酸酶作用下去磷酸化，排出细胞外成为N-乙酰基-D-氨基葡萄糖GlcNAc。本发明的方法，避免了D-氨基葡萄糖的生成，从而避免了D-氨基葡萄糖和或其降解产物对菌株产生毒性作用。[0279]因此，本发明的有益效果在于:本发明证实通过在微生物内表达透明颤菌血红蛋白（vitreoscillahemoglobin，Vhb，提高微生物利用溶氧的能力，加快蛋白质和代谢产物的合成，促进微生物生长，增加发酵效价和水平，从而可通过微生物发酵方法直接生产完全天然的N-乙酰-D-氨基葡萄糖;该生产新方法无重金属污染风险，无抗生素、药物残留风险，生产不受原料供应影响，可长期稳定生产，且产量高、成本低;所生产的N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖产品具有非动物源性，不使用虾壳的甲壳素，使用葡萄糖等碳源发酵，属于素食产品，且无水产品过敏源。[0280]将本文引述或描述的各公开文献和参考文献的全部内容引入本文作为参考。附图说明[0281]图1大肠杆菌中N-乙酰-D-氨基葡萄糖生物合成途径和代谢工程策略图具体实施方式[0282]下文将结合具体实施例对本发明做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。[0283]除非另有说明，实施例中使用的原料和试剂均为市售商品。[0284]下面是本发明涉及和或所述的各种基因修饰微生物的目录。[0285][0286][0287][0288][0289]实施例I[0290]本实施例描述了构建阻断与N-乙酰-D-氨基葡萄糖被摄入及有益中间产物被降解有关的代谢途径的大肠杆菌突变株[0291]所述生产菌株的亲本菌株是AT-001EscherichiacoliATCC27325，属于大肠杆菌K-12衍生株，来自美国模式培养物保藏中心AmericanTypeCultureCollection。[0292]阻断菌种对N-乙酰-D-氨基葡萄糖摄入及中间代谢产物降解，可以减少代谢过程中的损耗，增加目标广物N-乙酰-D-氨基匍萄糖）的积累。[0293]构建这种突变型宿主菌株，可通过将其染色体基因组上manXYZ、nanA、nagA和nagE基因序列完全或部分删除，使其功能失效，从而使N-乙酰-D-氨基葡萄糖累积。[0294]这种染色体上基因序列删除，可以采用Red重组技术完成。Red重组是一种基于λ噬菌体Red操纵子和Rac·菌体RecERecT系统介导的DNA同源重组技术。通过该技术可以简单、快速地对任意大的DNA分子进行插入、敲除、突变等多种修饰。Red重组技术简单地说，首先向菌体中转入带有表达重组酶基因的PKD46质粒，然后电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆，最后，将重组后菌种中抗性基因消除。[0295]以下描述了具体的操作过程：[0296]1、删除manXYZ基因序列[0297]甘露糖转运蛋白ΕΠΜ，ΡΙΙΙ_mannosetransporterEnM，PIIIMan，ManXYZ可以用作N-乙酰-D-氨基葡萄糖的第二转运蛋白，能将N-乙酰-D-氨基葡萄糖等己糖转运入细胞，从而使排出胞外并积累的目标产物运回胞内降解。将manXYZ基因序列删除，可以阻止细胞外N-乙酰-D-氨基葡萄糖被转运回细胞内降解。[0298]1制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段[0299]IPCR扩增fKanrf片段[0300]fKanrf片段，即FRT-Kanr-FRT片段，是指将卡拉霉素抗性基因（Kanr的两端装有FLP重组酶特异性识别的FRT位点碱基序列。[0301]设计引物：正向引物mfKanf-FSEQIDNo·1，反向引物mfKanf-RSEQIDNo·2。[0302]模板:pPic9K。[0303]PCR反应条件：第一步：94°C变性lmin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸10min。[0304]fKanrf大小：1.28kb。其核苷酸序列SEQIDNo.3。[0305]PCR产物经I%琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。[0306]2PCR扩增Red重组打靶用线性DNA全长片段[0307]设计同源臂引物:根据manXYZ序列SEQIDNo.4,设计删除manXYZ序列的同源臂正向引物manXYZK0-FSEQIDNo·5，反向引物manXYZK0-RSEQIDNo·6。[0308]模板:扩增的fKanrfPCR片段。[0309]PCR反应条件：第一步：94°C变性lmin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸lOmin。[0310]扩增产物：同源臂+fKanrf+同源臂。[0311]将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到1OOngμΙ的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。[0312]2Red重组操作[0313]首先，将PKD46载体转入大肠杆菌AT-OOl菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。[0314]1转化pKD46质粒[0315]pKD46载体是带有表达Red重组酶基因的质粒，表达Exo、Bet和Gam三基因片段，3个基因置于阿拉伯糖启动子下，经L-阿拉伯糖诱导就可以大量表达。为达到通过Red重组修饰染色体上目标基因的目的，有必要将PKD46质粒转化到大肠杆菌中。[0316]①感受态制备：首先，将保存于-20°C的EscherichiacoliATCC27325菌液，按1:50-100接种于IOmlLB液体培养基中，37°C，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入到IOml离心管中，4000gX5min，弃去上清，用冰浴的0·IMCaCh5ml悬浮5min。最后，4000gX5min离心，弃去上清，用冰浴的O.IMCaCl25ml悬浮。-4°C静置12小时，自然沉降。其中，0.1MCaCl2的制备：用无水CaCl2配IM的CaCl2,用蒸气压力为151bfin2的高压灭菌20min，分装1.5ml于-20°C保存，用时融化后按1:10比例稀释配成0.IM的CaCl2。[0317]②质粒转化:取自然沉降的菌体250μ1，加入5μ1pKD46质粒，-4°C，30min。然后，42°C水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30°C摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30°C过夜12-16小时培养。挑单克隆，加入5mlLB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。[0318]2电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆[0319]①电转感受态的制备：将含pKD46EscherichiacoliATCC27325菌种AT-OOl接种于含有氨苄青霉素AmpLB培养基的试管，250rpm摇床过夜，第二天以1%的量接种至含有Amp的LB培养基中，30°C培养，待OD6qq达到0.2左右后，加入0.2%的L-阿拉伯糖，30°C诱导35分钟，直至OD6qq达到0.4左右。冰浴冷却。用超纯水洗一次，10%甘油洗两次，最后用10%甘油重悬，甘油用量以使菌体被浓缩500-1000倍的终浓度为宜。[0320]②电击转化:将2mm电转杯从70%乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。4°C预冷30分钟。取90μ1最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μ1IOOng以上步骤（1得到的全长PCR片段（线性DNA，用枪轻轻吸打混匀，冰浴30分钟。电转参数：2500V，200Ω,25yF〇[0321]③复苏与筛选阳性克隆：加入Im1的LB液体培养基，37°C，IOOrpm，1小时。然后每200μ1涂布一个卡拉霉素Kan平板，一共5个。均匀、涂干。30°C培养24个小时。挑在卡拉霉素抗性下生长的克隆，作PCR鉴定，筛选阳性克隆。[0322]所获得菌种编号:AT-002-01AT-001，AmanXYZ::fKanrf。[0323]3抗性基因的消除[0324]为便于后续工作，可消除所获得菌种（阳性克隆）中的抗性基因。消除抗性基因可借助PCP20质粒完成。pCP20是带有氨苄青霉素和氯霉素抗性基因的质粒，热诱导后可表达FLP重组酶，该酶可特异性识别FRT位点，通过重组可将FRT位点间的序列删除，只保留一个FRT位点。[0325]将pCP20转入上述卡拉霉素抗性克隆，30°C培养8h，后提高到42°C过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒逐渐丢失。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板，挑长出的单克隆点到卡拉霉素抗性平板上，未生长的为卡拉霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的克隆。用鉴定引物作PCR对卡拉霉素抗性消失的克隆进行鉴定。[0326]所获得菌种编号:AT-002-02AT-001，AmanXYZ。[0327]2、删除nanA基因序列[0328]N-乙酰神经氨酸裂解酶N-acetylneuraminatelyase，NanA能够将微生物中的N-乙酰-D-氨基甘露糖ManNAc降解成N-乙酰-D-神经氨酸Neu5Ac。将nanKETA操纵子中的nanA基因序列删除，可以阻止N-乙酰-D-氨基甘露糖ManNAc降解成N-乙酰-D-神经氨酸Neu5Ac〇[0329]1制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段[0330]设计同源臂引物:根据nanE-nanK前段nanA序列SEQIDNo.7,设计nanA序列删除的同源臂引物:正向引物nanAK0-FSEQIDNo.8，反向引物nanAK0-RSEQIDNo.9。[0331]模板:扩增的fKanrfPCR片段。[0332]PCR反应条件：第一步：94°C变性Imin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸lOmin。[0333]扩增产物：同源臂+fKanrf+同源臂。[0334]将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到lOOngμΙ的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。[0335]2Red重组操作[0336]首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-002-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。[0337]1转化pKD46质粒[0338]①感受态制备:首先，将保存于-20°C的EscherichiacoliΑΤ-002-02ΑΤ_001，ΛmanXYZ菌液，按1:50-100接种于IOmlLB液体培养基中，37°C，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入到IOml离心管中，4000gX5min，弃去上清，用冰浴的0.1MCaCl25ml悬浮5min。最后，4000gX5min离心，弃去上清，用冰浴的0.IMCaCl25ml悬浮。_4°C静置12小时，自然沉降。[0339]②质粒转化:取自然沉降的菌体250μ1，加入5μ1pKD46质粒，-4°C，30min。然后，42°C水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30°C摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30°C过夜12-16小时培养。挑单克隆，加入5mlLB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。[0340]2电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆[0341]①电转感受态的制备:将含pKD46Escherichiacoli菌种AT-002-02接种于含有氨苄青霉素AmpLB培养基的试管，250rpm摇床过夜，第二天以1%的量接种至含有Amp的LB培养基中，30°C培养，待OD6QQ达到0.2左右后，加入0.2%的L-阿拉伯糖，30°C诱导35分钟，直至OD6X达到0.4左右。冰浴冷却。用超纯水洗一次，10%甘油洗两次，最后用10%甘油重悬，甘油用量以使菌体被浓缩500-1000倍的终浓度为宜。[0342]②电击转化:将2mm电转杯从70%乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。4°C预冷30分钟。取90μ1最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μ1IOOng以上步骤（1得到的全长PCR片段（线性DNA，用枪轻轻吸打混匀，冰浴30分钟。电转参数：2500V，200Ω,25yF〇[0343]③复苏与筛选阳性克隆：加入Iml的LB液体培养基，37°C，IOOrpm，1小时。然后每200μ1涂布一个卡拉霉素Kan平板，一共5个。均匀、涂干。30°C培养24个小时。挑在卡拉霉素抗性下生长的克隆，作PCR鉴定，筛选阳性克隆。[0344]所获得菌种编号：AT-003-01AT-002-02,AnanA::fKanrf。[0345]⑶抗性基因的消除[0346]将pCP20转入上述卡拉霉素抗性克隆，30°C培养8h，后提高到42°C过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒逐渐丢失。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板，挑长出的单克隆点到卡拉霉素抗性平板上，未生长的为卡拉霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的克隆。用鉴定引物作PCR对卡拉霉素抗性消失的克隆进行鉴定。[0347]所获得菌种编号:AT-003-02AT-002-02,AnanA。[0348]3、删除nagA基因序列[0349]N-乙酰-D-氨基葡萄糖_6_磷酸脱乙酰酶N-acetylglucosamine-6-phosphatedeacetylase，NagA能将微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸GlcNAc-6-P转变为D-氨基葡萄糖-6-磷酸GlcN-6-P。将nag操纵子nagE-nagBACD中的nagA基因序列删除，可以阻止N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸GlcNAc-6-P转变为D-氨基葡萄糖-6-磷酸GlcN-6-P〇[0350]1制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段[0351]设计同源臂引物:根据NCBI查找NC_000913，Escherichiacolistr.K_12N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA序列SEQIDNo.10,设计nagA序列删除的同源臂引物：正向引物nagAK0-FSEQIDNo·ll，反向引物nagAK0-RSEQIDNo·12。[0352]模板:扩增的fKanrfPCR片段。[0353]PCR反应条件：第一步：94°C变性Imin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸lOmin。[0354]扩增产物：同源臂+fKanf+同源臂。[0355]将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到lOOngμΙ的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。[0356]⑵Red重组操作[0357]首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-003-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。[0358]1转化pKD46质粒[0359]①感受态制备：首先，将保存于-20°C的EscherichiacoliAT-003-02AT-002-02，AnanA菌液，按1:50-100接种于IOmlLB液体培养基中，37°C，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入到IOml离心管中，4000gX5min，弃去上清，用冰浴的0.1MCaCl25ml悬浮5min。最后，4000gX5min离心，弃去上清，用冰浴的0.IMCaCh5ml悬浮。_4°C静置12小时，自然沉降。[0360]②质粒转化:取自然沉降的菌体250μ1，加入5μ1pKD46质粒，-4°C，30min。然后，42°C水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30°C摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30°C过夜12-16小时培养。挑单克隆，加入5mlLB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。[0361]2电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆[0362]①电转感受态的制备:将含pKD46Escherichiacoli菌种AT-003-02接种于含有氨苄青霉素AmpLB培养基的试管，250rpm摇床过夜，第二天以1%的量接种至含有Amp的LB培养基中，30°C培养，待OD6QQ达到0.2左右后，加入0.2%的L-阿拉伯糖，30°C诱导35分钟，直至OD6X达到0.4左右。冰浴冷却。用超纯水洗一次，10%甘油洗两次，最后用10%甘油重悬，甘油用量以使菌体被浓缩500-1000倍的终浓度为宜。[0363]②电击转化:将2mm电转杯从70%乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。4°C预冷30分钟。取90μ1最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μ1IOOng以上步骤（1得到的全长PCR片段（线性DNA，用枪轻轻吸打混匀，冰浴30分钟。电转参数：2500V，200Ω,25yF〇[0364]③复苏与筛选阳性克隆：加入Im1的LB液体培养基，37°C，10Orpm，1小时。然后每200μ1涂布一个卡拉霉素Kan平板，一共5个。均匀、涂干。30°C培养24个小时。挑在卡拉霉素抗性下生长的克隆，作PCR鉴定，筛选阳性克隆。[0365]所获得菌种编号:AT-004-01AT-003-02,AnagA::fKanrf。[0366]3抗性基因的消除[0367]将pCP20转入上述卡拉霉素抗性克隆，30°C培养8h，后提高到42°C过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒逐渐丢失。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板，挑长出的单克隆点到卡拉霉素抗性平板上，未生长的为卡拉霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的克隆。用鉴定引物作PCR对卡拉霉素抗性消失的克隆进行鉴定。[0368]所获得菌种编号:AT-004-02AT-003-02,AnagA。[0369]4、删除nagE基因序列[0370]将N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagN-acetyl-glucosamine-specificenzymeIINag，NagE的基因序列nagE删除，可阻止细胞外GIcNAc被转运回细胞内降解。[0371]1制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段[0372]设计同源臂引物：根据NCBI查找NC_000913，Escherichiacolistr.K_12nagB启动子和nagE基因序列SEQIDNo.13,设计删除nagE基因序列的同源臂正向引物nagEK0-FlSEQIDNo·14，反向引物（nagEK0-RlSEQIDNo·15。[0373]模板:扩增的fKanrfPCR片段。[0374]PCR反应条件：第一步：94°C变性Imin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸lOmin。[0375]扩增产物：同源臂+fKanrf+同源臂。[0376]将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到lOOngμΙ的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。[0377]⑵Red重组操作[0378]首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-004-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。[0379]1转化pKD46质粒[0380]①感受态制备：首先，将保存于-20°C的EscherichiacoliAT-004-02AT-003-02，AnagA菌液，按1:50-100接种于IOmlLB液体培养基中，37°C，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入到IOml离心管中，4000gX5min，弃去上清，用冰浴的0.1MCaCl25ml悬浮5min。最后，4000gX5min离心，弃去上清，用冰浴的0.IMCaCh5ml悬浮。_4°C静置12小时，自然沉降。[0381]②质粒转化:取自然沉降的菌体250μ1，加入5μ1pKD46质粒，-4°C，30min。然后，42°C水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30°C摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30°C过夜12-16小时培养。挑单克隆，加入5mlLB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。[0382]2电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆[0383]①电转感受态的制备:将含pKD46Escherichiacoli菌种AT-004-02接种于含有氨苄青霉素AmpLB培养基的试管，250rpm摇床过夜，第二天以1%的量接种至含有Amp的LB培养基中，30°C培养，待OD6QQ达到0.2左右后，加入0.2%的L-阿拉伯糖，30°C诱导35分钟，直至OD6X达到0.4左右。冰浴冷却。用超纯水洗一次，10%甘油洗两次，最后用10%甘油重悬，甘油用量以使菌体被浓缩500-1000倍的终浓度为宜。[0384]②电击转化:将2mm电转杯从70%乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。4°C预冷30分钟。取90μ1最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μ1IOOng以上步骤（1得到的全长PCR片段（线性DNA，用枪轻轻吸打混匀，冰浴30分钟。电转参数：2500V，200Ω,25yF〇[0385]③复苏与筛选阳性克隆：加入Im1的LB液体培养基，37°C，10Orpm，1小时。然后每200μ1涂布一个卡拉霉素Kan平板，一共5个。均匀、涂干。30°C培养24个小时。挑在卡拉霉素抗性下生长的克隆，作PCR鉴定，筛选阳性克隆。[0386]所获得菌种编号:AT-005-01AT-004-02，AnagE::fKanrf。[0387]3抗性基因的消除[0388]将pCP20转入上述卡拉霉素抗性克隆，30°C培养8h，后提高到42°C过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒逐渐丢失。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板，挑长出的单克隆点到卡拉霉素抗性平板上，未生长的为卡拉霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的克隆。用鉴定引物作PCR对卡拉霉素抗性消失的克隆进行鉴定。[0389]所获得菌种编号:AT-005-02AT-004-02，AnagE。[0390]实施例2.a[0391]本实施例描述了N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的基因nanK的克隆和大肠杆菌中转化nanKpTrc99A质粒，以及ptrc-nanK基因盒向大肠杆菌染色体中的整合。[0392]l、nanK基因的克隆、在大肠杆菌中转化nanKpTrc99A质粒及其对N乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响[0393]扩增EscherichiacoliNanKN-acetylmannosaminekinase，N_乙酰-D-氨基甘露糖激酶）的基因nanK，置于Trc启动子控制下转化菌种，使之过量表达，能够加强ManNAcN-Acety1-D-mannosamine，N_乙酰-D-氨基甘露糖或N-乙酰-D-甘露糖胺）磷酸化为]\11嫩3-6-?1'|-厶〇6七71-〇-1]11111〇8111；[116-6-?，1'|-乙醜-0-氛基甘露糖-6-憐酸）。[0394]1大肠杆菌nanK基因的克隆[0395]根据NCBI查找U00096,获得EscherichiacolinanK基因核苷酸序列SEQIDNo.16,其氨基酸序列SEQIDNo.17。[0396]设计引物：正向引物nanK-FSEQIDNo·18，反向引物nanK-RSEQIDNo·19。[0397]模板:EscherichiacoliAT-001。[0398]PCR反应条件：第一步：94°C变性lmin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸10min。[0399]扩增产物大小：〇.9kb。[0400]PCR产物经I%琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。[0401]将所获得的PCR扩增片段和PUC57-T载体连接并测序鉴定，获得nanKpUC57。[0402]2将nanK基因置于Trc启动子控制下的质粒构建及转化[0403]①质粒构建:扩增质粒nanKpUC57,分别用NcoI和Hindin酶切质粒nanKpUC57和载体pTrc99A，琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收nanK片段和pTrc99A片段，用T4DNA连接酶，16°C将连接过夜，并鉴定，得到nanKpTrc99A质粒。[0404]②感受态制备:首先，将保存于-20°C的AT-005-02菌液，按1:50-100接种于IOmlLB液体培养基中，37°C，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入到IOml离心管中，4000gX5min，弃去上清，用冰浴的0.IMCaCl25ml悬浮5min。最后，4000gX5min离心，弃去上清，用冰浴的0.IMCaCl25ml悬浮。-4°C静置12小时，自然沉降。[0405]③质粒转化:取自然沉降的菌体250μ1，加入5μ1nanKpTrc99A质粒，-4°C，30min。然后，42°C水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30°C摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30°C过夜（12-16小时培养。挑单克隆，加入5mlLB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。得到重组菌nanKpTrc99AAT-005-02[0406]3nanKpTrc99A质粒转化对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响[0407]将重组菌nanKpTrc99AAT-005-02和对照菌种，做摇瓶发酵试验。取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于3ml的LB液体培养基试管（13X150mm中，30°C，225rpm，培养约8小时。LB液体培养基成分:5gl酵母粉，10gl蛋白胨，10glNaCl。然后取种子培养液，3%接种于含50ml的发酵培养液M9培养液250ml摇瓶中。起始OD6qq约0.5，37。:下，225rpm培养，发酵周期72小时。在第24小时、48小时，用10MNaOH调节发酵液pH至7.0。根据发酵液糖耗情况，分次加入65%葡萄糖液维持葡萄糖浓度在20gL。发酵结束，取Iml发酵液，离心。用HPLC法测定N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量。[0408]①N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量的HPLC法测定[0409]缓冲液:将3.5g磷酸氢二钾加入IL容量瓶中，加水足以溶解，加0.25mL氨水，再加水稀释混匀，用磷酸调PH到7.5，以水定容。[0]流动相：乙腈:缓冲液75:25。[0411]稀释液：乙腈和水50:50。[0412]标准溶液：I.OmgmLUSPN-乙酰-D-氨基葡萄糖标准品RS溶于稀释液中。[0413]样品溶液：I.OmgmLN-乙酰-D-氨基葡萄糖样品溶于稀释液中。[0414]液相条件：[0415]型号：LC[0416]检测器：UV195nm[0417]色谱柱：4.6-mmX15_cm;3-ympackingL8[0418]流速：1.5mlmin[0419]柱温：35°C[0420]进样体积：1OyL[0421]②M9培养液的配制[0422]先配制5XM9培养基：将在约800ml双蒸水（CldH2O中加入64gNa2HPO4·7H20、15gKH2P〇4、2·5gNaCl、5·OgNH4CI，溶解后，加水至IOOOml。121°C灭菌30分钟。再分别配制IM1%504、謂0：12、20%葡萄糖，并单独灭菌。然后按表1配制19培养液，其中，1000\微量元素溶液按表2配制。[0423]表1.M9培养液成分[0424][0427]③nanKpTrc99A质粒转化对摇瓶发酵N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响[0428]摇瓶发酵产量情况见表3。结果表明：对照菌种AT-005-02产量很低，未检出，而nanK基因在Trc启动子控制下过量表达的重组菌nanKpTrc99AAT-005-02产量明显提高。[0429]表3.重组菌nanKpTrc99AAT-005-02摇瓶发酵产量[0430][0431]2、pTrc-nanK基因盒向大肠杆菌染色体中整合[0432]以nagE基因位点为pTrc-nanK基因盒在染色体上的整合位点。为达到pTrc-nanK基因盒向大肠杆菌染色体中的整合，首先，扩增带Trc启动子的nanK片段pTrc-nanK，以及两侧带有FLP重组酶识别位点FRT位点）的卡拉霉素抗性基因片段:FRT-Kanr-FRTfKanrf，并拼接。然后，再一次设计删除nagE基因序列同源臂的引物，并以pTrc-nanK和fKanrf拼接的片段为模板，扩增Red重组打靶用线性DNA全长片段。[0433]具体操作过程如下：[0434]IPCR扩增pTrc-nanK片段[0435]模板：nanKpTrc99A。[0436]设计引物：正向引物（Trcff-FSEQIDNo.20,反向引物（Trcff-RSEQIDNo.21。[0437]PCR反应条件：第一步：94°C变性lmin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸lOmin。[0438]产物大小：1.05kb。[0439]PCR产物经I%琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。[0440]⑵PCR扩增fKanrf片段[0441]设计引物：正向引物mfKanf-FSEQIDNo·1，反向引物mfKanf-RSEQIDNo·2。[0442]模板:pPic9K。[0443]PCR反应条件：第一步：94°C变性lmin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸10min。[0444]fKanrf大小：1.28kb。其核苷酸序列SEQIDNo.3。[0445]PCR产物经I%琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。[0446]⑶扩增与pTrc-nanK对接的fKanrf[0447]设计引物：正向引物（fKanf-FSEQIDNo.22,反向引物（fKanf-RSEQIDNo.23。[0448]模板：fKanrf。[0449]PCR反应条件：第一步：94°C变性lmin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸10min。[0450]二次扩增的fKanrf大小：I·3kb。[0451]PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。[0452]⑷制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段[0453]设计同源臂引物:再一次设计删除nagE基因序列同源臂的正向引物nagEK0_F2SEQIDNo·24，反向引物（nagEK0-R2SEQIDNo·25。[0454]模板:pTrc-nanKPCR片段和二次扩增的fKanrfPCR片段，1:1混合。[0455]PCR反应条件：第一步：94°C变性lmin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸10min。[0456]扩增产物：同源臂+pTrc-nanK-fKanrf+同源臂。[0457]将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到lOOngμΙ的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。[0458]⑶Red重组操作[0459]首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-004-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。[0460]1转化pKD46质粒[0461]①感受态制备：首先，将保存于-20°C的EscherichiacoliAT-004-02菌液，按1:50-100接种于IOmlLB液体培养基中，37°C，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入到IOml离心管中，4000gX5min，弃去上清，用冰浴的0·IMCaCh5ml悬浮5min。最后，4000gX5min离心，弃去上清，用冰浴的0.1MCaCl25ml悬浮。-4°C静置12小时，自然沉降。[0462]②质粒转化:取自然沉降的菌体250μ1，加入5μ1pKD46质粒，-4°C，30min。然后，42°C水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30°C摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30°C过夜12-16小时培养。挑单克隆，加入5mlLB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。[0463]2电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆[0464]①电转感受态的制备:将含pKD46Escherichiacoli菌种AT-004-02接种于含有氨苄青霉素AmpLB培养基的试管，250rpm摇床过夜，第二天以1%的量接种至含有Amp的LB培养基中，30°C培养，待OD6QQ达到0.2左右后，加入0.2%的L-阿拉伯糖，30°C诱导35分钟，直至OD6X达到0.4左右。冰浴冷却。用超纯水洗一次，10%甘油洗两次，最后用10%甘油重悬，甘油用量以使菌体被浓缩500-1000倍的终浓度为宜。[0465]②电击转化:将2mm电转杯从70%乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。4°C预冷30分钟。取90μ1最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μ1IOOng以上步骤4得到的全长PCR片段（线性DNA，用枪轻轻吸打混匀，冰浴30分钟。电转参数：2500V，200Ω,25yF〇[0466]③复苏与筛选阳性克隆：加入Im1的LB液体培养基，37°C，10Orpm，1小时。然后每200μ1涂布一个卡拉霉素Kan平板，一共5个。均匀、涂干。30°C培养24个小时。挑在卡拉霉素抗性下生长的克隆，作PCR鉴定，筛选阳性克隆。[0467]所获得菌种编号：AT-006-01AT-004-02,AnagE::pTrc-nanK_fKanrf。[0468]⑶抗性基因的消除[0469]将pCP20转入上述卡拉霉素抗性克隆，30°C培养8h，后提高到42°C过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒逐渐丢失。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板，挑长出的单克隆点到卡拉霉素抗性平板上，未生长的为卡拉霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的克隆。用鉴定引物作PCR对卡拉霉素抗性消失的克隆进行鉴定。[0470]所获得菌种编号:AT-006-02AT-004-02，AnagE::pTrc-nanK。[0471]3、pTrc-nanK基因盒整合对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响[0472]将在染色体nagE基因位点上整合有pTrc-nanK基因盒的重组菌AT-006-02和对照菌种，做摇瓶发酵试验。取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于3ml的LB液体培养基试管（I3X150mm中，30°C，225rpm，培养约8小时。然后取种子培养液，3%接种于含50ml的发酵培养液M9培养液250ml摇瓶中。起始0D600约0.5，37°C下，225rpm培养，发酵周期72小时。在第24小时、48小时，用IOMNaOH调节发酵液pH至7.0。根据发酵液糖耗情况，分次加入65%葡萄糖液维持葡萄糖浓度在20gL。发酵结束，取Iml发酵液，离心。用HPLC法测定N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量。[0473]摇瓶发酵产量情况见表4。结果表明：对照菌种41'-0011'-005-02产量很低，未检出，而pTrc-nanK基因盒整合重组菌产量明显提高，且较未整合的重组菌nanKpTrc99AAT-005-02产量亦有明显提高。[0474]表4.pTrc-nanK基因盒整合重组菌摇瓶发酵产量[0475][0476]实施例2.b[0477]本实施例描述筛选突变的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的基因，所述基因编码酶活性增加的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK。[0478]为了进一步提高生产菌株中的N-乙酰-D-氨基葡萄糖合成量，筛选编码具有酶活性增加的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的基因突变体。为了达到该目的，用易错PCR技术扩增克隆的基因，通过用于扩增的DNA聚合酶，在导致高频错配的条件下扩增所述基因，以便在PCR产物中得到高频突变。[0479]具体操作过程如下：[0480]1、易错PCR扩增大肠杆菌N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶基因nanK[0481]利用TaqDNA聚合酶不具有3’_5’校对功能的性质，在高镁离子浓度8mmolL和不同浓度dNTP的浓度下（其中，dATP和dGTP浓度为1.5mmolL;dTTP和dCTP浓度为3.OmmolL，来控制随机突变的频率，向目的基因中引入随机突变，构建突变库;模板浓度A260值为1000ngmL，酶浓度为5UyL，引物浓度为ΙΟΟμΜ。[0482]易错?〇?反应体系（5^1:10\?〇?反应缓冲液5以1，1阶？（2.511115以1，]\%：122511115μ1，正向引物nanK-F，SEQIDΝο·181μ1，反向引物nanK-R，SEQIDNo.l9lyl，DNA模板nanKpUC570·1μ1，TaqDNA聚合酶0·5μ1，CldH2O32.4μ1。[0483]PCR程序：96°C预变性4min;94°C变性Imin，56°C退火Imin，75°C延伸2min，45个循环;最后75°C延伸15min，采用胶回收方法回收PCR产物产物大小:0.9kb;取5μ1产物1%琼脂糖凝胶电泳检验，_20°C保存备用。[0484]2、构建N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的基因突变体库[0485]将上述PCR产物经限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切消化后，与用NcoI和HindIII内切酶消化的pTrc99A质粒进行连接反应，然后用连接产物混合物转化大肠杆菌AT-005-02，获得大量克隆转化子，构建转化菌体突变库。[0486]3、筛选高酶活突变体[0487]从转化菌体突变库中，随机挑取突变克隆300株，以野生型NanKpTrc99AAT-005-02为对照，分别接种至含50ygmL青霉素Amp的5mlLB培养基中，37°C、150rpm培养18h后，10000rpm，5mim离心收集菌体。弃上清后，在4°C下重悬于ImlPBSpH值7.5,lOmmolL溶液中，在冰浴条件下选取300V电压，超声3s间歇6s对其进行超声破碎IOmin，离心取上清作为酶粗提液，进行酶活测定。[0488]N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK的活性检测：以N-乙酰-D-氨基甘露糖ManNAc被磷酸化多少为依据，也就是N-乙酰-D-氨基甘露糖减少为测定标记。酶活单位定义:在酶促反应条件下，每分钟减少相当于lymolN-乙酰-D-氨基甘露糖的还原糖所需的酶量，定义为一个酶活力单位IU。具体操作如下：以5ml反应体系为酶活测定体系，其中含500mmolLN-乙酰-D-氨基甘露糖、5mmolL葡萄糖、lOOmmolLTris-HClpH8.0及ΙΟΟμΙ粗酶液。酶活反应在37°C水浴中进行，保温4h，然后将酶解液在70°C下IOmin终止反应。3000rpm离心lOmin，取上清液。HPLC测定N-乙酰-D-氨基甘露糖含量。[0489]结果表明：最高突变体菌株的酶活为77.5IUml，对照菌株的酶活为16.3IUml。通过易错PCR对NanK进行改造，获得酶活力提高约5倍的突变株。挑选该酶活性最高的突变体菌株，提取质粒测序。结果表明：该N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶突变体基因序列如SEQIDNo.26所示，对应的氨基酸序列如SEQIDNo.27所示。与野生型的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶基因序列比对，共发生了4处碱基点突变：107AG，309TG，669GC，783AG;致氨基酸3处错义突变，其突变点分别为:Q36R第36位赖氨酸变为精氨酸），1103M第103位异亮氨酸变为蛋氨酸），R223S第223位精氨酸变为丝氨酸）。将该突变基因命名为nanKM。[0490]4、pTrc-nanKM基因盒向大肠杆菌染色体nagE基因位点上整合[0491]以nagE基因位点为pTrc-nanKM基因盒在染色体上的整合位点。为达到pTrc-nanKM基因盒向大肠杆菌染色体中的整合，首先，扩增带Trc启动子的nanKM片段pTrc-nanKM，以及两侧带有FLP重组酶识别位点（FRT位点）的卡拉霉素抗性基因片段：FRT-Kanr-FRTfKanrf，并拼接。然后，再一次设计删除nagE基因序列同源臂的引物，并以pTrc-nanKM和fKanrf拼接的片段为模板，扩增Red重组打靶用线性DNA全长片段。[0492]具体操作过程如下：[0493]IPCR扩增pTrc-nanKM片段[0494]模板:nanKMpTrc99A。[0495]设计引物：正向引物（Trcff-FSEQIDNo.20,反向引物（Trcff-RSEQIDNo.21。[0496]PCR反应条件：第一步：94°C变性lmin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸10min。[0497]产物大小：1.05kb。[0498]PCR产物经I%琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。[0499]⑵PCR扩增fKanrf片段[0500]设计引物：正向引物mfKanf-FSEQIDNo·1，反向引物mfKanf-RSEQIDNo·2。[0501]模板:pPic9K。[0502]PCR反应条件：第一步：94°C变性lmin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸10min。[0503]fKanrf大小：1.28kb。其核苷酸序列SEQIDNo.3。[0504]PCR产物经I%琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。[0505]⑶扩增与pTrc-nanKM对接的fKanrf[0506]设计引物：正向引物（fKanf-FSEQIDNo·22，反向引物（fKanf-RSEQIDNo·230[0507]模板：fKanrf。[0508]PCR反应条件：第一步：94°C变性lmin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸lOmin。[0509]二次扩增的fKanrf大小：I·3kb。[0510]PCR产物经I%琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。[0511]⑷制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段[0512]设计同源臂引物:再一次设计删除nagE基因序列同源臂的正向引物nagEK0-F2SEQIDNo·24，反向引物（nagEK0-R2SEQIDNo·25。[0513]模板:pTrc-nanKMPCR片段和二次扩增的fKanrfPCR片段，1:1混合。[0514]PCR反应条件：第一步：94°C变性Imin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸lOmin。[0515]扩增产物：同源臂+pTrc-nanKM-fKanrf+同源臂。[0516]将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到lOOngμΙ的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。[0517]⑶Red重组操作[0518]首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-004-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。[0519]1转化pKD46质粒[0520]①感受态制备：首先，将保存于-20°C的EscherichiacoliAT-004-02菌液，按1:50-100接种于IOmlLB液体培养基中，37°C，225rpm，振荡培养2-3小时。再将培养液加入IOml离心管中，4000gX5min，弃去上清，用冰浴的0·IMCaCh5ml悬浮5min。最后，4000gX5min离心，弃去上清，用冰浴的0.1MCaCl25ml悬浮。-4°C静置12小时，自然沉降。[0521]②质粒转化:取自然沉降的菌体250μ1，加入5μ1pKD46质粒，-4°C，30min。然后，42°C水浴1.5min，加入SOC培养基0.7ml，30°C摇2小时。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30°C过夜12-16小时培养。挑单克隆，加入5mlLB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。[0522]2电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆[0523]①电转感受态的制备:将含pKD46Escherichiacoli菌种AT-004-02接种于含有氨苄青霉素AmpLB培养基的试管，250rpm摇床过夜，第二天以1%的量接种至含有Amp的LB培养基中，30°C培养，待OD6QQ达到0.2左右后，加入0.2%的L-阿拉伯糖，30°C诱导35分钟，直至OD6X达到0.4左右。冰浴冷却。用超纯水洗一次，10%甘油洗两次，最后用10%甘油重悬，甘油用量以使菌体被浓缩500-1000倍的终浓度为宜。[0524]②电击转化:将2mm电转杯从70%乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。4°C预冷30分钟。取90μ1最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μ1IOOng以上步骤4得到的全长PCR片段（线性DNA，用枪轻轻吸打混匀，冰浴30分钟。电转参数：2500V，200Ω,25yF〇[0525]③复苏与筛选阳性克隆：加入Iml的LB液体培养基，37°C，IOOrpm，1小时。然后每200μ1涂布一个卡拉霉素Kan平板，一共5个。均匀、涂干。30°C培养24个小时。挑在卡拉霉素抗性下生长的克隆，作PCR鉴定，筛选阳性克隆。[0526]所获得菌种编号:AT-007-01AT-004-02,AnagE::pTrc-nanKM-fKanrf。[0527]⑶抗性基因的消除[0528]将pCP20转入上述卡拉霉素抗性克隆，30°C培养8h，后提高到42°C过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒逐渐丢失。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板，挑长出的单克隆点到卡拉霉素抗性平板上，未生长的为卡拉霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的克隆。用鉴定引物作PCR对卡拉霉素抗性消失的克隆进行鉴定。[0529]所获得菌种编号:AT-007-02AT-004-02,AnagE::pTrc-nanKM。[0530]5、pTrc-nanKM基因盒整合对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响[0531]将在染色体nagE基因位点上整合有pTrc-nanKM基因盒的重组菌AT-007-02和对照菌种，做摇瓶发酵试验。取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于3ml的LB液体培养基试管（I3X150mm中，30°C，225rpm，培养约8小时。然后取种子培养液，3%接种于含50ml的发酵培养液M9培养液250ml摇瓶中。起始0D600约0.5，37°C下，225rpm培养，发酵周期72小时。在第24小时、48小时，用IOMNaOH调节发酵液pH至7.0。根据发酵液糖耗情况，分次加入65%葡萄糖液维持葡萄糖浓度在20gL。发酵结束，取Iml发酵液，离心。用HPLC法测定N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量。[0532]摇瓶发酵产量情况见表5。结果表明：对照菌种AT-005-02产量很低，未检出，突变的pTrc-nanKM基因盒整合重组菌AT-007-02产量明显提高，且较未突变的对照菌种AT-006-02广量亦有明显提尚。[0533]表5.pTrc-nanKM基因盒整合重组菌摇瓶发酵产量[0534][0535]以上结果显示:不仅N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶超表达可明显提高N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量，通过易错PCR技术筛选突变体也可大大提高N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量，这是由于所获得的该激酶突变体酶活性增加所致。[0536]实施例2.C[0537]本实施例描述整合有pTrc-nanKM盒的大肠杆菌菌株，其中表达透明颤菌血红蛋白Vhb的基因vhb及其突变体，对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响。[0538]扩增透明颤菌血红蛋白（Vhb的基因vhb，并插入pTrc99A，从而将vhb置于Trc启动子控制下转化菌种，或筛选透明颤菌血红蛋白（Vhb的基因vhb突变体插入pTrc99A，转化菌种，以提高微生物利用溶氧的能力，提高N-乙酰-氨基葡萄糖发酵生产产量。[0539]1、整合有pTrc-nanKM盒的大肠杆菌菌株，表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的基因vhb[0540]⑴扩增vhb基因，并插入pTrc99A[0541]透明颤菌血红蛋白基因核苷酸序列SEQIDNo.60,氨基酸序列SEQIDNo.61。根据Escherichiacoli偏爱密码子碱基优化并合成透明颤菌血红蛋白基因，装入pUC57载体。得载体命名为:pVSpUC57。[0542]设计引物：正向引物vhb-FSEQIDNo.62,反向引物Vhb-RSEQIDNo.63。[0543]模板:pVSpUC57。[0544]PCR反应条件：第一步：94°C变性lmin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸lOmin。[0545]扩增产物大小:441bp。[0546]PCR产物经I%琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收片段。[0547]将所获得的PCR扩增片段和载体pTrc99A分别用NcoI和HindΙΠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收vhb片段和pTrc99A片段，用T4DNA连接酶，16°C连接过夜，并鉴定，得到vhbpTrc99A质粒。[0548]2用vhbpTrc99A转化整合有pTrc-NanKM盒的大肠杆菌菌株[0549]1感受态制备[0550]①保存于-20°C的AT-007-02菌液，按1:50-100接种于IOmlLB液体培养基中，37°C，225rpm，振荡培养2-3小时。[0551]②将培养液加入到IOml离心管中，4000gX5min，弃去上清，用冰浴的0.IMCaCl25ml悬浮5min〇[0552]③4000gX5min离心，弃去上清，用冰浴的O.IMCaCl25ml悬浮。-4°C静置12小时，自然沉降。[0553]2质粒转化[0554]①取自然沉降的菌体250μ1，加入5μ1vhbpTrc99A质粒，-4°C，30min。[0555]②42°C水浴I·5min，加入SOC培养基0·7ml，30°C摇2小时。[0556]③取0.2ml菌液，涂青霉素平板。[0557]④30°C过夜（12-16小时）培养。[0558]⑤挑单克隆，加入5mlLB液体培养基中培养，抽质粒鉴定。[0559]⑥保存阳性克隆备用。[0560]所获得菌种编号:厶1'-〇5201'-〇〇7-〇2，¥汕如1'代99八）。[0561]2、整合有pTrc-nanKM盒的大肠杆菌菌株，表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的基因vhb突变体[0562]为了进一步提高生产菌株中的N-乙酰-D-氨基葡萄糖合成量，筛选编码具有活性增加的透明颤菌血红蛋白（Vhb的基因突变体。为了达到该目的，用易错PCR技术扩增克隆的基因，通过用于扩增的DNA聚合酶，在导致高频错配的条件下扩增所述基因，以便在PCR产物中得到高频突变。[0563]具体操作过程如下：[0564]1易错PCR扩增大肠杆菌透明颤菌血红蛋白基因vhb[0565]利用TaqDNA聚合酶不具有3’_5’校对功能的性质，在高镁离子浓度8mmolL和不同浓度dNTP的浓度下（其中，dATP和dGTP浓度为1.5mmolL;dTTP和dCTP浓度为3.OmmolL，来控制随机突变的频率，向目的基因中引入随机突变，构建突变库;模板浓度A260值为1000ngmL，酶浓度为5UyL，引物浓度为ΙΟΟμΜ。[0566]易错?〇?反应体系（5^1:10\?〇?反应缓冲液5以1，1阶？2.511115以1，]\%：122511115μ1，正向引物（vhb-F，SEQIDΝο·621μ1，反向引物（vhb-R，SEQIDNo.63lyl，DNA模板nanKpUC570.1yl，TaqDNA聚合酶0·5μ1，ΜΗ2〇32·4μ1。[0567]PCR程序：96°C预变性4min;94°C变性Imin，56°C退火Imin，75°C延伸2min，45个循环;最后75°C延伸15min，采用胶回收方法回收PCR产物产物大小：0.44kb;取5μ1产物I%琼脂糖凝胶电泳检验，_20°C保存备用。[0568]2构建透明颤菌血红蛋白的基因突变体库[0569]将上述PCR产物经限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切消化后，与用NcoI和HindIII内切酶消化的pTrc99A质粒进行连接反应，然后用连接产物混合物转化大肠杆菌AT-005-02，获得大量克隆转化子，构建转化菌体突变库。[0570]3筛选高活性突变体[0571]从转化菌体突变库中，随机挑取突变克隆420株，以野生型vhbpTrc99AAT-005-02为对照，分别接种至含50ygmL青霉素Amp的5mlLB培养基中，37°C、150rpm培养18h后，10000rpm，5mim离心收集菌体。弃上清后，在4°C下重悬于ImlPBSpH值7.5,10mmolL溶液中，在冰浴条件下选取300V电压，超声3s间歇6s对其进行超声破碎IOmin，离心取上清作为粗提液，进行活性测定。[0572]透明颤菌血红蛋白活性测定:采用CO-差光谱法做透明颤菌血红蛋白（Vhb的活性检测。由于CO与透明颤菌血红蛋白结合后在约420nm光波处会产生强烈的吸收峰，形成典型的Vhb蛋白特征曲线，故可根据此吸收峰强弱的检测结果，来反应所表达的Vhhb蛋白的活性状况。检测方法:针对以上不同类型的重组大肠杆菌在限氧摇瓶培养和在低氧条件下溶氧〇994和¥1^]\1pTrc99A质粒利用CaCl2转化法转化至AT-OlI、AT-013中，挑单克隆培养，抽质粒鉴定阳性克隆。[1107]所获得菌种编号：AT-064AT-011，vhbpTrc99A、AT-065AT-011，vhbMpTrc99A、AT-066AT-013，vhbpTrc99A、AT-067AT-013，vhbMpTrc99A。[1108]对表达透明颤菌血红蛋白及其突变体菌株AT-064、AT-065、AT-066、AT-067，做摇瓶发酵试验。重组菌摇瓶发酵产量情况见表19。结果表明：表达vhb，无论是转化vhbpTrc99A，还是转化vhbMpTrc99A质粒，均能明显提高产量，且转化vhbMpTrc99A质粒对产量的提尚更明显。[1109]表19.重组菌摇瓶发酵产量[1112]实施例8[1113]本实施例描述整合有pTrc-nanKM盒的大肠杆菌菌株，并将wecB基因内源性天然启动子换成Trc启动子，再表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的基因vhb及其突变体，对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响。[1114]1、将整合有pTrc-nanKM盒的大肠杆菌菌株的wecB基因内源性天然启动子换成Trc启动子[1115]首先，扩增Trc启动子序列片段与fKanrf片段，并拼接。然后，设计同源臂引物，扩增Red重组打靶用线性DNA全长片段。[1116]1制备Red重组打靶用线性DNA全长PCR片段[1117]设计同源臂引物:根据NCBI查找NC_000913,获得EscherichiacoliUDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶wecB基因启动子的核苷酸序列SEQIDNo.53,设计更换为Trc启动子的同源臂正向引物ProwecBpTrc-FSEQIDNo.54,反向引物ProwecBpTrc-RSEQIDNo·55。[1118]模板:Trc启动子PCR片段和二次扩增的fKanrfPCR片段，1:1混合。[1119]PCR反应条件：第一步：94°C变性lmin;第二步：94°C30s，55°C30s，72°C40s，循环30次;第三步：72°C延伸lOmin。[1120]扩增产物：同源臂+fKanrf+Trc启动子+同源臂。[1121]将PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，得到1OOngμΙ的线性DNA全长PCR片段用于Red重组打靶。[1122]2Red重组操作[1123]首先，将pKD46载体转入大肠杆菌AT-007-02菌株中。然后，电转化制备好的打靶用线性DNA片段，筛选阳性克隆。最后，消除抗性基因。[1124]所获得菌种编号：AT-019AT-007-02,AwecBpromotor::Trcpromoter。[1125]2、整合有pTrc-nanKM盒的大肠杆菌菌株，并将wecB基因内源性天然启动子换成Trc启动子，再表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的基因vhb及其突变体[1126]首先，制备重组大肠杆菌菌株41'-019感受态，然后，将¥1113?1^〇994和¥1^1pTrc99A质粒利用CaCl2转化法转化至AT-019中，挑单克隆培养，抽质粒鉴定阳性克隆。[1127]所获得菌种编号：AT-068AT-019,vhbpTrc99A、AT-069AT-019,vhbMpTrc99A。[1128]对表达透明颤菌血红蛋白及其突变体菌株AT-068、AT-069,做摇瓶发酵试验。重组菌摇瓶发酵产量情况见表20。结果表明：表达vhb，无论是转化vhbpTrc99A，还是转化vhbMpTrc99A质粒，均能明显提高产量，且转化vhbMpTrc99A质粒对产量的提高更明显。[1129]表20.重组菌摇瓶发酵产量[1130][1131]实施例9[1132]本实施例描述整合有pTrc-nanEM盒的大肠杆菌菌株，并将氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的基因glmS和或D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的基因nagB的内源性天然启动子更换和或删除，再表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的基因vhb及其突变体，对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响。[1133]将整合有pTrc-nanEM盒的大肠杆菌菌株的nagB基因内源性天然启动子换成Trc启动子，得AT-032AT-031-02,AnagBpromotor::Trcpromoter，并进一步删除glmS基因内源性天然启动子得AT-033AT-032,AglmSpromotor;将整合有pTrc-nanEM盒的大肠杆菌菌株的glmS基因内源性天然启动子换成Trc启动子得AT-034AT-031-02,AglmSpromotor::Trcpromoter，并进一步删除nagB基因内源性天然启动子得AT-035AT-034，AnagBpromotor〇[1134]制备重组大肠杆菌菌株AT-033、AT-035感受态，然后，将vhbpTrc99A和vhbMpTrc99A质粒利用CaCl2转化法转化至AT-033、AT-035中，挑单克隆培养，抽质粒鉴定阳性克隆。[1135]所获得菌种编号：AT-070AT-033，vhbpTrc99A、AT-071AT-033，vhbMpTrc99A、AT-072AT-035，vhbpTrc99A、AT-073AT-035，vhbMpTrc99A。[1136]对表达透明颤菌血红蛋白及其突变体菌株AT-070、AT-071、AT-072、AT-073，做摇瓶发酵试验。重组菌摇瓶发酵产量情况见表21。结果表明：表达vhb，无论是转化vhbpTrc99A，还是转化vhbMpTrc99A质粒，均能明显提高产量，且转化vhbMpTrc99A质粒对产量的提尚更明显。[1137]表21.重组菌摇瓶发酵产量[1138][1139]实施例10[1140]本实施例描述整合有pTrc-nanEM盒的大肠杆菌菌株，并将wecB基因内源性天然启动子换成Trc启动子，再表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的基因vhb及其突变体，对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响。[1141]将整合有pTrc-nanKM盒的大肠杆菌菌株的wecB基因内源性天然启动子换成Trc启动子，得AT-〇37AT-〇31-〇2,AwecBpromotor::Trcpromoter。[1142]制备重组大肠杆菌菌株AT-037感受态，然后，将vhbpTrc99A和vhbMpTrc99A质粒利用CaCl2转化法转化至AT-037中，挑单克隆培养，抽质粒鉴定阳性克隆。[1143]所获得菌种编号：AT-074AT-037，vhbpTrc99A、AT-075AT-037，vhbMpTrc99A。[1144]对表达透明颤菌血红蛋白及其突变体菌株AT-074、AT-075,做摇瓶发酵试验。重组菌摇瓶发酵产量情况见表22。结果表明：表达vhb，无论是转化vhbpTrc99A，还是转化vhbMpTrc99A质粒，均能明显提高产量，且转化vhbMpTrc99A质粒对产量的提高更明显。[1145]表22.重组菌摇瓶发酵产量[1146][1147]实施例11[1148]本实施例描述整合有pTrc-wecBM盒的大肠杆菌菌株，并将将氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的基因glmS和或D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶NagB的基因nagB的内源性天然启动子更换和或删除，再表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的基因vhb及其突变体，对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响。[1149]将整合有pTrc-wecBM盒的大肠杆菌菌株的nagB基因内源性天然启动子换成Trc启动子，得AT-044AT-043-02,AnagBpromotor::Trcpromoter，并进一步删除glmS基因内源性天然启动子得AT-045AT-044,AglmSpromotor;将整合有pTrc-wecBM盒的大肠杆菌菌株的glmS基因内源性天然启动子换成Trc启动子得AT-046AT-043-02，AglmSpromotor::Trcpromoter，并进一步删除nagB基因内源性天然启动子得AT-047AT-046，AnagBpromotor〇[1150]制备重组大肠杆菌菌株AT-045、AT-047感受态，然后，将vhbpTrc99A和vhbMpTrc99A质粒利用CaCl2转化法转化至AT-045、AT-047中，挑单克隆培养，抽质粒鉴定阳性克隆。[1151]所获得菌种编号：AT-076AT-045，vhbpTrc99A、AT-077AT-045，vhbMpTrc99A、AT-078AT-047，vhbpTrc99A、AT-079AT-047，vhbMpTrc99A。[1152]对表达透明颤菌血红蛋白及其突变体菌株AT-076、AT-077、AT-078、AT-079，做摇瓶发酵试验。重组菌摇瓶发酵产量情况见表23。结果表明：表达vhb，无论是转化vhbpTrc99A，还是转化vhbMpTrc99A质粒，均能明显提高产量，且转化vhbMpTrc99A质粒对产量的提尚更明显。[1153]表23.重组菌摇瓶发酵产量[1154]_[1155]实施例12[1156]本实施例描述整合有pTrC-NanKM盒、将nanE基因内源性天然启动子换成Trc启动子的大肠杆菌菌株、将glmS基因和NagB基因的内源性天然启动子更换和或删除、将wecB基因内源性天然启动子换成Trc启动子，再表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的基因vhb及其突变体，对N-乙酰-D-氨基葡萄糖产量的影响。[1157]将整合有pTrc-nanKM盒，并将nagB基因内源性天然启动子换成Trc启动子和同时删除glmS基因内源性天然启动子的大肠杆菌菌株中，nanE基因内源性天然启动子换成Trc启动子，得AT-015AT-011，AnanEpromotor::Trcpromoter，并进一步将wecB基因内源性天然启动子换成Trc启动子，得AT-〇27AT_015,AwecBpromotor::Trcpromoter;将整合有pTrc-nanKM盒，并将glmS基因内源性天然启动子换成Trc启动子和同时删除nagB基因内源性天然启动子的大肠杆菌菌株中，nanE基因内源性天然启动子换成Trc启动子4#AT-017AT-013，AnanEpromotor::Trcpromoter，并进一步将wecB基因内源性天然启动子换成Trc启动子，得AT-029AT_017，AwecBpromotor::Trcpromoter。[1158]制备重组大肠杆菌菌株AT-027、AT-029感受态，然后，将vhbpTrc99A和vhbMpTrc99A质粒利用CaCl2转化法转化至AT-027、AT-029中，挑单克隆培养，抽质粒鉴定阳性克隆。[1159]所获得菌种编号：AT-080AT-027，vhbpTrc99A、AT-081AT-027，vhbMpTrc99A、AT-082AT-029，vhbpTrc99A、AT-083AT-029，vhbMpTrc99A。[1160]对表达透明颤菌血红蛋白及其突变体菌株AT-080、AT-081、AT-082、AT-083，做摇瓶发酵试验。重组菌摇瓶发酵产量情况见表24。结果表明：表达vhb，无论是转化vhbpTrc99A，还是转化vhbMpTrc99A质粒，均能明显提高产量，且转化vhbMpTrc99A质粒对产量的提尚更明显。[1161]表24.重组菌摇瓶发酵产量[1164]实施例13[1165]本实施例描述以IOL发酵罐生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖发酵试验[1166]以重组工程菌株AT-083作为生产菌种，以IOL发酵罐做生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖发酵试验。[1167]1、种子培养[1168]1—级种子培养:挑取新鲜培养的LB平板培养基上单克隆菌株，接种于8ml的LB液体培养基中，37°C、225rpm培养8小时。[1169]2二级种子培养:取6ml—级种子培养液，接种于含200ml的M9培养液的IOOOml摇瓶中，37°C、225rpm培养16小时。至OD6qq值为6.0-10，约为对数生长中期。[1170]3发酵培养基按表25配制，其中，微量元素溶液按表26配制，复合维生素溶液按表27配制。[1171]表25.发酵培养基[1172][1173]注：[1174]①微量元素溶液单独灭菌后加入，维生素溶液过滤后加入；[1175]②葡萄糖:浓度65%wv，单独灭菌，在接种前加入，葡萄糖加入量:6.OgL;[1176]③以上合并一起后，用IOMNH4OH调pH至7.0;[1177]④发酵培养基在加入葡萄糖之前为基础培养基，基础培养基的初始装液量培养基的初始体积占发酵罐总容量体积）：50%。[1178]表26.微量元素溶液[1179][1182]2、接种[1183]将二级种子液按40mlL接种至发酵罐，接种量:2.5-5%似体积计），起始OD600为0·3_0·5〇[1184]3、工艺参数[1185]利用IOL自控发酵罐进行高密度发酵，以机带软件对其进行数据采集，实现计算机在线控制。控制参数为:空气流量按〇.5-lvvm溶氧多20%，以增加转速和通气调节;温度37°C;pH值7.0，自动流加饱和氨水以保持恒定。在基础培养基中葡萄糖消耗完，即溶氧回升时开始补糖。补糖速度以控制残糖浓度〇.45gL以下为标准。补糖液葡萄糖为浓度65%wV，并加入2.5%葡萄糖酸钠或6%核糖。60-72h发酵中止。总装液量:75-80%。[1186]4、实例（IOL发酵罐）[1187]1菌种编号:AT-083。批号：1019。[1188]2种子液浓度:OD6〇o为2.8。[1189]⑶基料：4L。[1190]⑷接种量200mL。[1191]5补糖速度:控制残糖浓度0·45gL以下。[1192]6补糖液:葡萄糖为浓度65%wv并加入2.5%葡萄糖酸钠。[1193]⑵跟踪指标:检测OD600、残糖含量发酵液中残存葡萄糖）。[1194]⑶产物:N-乙酰-D-氨基葡萄糖。效价:72小时156gL。[1195]实施例14[1196]本实施例描述N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖盐酸盐分离纯化后处理工艺[1197]1、N_乙酰-D-氨基葡萄糖精制[1198]1灭活:发酵液80°C，30min。[1199]2固液分离：4000-8000rpm离心，弃菌渣与蛋白，取发酵液。也可以用陶瓷膜过滤。[1200]3脱色:产品：水:活性炭=1:1.5-3:0.01-0.1，搅拌0.5_5h。[1201]⑷除盐:电渗析除盐。浓室罐装入发酵液初始盐浓度:0.01-0.05moIL。淡室发酵液流速:40-80Lh，浓室发酵液流速:40-80Lh，单膜对的电压0.5-1.4V。也可以采用阴、阳离子交换树脂除盐。[1202]5浓缩:将除盐后发酵液真空条件下（0.095MPa加热50-80°C，浓缩8-15h，至过饱和，约4-6倍。[1203]6结晶：浓缩后的发酵液先25°C水降温至25-35°C，再用TC水降温l_3h，至0-10°C。加无水乙醇（用量为产品重量5-20倍），700-1500rpm搅拌15min-lh。[1204]⑵洗涤:加无水乙醇与产品等量搅拌10-100rpm，0.5-2h。[1205]⑶烘干：50-100°C，3-1Oh。纯度：99·96%。总产率为91·5%。[1206]2、D-氨基葡萄糖盐酸盐精制[1207]1灭活：发酵液8〇°C，3Omin。[1208]2固液分离：4000-8000rpm离心，弃菌渣与蛋白，取发酵液。也可以用陶瓷膜过滤。[1209]3脱色:产品：水:活性炭=1:1.5-3:0.01-0.1，搅拌0.5_5h。[1210]4除盐:电渗析除盐。浓室罐装入发酵液初始盐浓度:0.01-0.05moIL。淡室发酵液流速:40-80Lh，浓室发酵液流速:40-80Lh，单膜对的电压0.5-1.4V。也可以采用阴、阳离子交换树脂除盐。[1211]5浓缩:将除盐后发酵液真空条件下（0.095MPa加热50-80°C，浓缩8-15h，至过饱和，约4-6倍。[1212]6水解:浓缩后的发酵液转入搪瓷或玻璃容器中，加入浓盐酸37%至终浓度为12-16%，搅匀，70°C保温90min。盐酸可循环套用。[1213]⑵结晶：先25°C水降温至25-35°C，再用0°C水降温I_3h，至4°C。[1214]8洗涤：加无水乙醇（与产品等量搅拌10-100rpm，0.5-2h。离心700-1500rpm，15-60min，得氨基葡萄糖盐酸盐，转化率为89.5%。[1215]9溶解:洗涤后的产品溶于水中，水用量约为原发酵液体积。[1216]10脱色：加入活性炭（用量为1%。混合30分钟后。离心700-1500rpm，15-60min。或过滤，得到无色滤液。[1217]11重结晶：在50°C与55cmHg真空中对滤液进行真空蒸发至过饱和。加无水乙醇用量为产品重量5-20倍），700-1500rpm搅拌15min-lh。[1218]12洗涤：加无水乙醇（与产品等量搅拌10-100rpm，0.5-2h。离心700-1500rpm，15_60min〇[1219]13烘干:50-100°C，3-10h。纯度:99.92%。总产率为84.6%。[1220]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

权利要求：1.一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：A在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种能表达透明颤菌血红蛋白Vhb的遗传修饰;和B收集从培养步骤A中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖。优选，进一步包括C由N-乙酰-D-氨基葡萄糖脱乙酰化得到D-氨基葡萄糖盐。进一步优选，所述盐选自盐酸盐、硫酸盐、钠盐、磷酸盐和硫酸氢盐。2.如权利要求1所述的方法，其中，微生物用至少一种编码透明颤菌血红蛋白（Vhb的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码透明颤菌血红蛋白（Vhb的核酸序列含有至少一种增加透明颤菌血红蛋白Vhb的活性的遗传修饰;进一步优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDNO:61的下述位置处的取代中的一种或多种:第45位甲硫氨酸被亮氨酸取代、第86位半胱氨酸被甘氨酸取代和第95位酪氨酸被丝氨酸取代;更优选，编码所述透明颤菌血红蛋白（Vhb的核酸序列为SEQIDNO:64。优选，所述的透明颤菌血红蛋白（Vhb具有与SEQIDN0:61的氨基酸序列至少约30%相同，优选至少约50%相同，进一步优选至少约70%相同，进一步优选至少约80%相同，更进一步优选至少约90%相同，最优选至少约95%相同的氨基酸序列，其中所述的透明颤菌血红蛋白（Vhb具有活性;进一步优选，所述的透明颤菌血红蛋白（Vhb具有SEQIDN0:61的氨基酸序列。进一步优选，重组核酸分子中编码透明颤菌血红蛋白（Vhb的基因拷贝数大于或等于1〇进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：1包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰；2包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶作用的遗传修饰；3包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰，优选同时包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰；⑷包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰，并同时包含至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰；5包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。4.如权利要求3所述的方法，其中，提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶作用的遗传修饰选自a微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的酶活性增加；和或b微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。5.如权利要求4所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的核酸序列含有至少一种增加N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的酶活性的遗传修饰;进一步优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDNO:17的下述位置处的取代中的一种或多种:第36位赖氨酸被精氨酸取代、第103位异亮氨酸被蛋氨酸取代和第223位精氨酸被丝氨酸取代;更优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的核酸序列为SEQIDNO:26。优选，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶具有与SEQIDNO:17的氨基酸序列至少约30%相同，优选至少约50%相同，进一步优选至少约70%相同，进一步优选至少约80%相同，更进一步优选至少约90%相同，最优选至少约95%相同的氨基酸序列，其中所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶具有酶活性;进一步优选，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶具有SEQIDNO:17的氨基酸序列。进一步优选，重组核酸分子中编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。6.如权利要求4所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰;优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。7.如权利要求3所述的方法，其中，提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶作用的遗传修饰选自a微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的酶活性增加;和或b微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。8.如权利要求7所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码N-乙酰-D-氨基甘露糖_6-磷酸异构酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的核酸序列含有至少一种增加N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的酶活性的遗传修饰。优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDN0:29的下述位置处的取代中的一种或两种:第133位半胱氨酸被精氨酸取代和第187位酪氨酸被组氨酸取代。进一步优选，编码所述N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶NanE的核酸序列为SEQIDNO:56。优选，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶具有与SEQIDNO:29的氨基酸序列至少约30%相同，优选至少约50%相同，进一步优选至少约70%相同，进一步优选至少约80%相同，更进一步优选至少约90%相同，最优选至少约95%相同的氨基酸序列，其中所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶具有酶活性;进一步优选，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶具有SEQIDNO:29的氨基酸序列。进一步优选，重组核酸分子中编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。9.如权利要求7所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰;优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖_6-磷酸异构酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换；进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。10.如权利要求3所述的方法，其中，提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自a微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性增加;和或b微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。11.如权利要求10所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的核酸序列含有至少一种增加D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性的遗传修饰。进一步优选，重组核酸分子中编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。12.如权利要求10所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。13.如权利要求3所述的方法，其中，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自a微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性降低;和或b微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的表达减少；优选，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。进一步优选，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活;更优选，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰为编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。14.如权利要求3所述的方法，其中，提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自a微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性增加;和或b微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。15.如权利要求14所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的核酸序列含有至少一种增加氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性的遗传修饰。进一步优选，重组核酸分子中编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。16.如权利要求14所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。17.如权利要求3所述的方法，其中，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自a微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性降低;和或b微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的表达减少；优选，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。进一步优选，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活;更优选，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰为编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。18.如权利要求3所述的方法，其中，提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶作用的遗传修饰选自a微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的酶活性增加；和或b微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。19.如权利要求18所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的核酸序列含有至少一种增加UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的酶活性的遗传修饰。优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDNO:50的下述位置处的取代中的一种或多种:第34位半胱氨酸被丝氨酸取代、第145位组氨酸被天冬氨酸取代、第226位半胱氨酸被苯丙氨酸取代和245位缬氨酸被甘氨酸取代;更优选，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的核酸序列为SEQIDN0：58〇优选，所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶具有与SEQIDNO:50的氨基酸序列至少约30%相同，优选至少约50%相同，进一步优选至少约70%相同，进一步优选至少约80%相同，更进一步优选至少约90%相同，最优选至少约95%相同的氨基酸序列，其中所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB具有酶活性;进一步优选，所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶具有SEQIDNO:50的氨基酸序列。进一步优选，重组核酸分子中编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。20.如权利要求18所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰;优选，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。21.如权利要求1-20任一项所述的方法，其中，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：1包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，PmmanManXYZ作用的遗传修饰；⑵包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰；3包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰；⑷包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE作用的遗传修饰；⑸包含至少一种能提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶SlmM作用的遗传修饰；⑹包含至少一种能提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GImU作用的遗传修饰。22.如权利要求21所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EnM，PIIImanManXYZ作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。优选，降低微生物中甘露糖转运蛋白ΕΠΜ，PIIImanManXYZ作用的遗传修饰选自编码微生物中甘露糖转运蛋白ΕΠΜ，PIIImanManXYZ的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，PIIImanManXYZ基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活;更优选，降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，PIIImanManXYZ作用的遗传修饰为编码微生物中甘露糖转运蛋白ΕΠΜ，ΡΙΠΜηManXYZ的内源性基因完全缺失，即被删除。23.如权利要求21所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。优选，降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活;更优选，降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA的内源性基因完全缺失，即被删除。24.如权利要求21所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活;更优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA的内源性基因完全缺失，即被删除。25.如权利要求21所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IIfegNagE作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IfagNagE基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活;更优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE的内源性基因完全缺失，即被删除。26.如权利要求21所述的方法，其中，提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶®lmM作用的遗传修饰选自a微生物中磷酸葡糖胺变位酶GlmM的酶活性增加;和或b微生物中磷酸葡糖胺变位酶GlmM被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶GlmM作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。27.如权利要求26所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的核酸序列含有至少一种增加磷酸葡糖胺变位酶GlmM的酶活性的遗传修饰。进一步优选，重组核酸分子中编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。28.如权利要求26所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的基因的内源性天然启动子的遗传修饰;优选，编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。29.如权利要求21所述的方法，其中，提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶®lmU作用的遗传修饰选自a微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的酶活性增加;和或b微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。30.如权利要求29所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的核酸序列含有至少一种增加双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的酶活性的遗传修饰。进一步优选，重组核酸分子中编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。31.如权利要求29所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的基因的内源性天然启动子的遗传修饰;优选，编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中，重组核酸分子被装入质粒中或重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中，所述重组核酸分子的表达是可诱导的;优选，所述重组核酸分子的表达可由乳糖诱导。34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中，所述培养步骤A在约20°C-约45°C进行;优选，在约33°C-约37°C进行。优选，所述培养步骤A在约pH4.5-约pH8.5进行;优选在约pH6.7-约pH7.2进行。优选，所述培养步骤A采用补料发酵法。进一步优选，补糖液包含葡萄糖和核糖，优选，葡萄糖浓度为1〇%_85%wv，核糖浓度为0.5%-15%wv，进一步优选，葡萄糖浓度为55%-75%wv，核糖浓度为5%-7%wv;进一步优选，补糖液包含葡萄糖和葡萄糖酸盐，优选，葡萄糖浓度为10%-85%wv，葡萄糖酸盐浓度为〇.5%-15%wv，进一步优选，葡萄糖浓度为55%-75%wv，葡萄糖酸盐浓度为2%-3%wv;进一步优选，补糖液包含葡萄糖、核糖和葡糖酸盐，优选，葡萄糖浓度为10%-85%wV，核糖浓度为0.5%-15%wv，葡萄糖酸盐浓度为0.5%-15%wv，进一步优选，葡萄糖浓度为55%-75%wv，核糖浓度为5%-7%wv，葡萄糖酸盐浓度为2%-3%wv。更优选，葡萄糖酸盐为葡萄糖酸钠。35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中，所述收集步骤B包括a从去除微生物的发酵液中沉淀N-乙酰-D-氨基葡萄糖;和或⑹从去除微生物的发酵液中结晶N-乙酰-D-氨基葡萄糖。优选，所述收集步骤B进一步包括将发酵液脱色的步骤;进一步优选，所述脱色步骤在对发酵液进行沉淀或结晶之前、在对发酵液进行一次或多次沉淀或结晶重溶解之后进行；更优选，所述脱色步骤包括活性炭处理和或色谱脱色。36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中，所述步骤C在酸性和加热条件下进行或在酶催化下进行。优选，在30%-37%盐酸溶液中、60°C-90°C下脱乙酰化水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖得到D-氨基葡萄糖盐酸盐。优选，在UDP-3-0-N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶作用下水解N-乙酰-D-氨基葡萄糖得到D-氨基葡萄糖，并进一步成盐。37.—种微生物，该微生物包含至少一种能表达透明颤菌血红蛋白（Vhb的遗传修饰。38.如权利要求37所述的微生物，其中，微生物用至少一种编码透明颤菌血红蛋白Vhb的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码透明颤菌血红蛋白（Vhb的核酸序列含有至少一种增加透明颤菌血红蛋白Vhb的活性的遗传修饰;进一步优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDNO:61的下述位置处的取代中的一种或多种:第45位甲硫氨酸被亮氨酸取代、第86位半胱氨酸被甘氨酸取代和第95位酪氨酸被丝氨酸取代;更优选，编码所述透明颤菌血红蛋白（Vhb的核酸序列为SEQIDNO:64。优选，所述的透明颤菌血红蛋白（Vhb具有与SEQIDN0:61的氨基酸序列至少约30%相同，优选至少约50%相同，进一步优选至少约70%相同，进一步优选至少约80%相同，更进一步优选至少约90%相同，最优选至少约95%相同的氨基酸序列，其中所述的透明颤菌血红蛋白（Vhb具有活性;进一步优选，所述的透明颤菌血红蛋白（Vhb具有SEQIDN0:61的氨基酸序列。进一步优选，重组核酸分子中编码透明颤菌血红蛋白（Vhb的基因拷贝数大于或等于1〇进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。39.如权利要求37或38所述的微生物，其中，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：1包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶NanK作用的遗传修饰；2包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶作用的遗传修饰；3包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰，优选同时包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰；⑷包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰，并同时包含至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰；5包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB作用的遗传修饰。40.如权利要求39所述的微生物，其中，提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶作用的遗传修饰选自a微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的酶活性增加;和或b微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。41.如权利要求40所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的核酸序列含有至少一种增加N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的酶活性的遗传修饰;进一步优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDNO:17的下述位置处的取代中的一种或多种:第36位赖氨酸被精氨酸取代、第103位异亮氨酸被蛋氨酸取代和第223位精氨酸被丝氨酸取代;更优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的核酸序列为SEQIDNO:26。优选，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶具有与SEQIDNO:17的氨基酸序列至少约30%相同，优选至少约50%相同，进一步优选至少约70%相同，进一步优选至少约80%相同，更进一步优选至少约90%相同，最优选至少约95%相同的氨基酸序列，其中所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶具有酶活性;进一步优选，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶具有SEQIDNO:17的氨基酸序列。进一步优选，重组核酸分子中编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。42.如权利要求40所述的微生物，其中，微生物包括至少一种对编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰;优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。43.如权利要求39所述的微生物，其中，提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶作用的遗传修饰选自a微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的酶活性增加；和或b微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。44.如权利要求43所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的核酸序列含有至少一种增加N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的酶活性的遗传修饰。优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDN0:29的下述位置处的取代中的一种或两种:第133位半胱氨酸被精氨酸取代和第187位酪氨酸被组氨酸取代。进一步优选，编码所述N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的核酸序列为SEQIDNO:56。优选，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶具有与SEQIDNO:29的氨基酸序列至少约30%相同，优选至少约50%相同，进一步优选至少约70%相同，进一步优选至少约80%相同，更进一步优选至少约90%相同，最优选至少约95%相同的氨基酸序列，其中所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶具有酶活性;进一步优选，所述的N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶具有SEQIDNO:29的氨基酸序列。进一步优选，重组核酸分子中编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。45.如权利要求43所述的微生物，其中，微生物包括至少一种对编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰;优选，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。46.如权利要求39所述的微生物，其中，提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自a微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性增加;和或b微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。47.如权利要求46所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的核酸序列含有至少一种增加D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性的遗传修饰。进一步优选，重组核酸分子中编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。48.如权利要求46所述的微生物，其中，微生物包括至少一种对编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。49.如权利要求39所述的微生物，其中，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自a微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性降低;和或b微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的表达减少；优选，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。进一步优选，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活;更优选，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰为编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。50.如权利要求39所述的微生物，其中，提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自a微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性增加;和或b微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。51.如权利要求50所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的核酸序列含有至少一种增加氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性的遗传修饰。进一步优选，重组核酸分子中编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。52.如权利要求50所述的微生物，其中，微生物包括至少一种对编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。53.如权利要求39所述的微生物，其中，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自a微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性降低;和或b微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的表达减少；优选，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。进一步优选，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活;更优选，降低微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰为编码微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。54.如权利要求39所述的微生物，其中，提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶作用的遗传修饰选自a微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的酶活性增加；和或b微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。55.如权利要求54所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的核酸序列含有至少一种增加UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的酶活性的遗传修饰。优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQIDNO:50的下述位置处的取代中的一种或多种:第34位半胱氨酸被丝氨酸取代、第145位组氨酸被天冬氨酸取代、第226位半胱氨酸被苯丙氨酸取代和245位缬氨酸被甘氨酸取代;更优选，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB的核酸序列为SEQIDN0：58〇优选，所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶具有与SEQIDNO:50的氨基酸序列至少约30%相同，优选至少约50%相同，进一步优选至少约70%相同，进一步优选至少约80%相同，更进一步优选至少约90%相同，最优选至少约95%相同的氨基酸序列，其中所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶WecB具有酶活性;进一步优选，所述的UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶具有SEQIDNO:50的氨基酸序列。进一步优选，重组核酸分子中编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。56.如权利要求54所述的微生物，其中，微生物包括至少一种对编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰;优选，编码UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。57.如权利要求37-56任一项所述的微生物，其中，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：1包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，PIiranManXYZ作用的遗传修饰；⑵包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰；3包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰；⑷包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE作用的遗传修饰；⑸包含至少一种能提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶SlmM作用的遗传修饰；⑹包含至少一种能提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GImU作用的遗传修饰。58.如权利要求57所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中甘露糖转运蛋白EnM，PIIImanManXYZ作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。优选，降低微生物中甘露糖转运蛋白ΕΠΜ，PIIImanManXYZ作用的遗传修饰选自编码微生物中甘露糖转运蛋白ΕΠΜ，PIIImanManXYZ的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，PIIImanManXYZ基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活;更优选，降低微生物中甘露糖转运蛋白EIIM，PIIImanManXYZ作用的遗传修饰为编码微生物中甘露糖转运蛋白ΕΠΜ，ΡΙΠΜηManXYZ的内源性基因完全缺失，即被删除。59.如权利要求57所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。优选，降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活;更优选，降低微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰神经氨酸裂解酶NanA的内源性基因完全缺失，即被删除。60.如权利要求57所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活;更优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶NagA的内源性基因完全缺失，即被删除。61.如权利要求57所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IIfegNagE作用的遗传修饰选自编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和或编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IfagNagE基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活;更优选，降低微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE作用的遗传修饰为编码微生物中N-乙酰-D-氨基葡萄糖特异酶IINagNagE的内源性基因完全缺失，即被删除。62.如权利要求57所述的微生物，其中，提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶GlmM作用的遗传修饰选自a微生物中磷酸葡糖胺变位酶GlmM的酶活性增加;和或b微生物中磷酸葡糖胺变位酶GlmM被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中磷酸葡糖胺变位酶GlmM作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。63.如权利要求62所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的核酸序列含有至少一种增加磷酸葡糖胺变位酶GlmM的酶活性的遗传修饰。进一步优选，重组核酸分子中编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。64.如权利要求62所述的微生物，其中，微生物包括至少一种对编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的基因的内源性天然启动子的遗传修饰;优选，编码磷酸葡糖胺变位酶GlmM的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。65.如权利要求57所述的微生物，其中，提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU作用的遗传修饰选自a微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的酶活性增加;和或b微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。66.如权利要求65所述的微生物，其中，微生物用至少一种包含编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的核酸序列的重组核酸分子转化。优选，编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的核酸序列含有至少一种增加双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的酶活性的遗传修饰。进一步优选，重组核酸分子中编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的基因拷贝数增加。进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。67.如权利要求65所述的微生物，其中，微生物包括至少一种对编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的基因的内源性天然启动子的遗传修饰;优选，编码双功能酶N-乙酰-D-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GlmU的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。68.如权利要求37-67中任一项所述的微生物，其中，重组核酸分子被装入质粒中或重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。69.如权利要求37-68中任一项所述的微生物，其中，所述重组核酸分子的表达是可诱导的;优选，所述重组核酸分子的表达可由乳糖诱导。70.如权利要求1-36中任一项所述的方法或者如权利要求37-69中任一项所述的微生物，其中，所述微生物微生物为细菌、酵母或真菌。优选，所述的微生物选自细菌或酵母。进一步优选，细菌选自埃希氏菌属Escherichia、芽孢杆菌属Bacillus、乳杆菌属Lactobacillus、假单胞菌属（Pseudomonas或链霉菌属（Streptomyces的属的细菌；进一步优选，细菌选自大肠杆菌Escherichiacoli、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、地衣芽抱杆菌Bacilluslicheniformis、短乳杆菌（Lactobacillusbrevis、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa或浅青紫链霉菌（StreptomycesIividans的种的细菌；更优选，细菌为大肠杆菌;更进一步优选，大肠杆菌选自K-12、B和W菌株;最优选大肠杆菌为K-12菌株。进一步优选，酵母选自糖酵母属（Saccharomyces、裂殖糖酵母属Schizosaccharomyces、念珠菌属（Candida、汉逊酵母属（Hansenula、毕赤酵母属Pichia、克鲁维酵母属Kluveromyces和红法夫属Phaffia的酵母;更优选，酵母包括但不限于选自酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe、白色念珠菌（Candidaalbicans、多形汉逊酵母Hansenulapolymorpha、巴氏毕赤酵母Pichiapastoris、加拿大毕赤酵母Pichiacanadensis、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxianus或红法夫酉孝母（Phaffiarohodozyma〇优选，所述的微生物为真菌；进一步优选，真菌选自曲霉属Aspergillus、犁头霉属Absidia、根霉属Rhizopus、金孢子菌属Chrysosporium、脉孢霉属Neurospora或木霉属Trichoderma的属的真菌;更优选，真菌选自黑曲霉Aspergillusniger、构巢曲霉Aspergillusnidulans、蓝色犁头霉Absidiacoerulea、米根霉（Rhizopusoryzae、劳肯诺温斯金孢子菌（Chrysosporiumlucknowense、粗糙脉孢霉（Neurosporacrassa、间型脉抱霉Neurosporaintermedia或里氏木霉（Trichodermareesei〇71.—种具有更高活性的透明颤菌血红蛋白（Vhb，所述蛋白具有SEQIDN0:65所示的氨基酸序列。72.—种编码如权利要求71所述透明颤菌血红蛋白（Vhb的核酸分子，所述核酸分子具有SEQIDNO:64所示的核酸序列。73.—种包含如权利要求72所述核酸分子的载体。74.—种包含如权利要求73所述载体的微生物。75.—种基因组中包含如权利要求72所述核酸分子的微生物。

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