申请/专利权人：深圳大学

申请日：2018-07-10

公开（公告）日：2020-06-30

公开（公告）号：CN108866077B

主分类号：C12N15/29(20060101)

分类号：C12N15/29(20060101);C12N1/21(20060101);C12N15/70(20060101);C07K14/415(20060101);A01H5/00(20180101);A01H6/00(20180101);C12R1/19(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.06.30#授权;2019.02.12#实质审查的生效;2018.11.23#公开

摘要：本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种大豆蛋白的应用。所述大豆蛋白作为渗透调节物质用于提高生物体的耐盐性；其中，所述大豆蛋白的编码序列如SEQIDNO:1所示。本发明提供的大豆蛋白可作为渗透调节物质用于提高植物或大肠杆菌等生物体的耐盐性，该大豆蛋白及其基因在生物体特别是植物的抗逆领域具有很好的应用前景。

主权项：1.一种大豆蛋白的应用，其特征在于，所述大豆蛋白作为渗透调节物质用于提高大肠杆菌的耐盐性；其中，所述大豆蛋白的编码序列如SEQIDNO:1所示。

全文数据：大豆蛋白的应用技术领域[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种大豆蛋白的应用。背景技术[0002]盐碱、干旱等非生物胁迫是限制植物生长发育的主要环境因子。这些环境因子导致植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚至引起不可逆伤害，导致整个植株死亡。因此，如何提高植物的抗逆功能，一直是人们研宄的课题。[0003]渗透调节物质可使生物体提高细胞吸水或保水能力，从而适应水分胁迫环境。可溶性蛋白质作为渗透调节物质的使用非常有限，因此，现有技术还有待于改进和发展。发明内容[0004]本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种大豆蛋白的应用，旨在解决现有渗透调节物质的可溶性蛋白的种类有限的技术问题。[0005]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：[0006]本发明提供一种大豆蛋白的应用，所述大豆蛋白作为渗透调节物质用于提高生物体的耐盐性;其中，所述大豆蛋白的编码序列如SEQIDNO:1所示。[0007]本发明提供的大豆蛋白（基因编码为Glymal5gl2170.1，编码序列如SEQIDN0:1所示），通过实验验证，可增强大肠杆菌等的耐盐性，因此，其可作为渗透调节物质用于提高植物或大肠杆菌等生物体的耐盐性，该大豆蛋白及其基因在生物体特别是植物的抗逆领域具有很好的应用前景。附图说明[0008]图1为本发明实施例1中利用PCR扩增大豆基因片段的电泳结果图（M为DLlOOOOMarker〇[0009]图2为本发明实施例1中利用菌落PCR验证重组菌的电泳结果图（M为DLlOOOOMarker〇[0010]图3为本发明实施例5中大豆蛋白Glymal5gm70.1的诱导表达的电泳结果图。[0011]图4为本发明实施例7中空载体转化菌在不同浓度的高盐LB固体培养基和正常固体培养基的生长结果图。[0012]图5本发明实施例7中重组质粒转化菌在不同浓度的高盐LB固体培养基和正常固体培养基的生长结果图。[0013]图6本发明实施例7中空载体转化菌和重组质粒转化菌的存活率柱形图。具体实施方式[0014]为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体买施例仪仪用以鮮释本发明，并不用于限定本发明。[0015]本发明实施例提供了一种大豆蛋白的应用，所述大豆蛋白作为渗透调节物质用于提高生物体的耐盐性;其中，所述大豆蛋白的编码序列如犯〇IDN0:1所示。t〇〇16]本发明实施例提供的大豆蛋白（基因编码为Glymal5gl2170.1，编码序列如SEQIDNO:1所示），通过实验验证，可增强大肠杆菌等的耐盐性，因此，其可作为渗透调节物质用于提高植物或大肠杆菌等生物体的耐盐性，该大豆蛋白及其基因在生物体优选为植物和或大肠杆菌的抗逆领域具有很好的应用前景。_[0017]所述大豆蛋白Glymal5gl2170.1的编码序列SEQIDN0:1如下所示：[0018]ATGGCCAGCGTTGAGGTTGCACAGCAAACACCAACAACAGTTCCAGAAAATGAAACAACCGAGGTAAGCAAGACCCAGGAAACAACCCCAGTCACTGAGGCTCCTGCAACAGAACAACCAGCAGCTGAGGTTCCTGCAACAGAACAACCAGCCGCTGAGGCTCCTGCCCCAGAATCAACCACCGAAGCACCAAAGGAAGAAACCACCGAGGCACCAACAGAAACAGTAGAAAAAACAACTACAGAAGTAGCCCCAGAGGAGCCTAAAGAAGTTCCAGTTGAGACCGAGGAGGTGGTGGCAAAGGAGACAGAGGAAGAGAAGCCAGCAGAAGAGAAATCAGAGGAGAAAACTGAAGAAGTGAAAGAAGAAGCAGAGGAGCCTAAAGAAACTACTGAAACAGAATCAGCAGCAGCAGCACCACCAGCAACCACAGAGGAAGAGAACAAACCAGCTGAGTCAGTTGAAACCCCAGTAGAGGTTCCTGTTGAGAAGACTGAAGCTTAGo[0019]进一步地，所述大豆蛋白的制备方法包括如下步骤：[0020]S01:扩增所述大豆蛋白的编码序列；[0021]S02:构建包含所述编码序列的重组质粒；[0022]S03:将所述重组质粒转化至感受态细胞，进行诱导表达；[0023]S04:将所述诱导表达后的菌液进行蛋白分离纯化，得到所述大豆蛋白。[0024]进一步地，在上述步骤S01中，扩增所述大豆蛋白的编码序列的引物对如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示：[0025]SEQIDN0:2:5’-CGCCCATATGGCCAGCGTTGAGGTTGCNde1-3’，[0026]SEQIDN0:3:5’-ACCGCTCGAGCTAAGCTTCAGTCTTCTCAACXho1_3’。[0027]上述引物对根据PMD19-T载体和目的基因的序列特点引入相应酶切位点的同源序列，在引物对的5’端分别引入核酸内切酶NdeI和XhoI两端的同源序列。进一步地，扩增所述大豆蛋白的编码序列的模板为大豆胚根cDNA，即以大豆胚根cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的基因片段CGCCCATATGGCCAGCGTTGAGGTTGCACAGCAAACACCAACAACAGTTCCAGAAAATGAAACAACCGAGGTAAGCAAGACCCAGGAAACAACCCCAGTCACTGAGGCTCCTGCAACAGAACAACCAGCAGCTGAGGTTCCTGCAACAGAACAACCAGCCGCTGAGGCTCCTGCCCCAGAATCAACCACCGAAGCACCAAAGGAAGAAACCACCGAGGCACCAACAGAAACAGTAGAAAAAACAACTACAGAAGTAGCCCCAGAGGAGCCTAAAGAAGTTCCAGTTGAGACCGAGGAGGTGGTGGCAAAGGAGACAGAGGAAGAGAAGCCAGCAGAAGAGAAATCAGAGGAGAAAACTGAAGAAGTGAAAGAAGAAGCAGAGGAGCCTAAAGAAACTACTGAAACAGAATCAGCAGCAGCAGCACCACCAGCAACCACAGAGGAAGAGAACAAACCAGCTGAGTCAGTTGAAACCCCAGTAGAGGTTCCTGTTGAGAAGACTGAAGCTTAGCTCGAGCGGT。本发明实施例中，以R0期和R15期大豆胚根作为实验材料，采用100°C热处理10min后离心获得上清，富集得到的可溶性蛋白即为热稳定蛋白。根据蛋白组学和结构预测结果，在R0期（即大豆种子吸水萌发后，未突破种皮的胚根高表达蛋白中挑选了1个蛋白进行结构和功能分析，该蛋白即本发明实施例所述的大豆蛋白。_[0028]进一步地，在上述步骤S02中，所述重组质粒由蛋白表达载体PET-28a与所述大豆蛋白的编码序列重组得到。具体重组质粒的制备步骤包括:将所述蛋白表达载体PET-28a^^NdeI和XhoI双酶切处理，然后利用T4连接酶将酶切产物与所述大豆蛋白的编码序列连接，即得到重组质粒。更进一步地，将大豆蛋白的编码序列和经过双酶切的蛋白表达载体PET-28a按照摩尔比10:1混合，加入0.5uLT4连接酶，luL10XBuffer，用水补齐至1〇此，16°C连接过夜。[0029]最终得到的重组质粒的序列SEQIDN0:4为：[0030]ATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTAAGCTTCAGTCTTCTCAACAGGAACCTCTACTGGGGTTTCAACTGACTCAGCTGGTTTGTTCTCTTCCTCTGTGGTTGCTGGTGGTGGTGCTGCTGCTGATTCTGTTTCAGTAGTTTCTTTAGGCTCCTCTGCTTCTTCTTTCACTTCTTCAGTTTTCTCCTCTGATTTCTCTTCTGCTGGCTTCTCTTCCTCTGTCTCCTTTGCCACCACCTCCTCGGTCTCAACTGGAACTTCTTTAGGCTCCTCTGGGGCTACTTCTGTAGTTGTTTTTTCTACTGTTTCTGTTGGTGCCTCGGTGGTTTCTTCCTTTGGTGCTTCGGTGGTTGATTCTGGGGCAGGAGCCTCAGCGGCTGGTTGTTCTGTTGCAGGAACCTCAGCTGCTGGTTGTTCTGTTGCAGGAGCCTCAGTGACTGGGGTTGTTTCCTGGGTCTTGCTTACCTCGGTTGTTTCATTTTCTGGAACTGTTGTTGGTGTTTGCTGTGCAACCTCAACGCTGGCCATATGGCTGCCGCGCGGCACCAGGCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGGCTGCTGCCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGGAATTGTTATCCGCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGCGGGATCGAGATCTCGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGAGATCCCGGACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTAAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCGGGATCTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCTAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAGAATTAATTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCA。[0031]进一步地，在上述步骤S03中，所述感受态细胞为大肠杆菌BL21Star感受态细胞。所述诱导表达的步骤包括:将含有所述重组质粒的感受态细胞扩大培养，然后加入l%〇IPTG的贮存液，在16°C下150rmp诱导。即将含有重组质粒的菌株扩大培养，加入终浓度为O.lmM的IPTG贮存液过夜诱导，将诱导后的菌体离心收集，重悬，破碎菌体，离心，取上清液，得总可洛性蛋白。[0032]进一步地，在上述步骤S04中，所述蛋白分离纯化的步骤包括镍离子亲和层析。[0033]本发明实施例中，在500mM盐胁迫下验证了含有上述重组质粒的重组菌的存活率：将含有上述重组质粒的重组菌诱导后稀释，分别涂布在正常和高盐的平板上，对菌斑数目进行计数；以空载重组菌作为对照，计算重组菌的存活率，可证明重组菌中的对应蛋白是否具有耐盐性。结果显示，与空载重组菌的存活率对比，表达大豆蛋白Glymal5gl2170.1的重组菌的存活率明显高于空载重组菌，即证明该蛋白是具有一定的耐盐性。[0034]本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。[0035]实施例1基因的克隆t〇〇36]根据PMD19-T载体和基因序列特点引入相应酶切位点的同源序列，在扩增大豆蛋白基因的上下游引物的5’端分别引入核酸内切酶NdeI和XhoI两端的同源序列。[0037]上游引物F:5’-CGCCCATATGGCCAGCGTTGAGGTTGC-3,，[0038]下游引物R:5’-ACCGCTCGAGCTAAGCTTCAGTCTTCTCMC-3,。[0039]以上游引物F和下游引物R作为引物对，以大豆R0期胚根cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为5XPhusionHFBuffer4yL，2.5mMdNTP1.6uL，上下游引物各10mM，cDNA模板lyL，DMS00.6此，用水补齐至20yL。在PCR仪上98°C预反应30s，98°C反应5s，退火温度依据引物Tm值而定，72°C延伸反应时间依据基因长度而定，72°C1Omin，将反应产物在1%的琼脂糖凝胶电泳上分离PCR产物，用紫外灯检测，并按照核酸回收试剂盒的说明书操作收集特异性扩增产物。将扩增回收产物与TaKaRa的PMD19-Tsimple载体按照摩尔比10:1的比例混合，加入等体积的Solution〗反应缓冲液，混匀后，轻微离心，置于16°C下水浴连接过夜。[0040]本实施例中根据NCBI数据库中的Glymal5gl2170.1核酸序列设计引物，以大豆胚根总cDNA为模板，利用PCR方法扩增挑选出来的目的基因序列，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，目的基因得到有效扩增，基因的分子量大小与预期分子量大小相近如图1所示），连接T载后进行测序。将测序成功的克隆载体与蛋白表达载体PET-28a经双酶切后，通过T4连接酶连接酶切产物，构建pET-28a重组质粒，然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21Star，利用菌落PCR法对重组菌进行验证如图2所示）。结果显示构建成功的重组菌能扩增到目的片段，表明成功构建含目的基因的原核表达载体。[0041]实施例2:超级感受态的制备及转化[0042]按照上海生工提供的超级感受态试剂盒提供的方法制备大肠杆菌T0P10和BL21Star感受态，在超净工作台中挑取划线培养的大肠杆菌单克隆菌株于5mL的LB液体培养基中，在37°C、180rmp恒温摇床中培养12h后，按照1:50比例接种到50mL新鲜配制的LB培养基中，至〇D6〇q值约为〇_6。将用5〇mL离心管收集菌体，8,000g离心3min。弃上清后将菌体冰上放置1〇1^11，41：、5,00〇1'1^离心51^11，用试剂盒提供的恥汀虹六将菌体重悬后于冰上放置30min，4°C、5,OOOrmp离心5min，弃上清液，用试剂盒提供的BufferB用前-20°C预冷重悬菌体，用灭菌的1•5mLEP管分装，每管1OOuL，在-80°C冰箱中备用。[0043]将10UL连接产物加入到含有100UL大肠杆菌感受态中，轻微混匀。将大肠杆菌感受态细胞放置于冰上3〇min，42°C热激90s，冰上5min，加入900UL新鲜配制的LB液体培养基。在37°C，180rmp恒温摇床中培养lh，取300uL菌液涂布于含有相应抗生素的LB固体培养基中，37°C下倒置培养15h。[0044]实施例3:质粒提取[0045]利用OMEGA公司提供的质粒提取试剂盒操作，取lmL菌液于1.5mL的EP管中，8，OOOrmp，离心lmin，重复3次，弃上清。向装有菌体的EP管中加入BufferI200uL，用移液器充分吹打混匀后加入200此BufferII，轻微颠倒混匀2次，室温静置lmin，加入BufferIII300uL，颠倒混勾3次，整个过程不要超过5min。室温，12,000rmp离心15min，吸取上清500此，加入平衡好的核酸收集柱中，室温，12,OOOrmp离心lmin，弃废液后向核酸收集柱中加入500yLHBBuffer，室温12,000rmp离心lmin，弃废液，加入试剂盒中的600uLWBBuffer预先加入800mL无水乙醇），室温12,000rmp离心lmin重复2次，将核酸收集柱空转，15，OOOrmp离心2min除去残留的WBBuffer。向核酸收集柱内加入30uL无菌水，用一个新EP管收集质粒，室温12，000rmp离心2min。[0046]实施例4:蛋白表达载体的构建[0047]将含目的基因的PMD19-T载体按照基因引物设计的酶切位点做双酶切反应，反应体系为限制性内切酶各UiL，质粒lug，反应Buffer2此，用水补齐至10UL，反应5h，将反应产物在1%的琼脂糖凝胶电泳上分离酶切产物，在紫外灯下检测。回收目的基因片段，将目的基因片段和经过双酶切的PET-28a蛋白表达载体按照摩尔比10:1混合，加入0•5uLT4连接酶，luL10XBuffer，用水补齐至10uL，16°C连接过夜。[0048]实施例5:重组子的菌落PCR验证[0049]将连接产物转化大肠杆菌BL21Star感受态细胞，挑取少量长有转化子的菌斑为模板，用实施例1中的引物来验证重组子，PCR反应体系与过程同实施例1相同。[0050]在本实施例中，将构建成功的PET-28a蛋白重组菌扩大培养，加入O.lmMIPTG在16°C下诱导12小时，离心收集菌并用BalanceBuffer重悬菌体，通过超声破碎重组菌的细胞膜离心取上清液即为重组菌的总可溶性蛋白，以pET-28a空载体诱导前后为对照，如图3所示，图中1-4依次分别为大豆蛋白Glymal5gl2170.1本实施例中命名12号蛋白）诱导前，大豆蛋白Glymal5gl2170.1诱导后，BL21诱导前，BL21诱导后理论分子量为23.8KDa的电泳图。从结果可以看出经过SDS-PAGE电泳检测重组菌得到表达。[0051]实施例6大豆蛋白的诱导表达、分离纯化[0052]将含有重组质粒的菌株扩大培养至含有终浓度为ImM的Kana贮存液的500mLLB液体培养基中，培养至0D600约0.6，加入终浓度为0.ImM的IPTGIC存液，在16°C下150rmp过夜诱导，将诱导后的菌体离心收集用BalanceBuffer重悬，经超声破碎菌体后，在4°C，10,OOOrmp下离心30min，取上清液进行后续的分离纯化。[0053]利用亲和层析纯化蛋白，设置A栗流速3mLmin。用约5〇mL去离子水洗去与Sepharose吸附的乙醇。用约30mL0.5M氢氧化钠洗去柱子上的残留的蛋白。用约80mL去尚子水洗去氢氧化钠。上样约30mL硫酸镍，使镍离子与Sepharose结合。用约7〇mL去离子水，洗去未结合的镍离子。用约50mLBalanceBuffer平衡纯化柱。上样蛋白溶液。用约5〇mLBalanceBuffer洗去与镍离子未结合的蛋白。调节B栗流量至10%B栗中为500mM咪卩坐）洗去与镍离子弱结合蛋白；依次递增B栗流量梯度洗脱并收集蛋白。蛋白收集后清洗纯化柱，设置B泵流量为零，用去离子水洗纯化柱，至电导率为零。用60mLEDTA洗去镍离子。用去离子水清洗纯化柱，直至电导率为零。用60mL0.5M氛氧化钠洗去纯化柱中残留的蛋白。用去离子水清洗纯化柱，直至电导率为零。用20%乙醇封柱以防止细菌滋生，纯化柱于4°C保存。大S理论分子量为23•8KDa。[0054]利用蛋白脱盐柱去除蛋白溶液中的咪唑。设置A栗流速4mLmin，用去离子水约50mL洗去脱盐柱中的乙醇。蛋白上体积样小于10mL，体积过大会影响分离效果。用去离子水洗脱出目的蛋白。蛋白脱盐后清洗脱盐柱，用0.2M氢氧化钠洗去残留的蛋白并活化脱盐柱。用约50mL去离子水，洗去氢氧化钠；用20%乙醇封柱以防止细菌滋生，脱盐柱于4°C保存。[0055]将脱盐后的蛋白溶液冷冻干燥，用PBS缓冲液复溶，按照定量结果以1U凝血酶与lmg融合蛋白混合，4°C，酶切过夜。用分子筛分离纯化凝血酶酶切产物。设置A泵流速lmLmin，用去离子水洗1个柱体积。上样蛋白2mL，用去离子水洗脱出目的蛋白。收集目的蛋白后清洗分子筛，用0.2M氢氧化钠洗脱约2个柱体积。用去离子水洗至电导率峰为零。用含有0.2M醋酸钠的20%乙醇封柱以防止细菌滋生。[0056]本实施中为了获得功能验证的蛋白，将在大肠杆菌表达的重组菌中的总可溶性蛋白经镍离子亲和层析，分离纯化目的蛋白，所用层析柱参数如下:柱长:20cm;直径：16mm，填料：ChelatingSepharoseFastFlow4：BTM，填料体积：10mL;厂家：AmershamBiosciences流速为3mLmin。[0057]实施例7:500mM盐胁迫下重组菌的存活率的测定[0058]将重组质粒转化菌和空载体转化菌接入含终浓度为ImM的卡钠（10mgml的5mlLB液体培养基中，在200rpmmin37°C的摇床中过夜培养;第二天转接至含终浓度为ImM的卡钠（10mgml的5mlLB液体培养基中，在200rmin37°C的摇床中扩培;将菌液浓度扩培至0D6K=0.6-0.8之间后（重组质粒转化菌和空载体转化菌的ODsoo需调至一致），以终浓度为0.2%。的的比例加入浓度为100mMIPTG，在200rmin3〇°C的摇床中诱导4h，再测其OD6〇〇将重组质粒转化菌和空载体转化菌的〇D6Q儒调至一致并记录。[0059]将诱导后的菌液稀释10、100、1000倍后，分别取100ul涂布在有500mMNaCl的高盐LB固体培养基含终浓度为ImM的卡纳l〇Ugml，终浓度为ImM的的比例），含IPTG终浓度为4.8ugmL的比例）和正常LB固体培养基含终浓度为ImM的的卡纳（10ugml和IPTG4.如gml;正常LB固体培养基在37°C培养箱中培养15h后，记录能够进行计数的平板上的菌斑数目（平板菌落数在30-300个之间为有效数据），高盐培养基在37°C培养箱中培养48h后记录菌斑数目（平板菌落数在30-300个之间为有效数据），最后计算存活率，绘制存活率柱形图。[0060]图4和图5分别为空载体转化菌和重组质粒转化菌在不同浓度的高盐LB固体培养基和正常固体培养基的生长结果图，其中，10°、HT1、1T2、10_3分别表示稀释倍数1、10、100、1000。图6为空载体转化菌（横坐标PET-28a所示和重组质粒转化菌横坐标L0C100814402所示的存活率柱形图。[0061]本实施例中将重组菌诱导后稀释分别涂布在正常和高盐的平板上，对菌斑数目进行计数平板菌落数在3〇-300个之间为有效数据）；以空载重组菌作为对照，计算重组菌的存活率，可证明重组菌中的对应蛋白是否具有耐盐性。结果显示，与空载重组菌的存活率对比，表达大豆蛋白Glymal5gl2170.1的重组菌的存活率明显高于空载重组菌如图6，另外还进行了点板，更直观的显示了表达大豆蛋白Glymal5gl2170.1的重组菌的存活率比空载重组菌的存活率更高如图4和5，证明该蛋白是具有一定的耐盐性。[0062]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种大豆蛋白的应用，其特征在于，所述大豆蛋白作为渗透调节物质用于提高生物体的耐盐性;其中，所述大豆蛋白的编码序列如见9IDN0:1所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物体为植物和或大肠杆菌。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大豆蛋白的制备方法包括如下步骤：扩增所述大豆蛋白的编码序列；构建包含所述编码序列的重组质粒；将所述重组质粒转化至感受态细胞，进行诱导表达；将所述诱导表达后的菌液进行蛋白分离纯化，得到所述大豆蛋白。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，扩增所述大豆蛋白的编码序列的引物对如SEQIDN0:2和SEQID吣:3所示;和或扩增所述大豆蛋白的编码序列的模板为大豆胚根cDNA。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组质粒由蛋白表达载体PET_28a与所述大豆蛋白的编码序列重组得到。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组质粒的制备步骤包括:将所述蛋^表达载体PET-28a经NdeI和XhoI双酶切处理，然后利用T4连接酶将酶切产物与所述大显蛋白的编码序列连接。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述大豆蛋白的编码序列与双酶切处理的所述蛋白表达载体PET-28a按照摩尔比10:1混合进行连接。8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述感受态细胞为大肠杆菌8121Star感受态细胞。…人9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，其特征在于，所述诱导表达的步骤包括:将占有所述重组质粒的感受态细胞扩大培养，然后加入1%〇IPTG的贮存液，在16°C下15〇rmP诱导°10.如权利要求3所述的应用，其特征在于，其特征在于，所述蛋白分离纯化的步骤包括镍离子亲和层析。

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