申请/专利权人：吉林省农业科学院

申请日：2016-12-14

公开（公告）日：2020-06-30

公开（公告）号：CN106577517B

主分类号：C12Q1/6888(20180101)

分类号：C12Q1/6888(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.06.30#授权;2017.05.24#实质审查的生效;2017.04.26#公开

摘要：本发明涉及一种以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，属于肉牛生产技术领域。采用基于眼肌面积和基因标记检测的“肉质目标+眼肌面积+基因标记+公阉区分+预期出栏+持续育肥+分段调控”产肉力早期预测和肉质导向育肥技术体系。可根据客户要求，选择不同育肥模式，生产不同档次的牛肉产品（高档雪花肉、西餐红肉或大理石肉），按需生产，达到了育肥效率和效益最佳化，解决了盲目育肥和群体资源利用不充分的实践问题。实用性强。

主权项：1.一种以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）眼肌面积检测及分类，通过超声波技术对待测犊牛进行眼肌面积检测，计算眼肌面积数值，具体是：（1.1）对犊牛进行保定，以确保其自然站立；（1.2）测量时探头放上耦合剂，剪掉测量部位毛，探头直接放在体表；腰肌面积在横断面第十二、十三肋间测量，腰肌面积是一个圆周测量；在识别超声影像时首先确定皮肤界面、脂间结缔组织和背最长肌肌膜所产生的3~4条强回声影带，然后确定眼肌四周肌膜的强回声影像，以确定眼肌面积周界；观察并调节屏幕影像，调节灰度、对比度、增益度，使近场增大，远场减小，获得理想影像时即冻结影像，并加注说明资料影像打印或存贮处理；图像读取时先确定上下界即椭圆短轴，然后确定两端界点即为椭圆长轴；此时屏幕上显示的平方厘米值就是近似椭圆形的眼肌的面积；（1.3）眼肌面积的大小范围，分为“偏大、中等偏上、其它”3个档次，对群体待测数据进行测定，计算平均值P1，选出最大值Max，进而计算最大值与平均值的平均数P2；大于等于P2的个体，归类为“偏大”；大于等于P1，小于P2的个体归类为“中等偏上”；小于P1的个体归类为“其它”；步骤（2）待选基因的检测与分型，通过PCR-SSCP技术进行2组基因，CAPN1+CAST、GH+GHR的检测及分型，具体是：（2.1）引物设计：设计以下引物序列CAPN1基因Intron14上游引物序列：5’-GACAGGAATACAGTAGGGAC-3’CAPN1基因Intron14下游引物序列：5’-GAGAACAGCTACCCAGGGAC-3’CAST基因Intron3上游引物序列：5’-CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-3’CAST基因Intron3下游引物序列：5’-TACACCCTGCTTTGTCCTCCA-3’GH基因3‘UTR上游引物序列：5’-CACTCCCACTGTCCTTTCCTA-3’GH基因3‘UTR下游引物序列：5’-ACTTCCTCACATGTTGGAGGC-3’GHR基因Exon10上游引物序列：5’-TAACTTCATCGTGGACAA-3’GHR基因Exon10下游引物序列：5’-GGAGGTATAATCTGGGAC-3’（2.2）根据已设计的引物，按照以下PCR反应体系和条件进行扩增PCR反应体系：10×ExTaqBuffer2.5μl；dNTPMixture2.0μl；模板DNA1.0μl；上游引物F、下游引物R各1.0μl，浓度均为10pmolμl；浓度为5Uμl的ExTaq0.25μl，ddH2O17.25μl，总体积25.0μl；其中，10×ExTaqBuffer表示10倍ExTaq酶缓冲液；dNTPMixture表示dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，每种的浓度均为2.5mM，mM表示毫摩尔每升；ExTaq表示ExTaqDNA聚合酶；ddH2O表示双蒸水；反应条件：95℃预变性5min后进入如下循环：94℃变性30s，60－65℃退火30-45s，72℃延伸30-45min，30-35个循环，然后72℃延伸10min，4℃保存；（2.3）PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳：所有凝胶电泳均用浓度为1％琼脂糖EB凝胶，在1×TAE缓冲液下进行；10μlPCR扩增产物与16体积6×LoadingBuffer混匀，加样至点样孔中，以7～10Vcm的电压电泳，当溴酚蓝电泳至2~4cm，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪观察，照相，PCR产物条带清晰，大小符合预期设计结果，进行下一步分析；其中1×TAE缓冲液的配置：先配置50×TAE缓冲液:Tris242g，冰乙酸57.1m1，pH值为8.0、浓度为0.5M的EDTA100m1，加水至1000ml，然后稀释50倍以后即可得到1×TAE缓冲液；（2.4）扩增产物的PCR-SSCP分析：体积为40ml的非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳根据不同的扩增片段，采用浓度为30%的丙烯酰胺配成浓度为8%～12%的聚丙烯酰胺凝胶；清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用大号铁夹固定，并用0.8%琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙；在100ml烧杯内加入浓度为30%丙烯酰胺12.0ml，5.0ml的浓度为50%甘油，5×TBE缓冲液10.0ml，浓度为10%过硫酸铵350μl，TEMED8μl，加入双蒸水13.0ml，混合后迅速灌胶；当胶灌至离玻璃板上沿1.0cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚合30min，多余的丙烯酰胺4℃保存；随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺；凝胶聚合好后，拔掉梳子，向电泳槽加入1×TBE，用注射器冲洗加样孔；预电泳10min，同时准备点样；取1μlPCR产物置于PCR管中，加5μl变性Buffer，离心混匀，98℃变性10min；迅速冰浴10min，用微量注射器点样；4℃，140～180V，电泳14～16h；电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于400~600ml浓度为70%的乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定10~15min；去离子水洗胶2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液染色30min；去离子水洗胶3遍，每次2min，洗去多余的染色液；用200ml显色液显色，10～30min，当DNA条带清晰时，倒掉显色液；去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存，然后进行基因分型；其中，浓度为30%的丙烯酰胺的配置是29克丙烯酰胺和1克双丙烯酰胺，用蒸馏水定容100ml，过滤后使用；5×TBE缓冲液：Tris碱54g，硼酸27.5g，pH值为8.0、浓度为0.5M的EDTA20ml，加水至1000ml所得；0.5MEDTA配置方法为：EDTA186.1g溶于800m1双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌后使用；1×TBE即5×TBE缓冲液稀释5倍后所得溶液；步骤（3）根据眼肌面积与基因分型结果，确定育肥模式，具体是：（3.1）眼肌面积中等偏上，或检测到CAPN1_BB基因型+CAST_AA基因型的个体，用于生产高档雪花肉，育肥阉牛至26-30月龄，采取“生长发育期+营养平衡期+肉质改良期”三段式育肥模式；（3.2）眼肌面积偏大，或检测到GH_BB基因型+GHR_AA基因型的个体，生产西餐红肉，育肥公牛至16-20月龄，采取“生长发育期+肉质改良期”两段式育肥模式；（3.3）其它牛生产大理石肉；步骤（4）公、阉牛区分：选择对象为公牛，正常育肥；选择对象为阉牛，阉割后育肥；步骤（5）出栏时间：分为26-30月龄、16-20月龄、20-22月龄、22-24月龄4种；步骤（6）分段式营养调控：三段式育肥或两段式育肥；三段式育肥中生长发育期日粮精粗比为40:60；日粮干物质含量为63.1％，采食量为15.2kgd·头，干物质采食量为9.6kgd·头。

全文数据：以肉质为目标导向的肉牛育肥方法技术领域[0001]本发明涉及肉牛生产技术领域，特别涉及一种以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，是一种适合于指导肉牛生产的育肥新方法，具体涉及眼肌面积超声波检测、基因标记检测、分段营养调控等技术手。背景技术[0002]育肥牛是肉类市场中牛肉的主要供应来源。牛犊断奶后就算在肥育牛之列，我国肉用牛的肥育多为成年牛的肥育，不少地方多为老龄牛的肥育。幼年牛一面生长，一面囤肥。即在长骨架肌肉的同时也积累一定的脂肪;而成年牛肥育，主要长体宽，向宽深发展。囤积脂肪的能力很强。这是幼年、成年牛肥育的不同特点，因此不同的牛有不同的肥育技术。传统的育肥牛选择一般为体重在250kg以上、年龄在1~2周龄的未去势杂种公牛。育肥方法主要有持续育肥法与架子牛育肥法。（1持续育肥法，在第1年即性成熟前生长最快，以后生长速度随年龄的增加而减慢，第2年增重仅为第1年增重的70%左右，第3年增重为第2年的50%左右。（2后期集中育肥法架子牛育肥法），前期青贮饲料为主进行"吊架子"，故增重速度较慢，进入育肥阶段，在营养水平的影响下，生长速度较快。因此，年龄较大的牛增重快于青年牛。青年牛增重主要是增长肌肉、器官和骨骼，而老年牛的增重主要是脂肪。[0003]在国外一般肉牛多在1.5岁体重达500kg以上屠宰为宜，但不超过2岁。我国地方品种牛成熟较晚，1.5~2岁之间增重较快，故一般在2岁左右屠宰为宜，过大造成肉的品质下降，饲料转化率低，成本提高。如果有条件，可在周岁时体重350kg左右出栏屠宰。我国肉牛业起步较晚，且无专用肉牛品种，使用肉用品种牛杂交改良地方优良品种，不但可以生产高档牛肉，而且可获得很好的经济效益。[0004]随着不同层次的消费需求，对育肥牛的生产带来了一些问题。目前牛肉供应主要趋向于三种层次：（1高档雪花肉。所谓"雪花"，是脂肪沉积到肌肉纤维之间，形成明显的红、白相间，状似大理石花纹的牛肉。雪花牛肉源于日本和牛，我国已涌现出一批"雪花牛肉"自主品牌，如大连的雪龙黑牛、陕西的秦宝、延边的犇福、北京的御香苑等品牌，为高档消费品。（2西餐红肉。西餐红肉的特点是肌肉纤维粗硬、脂肪含量较高，主要供应于西餐消费者。（3大理石肉。主要是含有大量肌间脂肪的肉类，纹理很像大理石，故得名。大理石肉肉质细嫩，含有大量人体所需的脂肪酸，肉价格适中，适合大众消费。[0005]根据不同消费需要选择性生产，可产生雪花牛肉、西餐红肉、大理石肉；但是不是所有的牛都适合生产各种档次的牛肉。如果盲目的生产，不仅不能满足各目标需求，而且会增加饲养成本，进而造成生产中的浪费;而且，传统的肉牛育肥方法不能形成一种针对性的生产模式，很难满足现有需求，因此，迫切需要结合生产需求与生产实际，来制定一种具有目标导向的育肥技术体系，节约饲养成本，根据肉牛的实际特点进行导向生产，达到肉牛生产的效益最大化。发明内容[0006]本发明的目的在于提供一种以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，解决了现有技术存在的盲目育肥和群体资源利用不充分等问题。本发明是一种实用性较高的肉质导向育肥技术体系，根据客户要求，选择育肥模式，达到育肥效率和效益最佳化。基于肉牛延黄牛、草原红牛）的眼肌面积遗传力分别为0.63和0.65;6月龄眼肌面积与不同月龄的体重、眼肌面积和净肉量均呈较强的遗传相关0.657-0.715，进而证明了眼肌面积可以作为肉用性状早期选择的典型指标。同时根据实验发现，CAPN1+CAST复合基因型AAAA、H-FABP的基因型（BB对肌内脂肪沉积具有正效应;含GH+GHR的复合基因型BBAA的个体生长发育较快。因此，本发明以眼肌面积与基因标记效应为主选性状，综合考虑公阉区分、预期出栏、持续育肥、分段调控等因素，创立了基于眼肌面积和基因标记检测的"肉质目标+眼肌面积+基因标记+公阉区分+预期出栏+持续育肥+分段调控"产肉力早期预测和肉质导向育肥技术体系。根据客户要求，选择育肥模式，达到育肥效率和效益最佳化，解决了盲目育肥和群体资源利用不充分的实践问题。[0007]本发明的上述目的通过以下技术方案实现：[0008]以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，包括如下步骤：[0009]1眼肌面积检测及分类；[0010]2待选基因的检测与分型；[0011]3根据眼肌面积与基因分型结果，确定育肥模式；[0012]⑷公、阉牛区分:选择对象为公牛，正常育肥;选择对象为阉牛，阉割后育肥；[0013]5出栏时间：出栏时间分为:26-30月龄、16-20月龄、20-22月龄、22-24月龄4种；[0014]⑶分段式营养调控:三段式育肥或两段式育肥。[0015]步骤（1所述的眼肌面积检测及分类，通过超声波技术对待测犊牛进行眼肌面积检测，计算眼肌面积数值，具体是：[0016]1.1对犊牛进行保定，以确保其自然站立；[0017]1.2测量时探头放上耦合剂，剪掉测量部位毛，探头直接放在体表;腰肌面积在横断面第十二、十三肋间测量，腰肌面积是一个圆周测量;在识别超声影像时首先确定皮肤界面、脂间结缔组织和背最长肌肌膜所产生的3~4条强回声影带，然后确定眼肌四周肌膜的强回声影像，以确定眼肌面积周界;观察并调节屏幕影像，调节灰度、对比度、增益度，使近场增大，远场减小，获得理想影像时即冻结影像，并加注说明资料影像打印或存贮处理；图像读取时先确定上下界即椭圆短轴，然后确定两端界点即为椭圆长轴;此时屏幕上显示的平方厘米值就是近似椭圆形的眼肌的面积；[0018]1.3眼肌面积的大小范围，分为"偏大、中等偏上、其它"3个档次，对群体待测数据进行测定，计算平均值P1，选出最大值Max，进而计算最大值与平均值的平均数P2;大于等于P2的个体，归类为"偏大"；大于等于P1，小于P2的个体归类为"中等偏上"；小于P1的个体归类为"其它"。[0019]步骤2所述的待选基因的检测与分型，通过PCR-SSCP技术进行3组基因，CAPN1+CAST、H-FABP、GH+GHR的检测及分型，具体是：[0020]2.1引物设计:设计以下引物序列[0021]CAPN1基因Intronl4上游引物序列[0022]CAPN1基因Intronl4下游引物序列[0023]CAST基因Intron3上游引物序列[0024]CAST基因Intron3下游引物序列[0025]H-FABP基因5'UTR上游引物序列[0026]H-FABP基因5'UTR下游引物序列[0027]GH基因3'UTR上游引物序列：5'-[0028]GH基因3'UTR下游引物序列：5'[0029]GHR基因ExonlO上游引物序列：5'[0030]GHR基因ExonlO下游引物序列：5'[0031]2.2根据已设计的引物，按照以下PCR反应体系和条件进行扩增[0032]PCR反应体系：10XExTaqBuffer2·5μ1，1ΝΤΡMixture各2.5111]\12.^1，模板DNA1.0yl,F10pmolyl1.0yl,R10pmolylΙ.ΟμΙ,ΕχTaq5Uyl0.25μ1,ddH2017.25μ1，总体积25.0μ1;其中，lOXExTaqBuffer表示10倍ExTaq酶缓冲液；dNTPMixture各2.5mM表示dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，每种的浓度均为2.5mM，mM表示毫摩尔每升;F、R分别代表上下游的PCR引物;ExTaq表示ExTaqDNA聚合酶;ddH20表示双蒸水；[0033]反应条件：95°C预变性5min后进入如下循环:94°C变性30s，60-65°C退火30-45s，72°C延伸30-45min，30-35个循环，然后72°C延伸10min，4°C保存；[0034]2.3PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳:所有凝胶电泳均用浓度为1%琼脂糖EB凝胶，在1XTAEBuffer下进行；10μ1PCR扩增产物与16体积6XLoadingBuffer混勾，加样至点样孔中，以7~lOVcm的电压电泳，当溴酚蓝电泳至2~4cm，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪观察，照相;PCR产物条带清晰，大小符合预期设计结果，进行下一步分析;其中1XTAE缓冲液的配置：先配置50XTAE缓冲液：Tris242g，冰乙酸57.lml，0.5MEDTApH8.0100ml，加水至1000ml，然后稀释50倍以后即可得到1XTAE缓冲液；[0035]2.4扩增产物的PCR-SSCP分析:体积为40ml的非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳根据不同的扩增片段，采用浓度为30%的丙烯酰胺配成浓度为8%~12%的聚丙烯酰胺凝胶;清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用大号铁夹固定，并用0.8%琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙；在l〇〇ml烧杯内加入浓度为30%丙烯酰胺12.0ml，5.0ml的浓度为50%甘油，5XTBE缓冲液10.0ml，浓度为10%过硫酸铵350μ1，TEMED8μ1，加入双蒸水13.0ml，混合后迅速灌胶；当胶灌至离玻璃板上沿1.0cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚合30min，多余的丙烯酰胺4°C保存;随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺;凝胶聚合好后，拔掉梳子，向电泳槽加入1XTBE，用注射器冲洗加样孔;预电泳10min，同时准备点样;取ΐμLPCR产物置于PCR管中，加5μ1变性Buffer，离心混匀，98°C变性10min;迅速冰浴10min，用微量注射器点样;4°C，140~180V，电泳14~16h;电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于400~600ml浓度为70%的乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定10~15min;去离子水洗胶2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液染色30min;去离子水洗胶3遍，每次2min，洗去多余的染色液；用200ml显色液显色，10~30min，当DNA条带清晰时，倒掉显色液；去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存，然后进行基因分型如图2-6所示，根据电泳速度来进行分型，条带在下面的为BB型，上面的为AA型，上下均有的为AB型）；其中，浓度为30%的丙烯酰胺的配置是29克丙烯酰胺和1克双丙烯酰胺，用蒸馏水定容100ml，过滤后使用；5XTBE缓冲液:Tris碱54g，硼酸27·5g，0·5MEDTApH8·020ml，加水至1000ml所得;0.5MEDTA配置方法为:EDTA186.1g溶于800ml双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌后可使用；1XTBE即5XTBE缓冲液稀释5倍后所得溶液。[0036]步骤⑶所述的根据眼肌面积与基因分型结果，确定育肥模式，具体是：[0037]3.1眼肌面积中等偏上，或检测到CAPN1+CASTBBAA基因型）或H-FABPBB基因型）目标基因型的个体，用于生产高档雪花肉，育肥阉牛至26-30月龄，采取"生长发育期+营养平衡期+肉质改良期"三段式模式；[0038]3.2眼肌面积偏大，或检测到GH+GHRBBAA基因型）目标基因型的个体，生产西餐红肉，育肥公牛至16-20月龄，采取"生长发育期+肉质改良期"两段式模式；[0039]3.3其它牛生产大理石肉。[0040]本发明的有益效果在于:与现有的传统技术相比，本发明以肉质为目标导向，发明采用一种基于眼肌面积和基因标记检测的"肉质目标+眼肌面积+基因标记+公阉区分+预期出栏+持续育肥+分段调控"产肉力早期预测和肉质导向育肥技术体系。可根据客户要求，选择不同育肥模式，生产不同档次的牛肉产品（高档雪花肉、西餐红肉或大理石肉），按需生产，达到了育肥效率和效益最佳化，解决了盲目育肥和群体资源利用不充分的实践问题。实用性强。附图说明[0041]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。[0042]图1为本发明的眼肌面积检测示意图；[0043]图2为本发明的CAPN1基因检测分型结果BB型为目标基因型）；[0044]图3为本发明的CAST基因检测分型结果AA型为目标基因型）；[0045]图4为本发明的H-FABP基因检测分型结果BB型为目标基因型）；[0046]图5为本发明的GH基因检测分型结果BB型为目标基因型）；[0047]图6为本发明的GHR基因检测分型结果AA型为目标基因型）。具体实施方式[0048]下面结合附图进一步说明本发明的详细内容及其具体实施方式。[0049]参见图1至图6所示，本发明的以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，包括如下步骤：[0050]1眼肌面积检测及分类，通过超声波技术对待测犊牛进行眼肌面积检测，计算眼肌面积数值，具体是：[0051]1.1对犊牛进行保定，以确保其自然站立;在将动物移至保定架或保定栏的过程中，要尽量减少产生应激反应。[0052]1.2测量时探头放上耦合剂，剪掉测量部位毛，探头直接放在体表;腰肌面积在横断面第十二、十三肋间测量，腰肌面积是一个圆周测量;在识别超声影像时首先确定皮肤界面、脂间结缔组织和背最长肌肌膜所产生的3~4条强回声影带，然后确定眼肌四周肌膜的强回声影像，以确定眼肌面积周界；观察并调节屏幕影像，适当调节灰度、对比度、增益度，尽量使近场增大，远场减小，获得理想影像时即冻结影像，并加注说明资料影像打印或存贮处理；图像读取时先确定上下界即椭圆短轴，然后确定两端界点即为椭圆长轴;此时屏幕上显示的平方厘米值就是近似椭圆形的眼肌的面积;如图1所示。[0053]1.3眼肌面积的大小范围，分为"偏大、中等偏上、其它"3个档次，对群体待测数据进行测定，计算平均值P1，选出最大值Max，进而计算最大值与平均值的平均数P2;大于等于P2的个体，归类为"偏大"；大于等于P1，小于P2的个体归类为"中等偏上"；小于P1的个体归类为"其它"。[0054]2待选基因的检测与分型，通过PCR-SSCP技术进行3组基因，CAPN1+CAST、H-FABP、GH+GHR的检测及分型，具体是：[0055]2.1引物设计:设计以下引物序列[0056]CAPN1基因Intronl4上游引物序歹L[0057]CAPN1基因Intronl4下游引物序歹L[0058]CAST基因Intron3上游引物序列：C[0059]CAST基因Intron3下游引物序列：Ί[0060]H-FABP基因5'UTR上游引物序列：£[0061]H-FABP基因5'UTR下游引物序列：£[0062]GH基因3'UTR上游引物序列：5'-C[0063]GH基因3'UTR下游引物序列：5'-AC[0064]GHR基因ExonlO上游引物序列：5'-[0065]GHR基因ExonlO下游引物序列：5'-[0066]2.2根据已设计的引物，按照以下PCR反应体系和条件进行扩增[0067]PCR反应体系：10XExTaqBuffer2·5μ1，1ΝΤΡMixture各2.5111]\12.^1，模板DNA1.0yl,F10pmolyl1.0yl,R10pmolylΙ.ΟμΙ,ΕχTaq5Uyl0.25μ1,ddH2017.25μ1，总体积25.0μ1;其中，lOXExTaqBuffer表示10倍ExTaq酶缓冲液；dNTPMixture各2.5mM表示dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，每种的浓度均为2.5mM，mM表示毫摩尔每升;F、R分别代表上下游的PCR引物;ExTaq表示ExTaqDNA聚合酶;ddH20表示双蒸水；[0068]反应条件：95°C预变性5min后进入如下循环:94°C变性308,60-65°：退火30-458，72°C延伸30-45min，30-35个循环，然后72°C延伸10min，4°C保存；[0069]2.3PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳:所有凝胶电泳均用浓度为1%琼脂糖EB凝胶，在1XTAEBuffer下进行；10μ1PCR扩增产物与16体积6XLoadingBuffer混勾，加样至点样孔中，以7~lOVcm的电压电泳，当溴酚蓝电泳至2~4cm，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪观察，照相，PCR产物条带清晰，大小符合预期设计结果，进行下一步分析;其中1XTAE缓冲液的配置：先配置50XTAE缓冲液：Tris242g，冰乙酸57.lml，0.5MEDTApH8.0100ml，加水至1000ml，然后稀释50倍以后即可得到1XTAE缓冲液；[0070]2.4扩增产物的PCR-SSCP分析:体积为40ml的非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳根据不同的扩增片段，采用浓度为30%的丙烯酰胺配成浓度为8%~12%的聚丙烯酰胺凝胶;清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用大号铁夹固定，并用0.8%琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙；在l〇〇ml烧杯内加入浓度为30%丙烯酰胺12.0ml，5.0ml的浓度为50%甘油，5XTBE缓冲液10.0ml，浓度为10%过硫酸铵350μ1，TEMED8μ1，加入双蒸水13.0ml，混合后迅速灌胶；当胶灌至离玻璃板上沿1.0cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚合30min，多余的丙烯酰胺4°C保存;随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺;凝胶聚合好后，拔掉梳子，向电泳槽加入1XTBE，用注射器冲洗加样孔;预电泳lOmin，同时准备点样;取ΐμLPCR产物置于PCR管中，加5μ1变性Buffer，离心混匀，98°C变性lOmin;迅速冰浴lOmin，用微量注射器点样;4°C，140~180V，电泳14~16h;电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于400~600ml浓度为70%的乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定10~15min;去离子水洗胶2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液染色30min;去离子水洗胶3遍，每次2min，洗去多余的染色液；用200ml显色液显色，10~30min，当DNA条带清晰时，倒掉显色液；去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存，然后进行基因分型如图2-6所示，根据电泳速度来进行分型，条带在下面的为BB型，上面的为AA型，上下均有的为AB型）；其中，浓度为30%的丙烯酰胺的配置是29克丙烯酰胺和1克双丙烯酰胺，用蒸馏水定容100ml，过滤后使用；5XTBE缓冲液:Tris碱54g，硼酸27·5g，0·5MEDTApH8·020ml，加水至1000ml所得;0.5MEDTA配置方法为:EDTA186.1g溶于800ml双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌后可使用；1XTBE即5XTBE缓冲液稀释5倍后所得溶液。[0071]3根据眼肌面积与基因分型结果，可安排不同的育肥模式表1:[0072]3.1眼肌面积中等偏上，或检测到CAPN1+CASTBBAA基因型）或H-FABPBB基因型）目标基因型的个体，用于生产高档雪花肉，育肥阉牛至26-30月龄，采取"生长发育期+营养平衡期+肉质改良期"三段式模式；[0073]3.2眼肌面积偏大，或检测到GH+GHRBBAA基因型）目标基因型的个体，生产西餐红肉，育肥公牛至16-20月龄，采取"生长发育期+肉质改良期"两段式模式；[0074]3.3其它牛生产大理石肉。[0075]表1以肉质为目标导向的育肥模式[0077]⑷公、阉牛区分:选择对象为公牛，正常育肥;选择对象为阉牛，阉割后育肥。[0078]5出栏时间：出栏时间分为:26-30月龄、16-20月龄、20-22月龄、22-24月龄4种。[0079]⑶分段式营养调控:三段式育肥或两段式育肥。[0080]三段式育肥:营养方案见表2。[0081]表2三段式调控生产日粮结构与营养水平[0082][0083]注：①生长发育期日粮精粗比为40:60;日粮干物质含量为63.1%，采食量为15.2kgd·头，干物质采食量为9.6kgd·头。[0084]②营养平衡期日粮精粗比为30:70;日粮干物质含量为72.6%，采食量为11.4kgd·头，干物质采食量为8.3kgd·头。[0085]③肉质改良期日粮精粗比为50:50;日粮干物质含量为55.2%，采食量为18.0kgd·头，干物质采食量为9.9kgd·头。[0086]两段式育肥:营养方案见表3。[0087]表3两段式调控生产日粮结构与营养水平[0089][0090]注：①生长发育期日粮精粗比为30:70;日粮干物质含量为69.1%，采食量为12.4kgd·头，干物质采食量为8.6kgd·头。[0091]②营养平衡期日粮精粗比为40:60;日粮干物质含量为61.8%，采食量为16.0kgd·头，干物质采食量为9.9kgd·头。[0092]实施例：[0093]拟对一群小公牛体进行育肥生产，来满足市场对牛肉的不同需求，策略如下：[0094]检测阶段：[0095]1按上述方法测定不同小牛的眼肌面积，按前述方法进行归类；[0096]2按上述方法检测CAPN1+CAST、GH+GHR、H-FABP基因的基因型，符合要求的画"，。[0097]检测结果如下：[0098]表2待育肥群体眼肌面积及基因型检测结果[0100][0101]3根据可生产的目标，设计育肥策略，按需求进行生产分配;育肥策略延续前检测结果表2见表3,具体方法参见前述实施方案。[0102]表3待育肥群体的育肥策略[0104][0105]说明：[0106]1CAPN1+CASTBBAA检测时，CAPN1的BB基因型与CAST的AA基因型同时被检出，标记"V"；GH+GHRBBAA、H-FABPBB检测规则一致。[0107]2上述需求可以根据用户需求进行调整，但需遵循以下规则：[0108]生产雪花肉个体，也可以生产西餐红肉或大理石肉，按生产目标进行公阉牛区分、预期出栏、分段调控即可;生产西餐红肉个体，也可以用来生产大理石肉，按生产目标进行公阉牛区分、预期出栏、分段调控即可;反之不可。[0109]以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，其特征在于:包括如下步骤：1眼肌面积检测及分类；2待选基因的检测与分型；3根据眼肌面积与基因分型结果，确定育肥模式；4公、阉牛区分:选择对象为公牛，正常育肥;选择对象为阉牛，阉割后育肥；5出栏时间：分为26-30月龄、16-20月龄、20-22月龄、22-24月龄4种；6分段式营养调控:三段式育肥或两段式育肥。2.根据权利要求1所述的以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，其特征在于：步骤（1所述的眼肌面积检测及分类，通过超声波技术对待测犊牛进行眼肌面积检测，计算眼肌面积数值，具体是：1.1对犊牛进行保定，以确保其自然站立；1.2测量时探头放上耦合剂，剪掉测量部位毛，探头直接放在体表;腰肌面积在横断面第十二、十三肋间测量，腰肌面积是一个圆周测量;在识别超声影像时首先确定皮肤界面、脂间结缔组织和背最长肌肌膜所产生的3~4条强回声影带，然后确定眼肌四周肌膜的强回声影像，以确定眼肌面积周界;观察并调节屏幕影像，调节灰度、对比度、增益度，使近场增大，远场减小，获得理想影像时即冻结影像，并加注说明资料影像打印或存贮处理；图像读取时先确定上下界即椭圆短轴，然后确定两端界点即为椭圆长轴;此时屏幕上显示的平方厘米值就是近似椭圆形的眼肌的面积；1.3眼肌面积的大小范围，分为"偏大、中等偏上、其它"3个档次，对群体待测数据进行测定，计算平均值P1，选出最大值Max，进而计算最大值与平均值的平均数P2;大于等于P2的个体，归类为"偏大"；大于等于P1，小于P2的个体归类为"中等偏上"；小于P1的个体归类为"其它"。3.根据权利要求1所述的以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，其特征在于：步骤2所述的待选基因的检测与分型，通过PCR-SSCP技术进行3组基因，CAPN1+CAST、H-FABP、GH+GHR的检测及分型，具体是：2.1引物设计:设计以下引物序列CAPN1基因Intronl4上游引物序列：GACAGGAATACAGTAGGGACCAPN1基因Intron14下游引物序列:GAGAACAGCTACCCAGGGACCAST基因Intron3上游引物序列：CGTAGTGATGCTTTCTAAGGCCAST基因Intron3下游引物序列：TACACCCTGCTTTGTCCTCCAH-FABP基因5'UTR上游引物序列：5'-TCTGCGTCTTTCCCAACCTA-3'H-FABP基因5'UTR下游引物序列：5'-GGCTCCCCAACCTGAC-3'GH基因3'UTR上游引物序列：5'-CACTCCCACTGTCCTTTCCTA-3'GH基因3'UTR下游引物序列：5'-ACTTCCTCACATGTTGGAGGC-3'GHR基因ExonlO上游引物序列：5'-TAACTTCATCGTGGACAA-3'GHR基因ExonlO下游引物序列：5'-GGAGGTATAATCTGGGAC3-3'2.2根据已设计的引物，按照以下PCR反应体系和条件进行扩增PCR反应体系：10XExTaqBuffer2·5μ1，1ΝΤΡMixture各2.5111]\〇2.^1，模板DNA1.0yl，FlOpmolμΙ1.0yl，RlOpmolμΙ1·0μ1，ΕχTaq5UAU0·25μ1，ΜΗ2〇17·25μ1，总体积25·0μ1;其中，lOXExTaqBuffer表示10倍ExTaq酶缓冲液；dNTPMixture各2.5mM表示dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液，每种的浓度均为2.5mM，mM表示毫摩尔每升;F、R分别代表上下游的PCR引物;ExTaq表示ExTaqDNA聚合酶;ddH20表示双蒸水；反应条件：95°C预变性5min后进入如下循环：94°C变性30s，60-65°C退火30-45s，72°C延伸30-45min，30-35个循环，然后72°C延伸10min，4°C保存；2.3PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳:所有凝胶电泳均用浓度为1%琼脂糖EB凝胶，在IXTAE缓冲液下进行；lOylPCR扩增产物与16体积6XLoadingBuffer混匀，加样至点样孔中，以7~lOVcm的电压电泳，当溴酚蓝电泳至2~4cm，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪观察，照相，PCR产物条带清晰，大小符合预期设计结果，进行下一步分析;其中1XTAE缓冲液的配置:先配置50XTAE缓冲液:Tris242g，冰乙酸57.1ml，0.5MEDTApH8.0100ml，加水至1000ml，然后稀释50倍以后即可得到IXTAE缓冲液；2.4扩增产物的PCR-SSCP分析:体积为40ml的非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳根据不同的扩增片段，采用浓度为30%的丙烯酰胺配成浓度为8%~12%的聚丙烯酰胺凝胶；清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用大号铁夹固定，并用0.8%琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙；在100ml烧杯内加入浓度为30%丙烯酰胺12.0ml，5.0ml的浓度为50%甘油，5XTBE缓冲液10.0ml，浓度为10%过硫酸铵350yl，TEMED8μL，加入双蒸水13.0ml，混合后迅速灌胶；当胶灌至离玻璃板上沿1.0cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚合30min，多余的丙烯酰胺4°C保存;随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺;凝胶聚合好后，拔掉梳子，向电泳槽加入1XTBE，用注射器冲洗加样孔;预电泳10min，同时准备点样;取1μLPCR产物置于PCR管中，加5μL变性Buffer，离心混匀，98°C变性10min;迅速冰浴10min，用微量注射器点样;4°C，140~180V，电泳14~16h;电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于400~600ml浓度为70%的乙醇中，水浴震荡器缓慢摇勾固定10~15min;去离子水洗胶2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液染色30min;去离子水洗胶3遍，每次2min，洗去多余的染色液;用200ml显色液显色，10~30min，当DNA条带清晰时，倒掉显色液;去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存，然后进行基因分型;其中，浓度为30%的丙烯酰胺的配置是29克丙烯酰胺和1克双丙烯酰胺，用蒸馏水定容l〇〇ml，过滤后使用；5XTBE缓冲液:Tris碱54g，硼酸27.5g，0.5MEDTApH8.020ml，加水至1000ml所得；0.5MEDTA配置方法为:EDTA186.1g溶于800ml双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌后可使用；1XTBE即5XTBE缓冲液稀释5倍后所得溶液。4.根据权利要求1所述的以肉质为目标导向的肉牛育肥方法，其特征在于：步骤3所述的根据眼肌面积与基因分型结果，确定育肥模式，具体是：3.1眼肌面积中等偏上，或检测到CAPN1+CASTBBAA基因型）或H-FABPBB基因型）目标基因型的个体，用于生产高档雪花肉，育肥阉牛至26-30月龄，采取"生长发育期+营养平衡期+肉质改良期"三段式模式；3.2眼肌面积偏大，或检测到GH+GHRBBAA基因型）目标基因型的个体，生产西餐红肉，育肥公牛至16-20月龄，采取"生长发育期+肉质改良期"两段式模式；3.3其它牛生产大理石肉。

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