申请/专利权人：青海省农林科学院

申请日：2018-05-09

公开（公告）日：2020-07-03

公开（公告）号：CN108641982B

主分类号：C12N1/20(20060101)

分类号：C12N1/20(20060101);A01N63/22(20200101);A01P3/00(20060101);C12R1/07(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.03#授权;2018.11.06#实质审查的生效;2018.10.12#公开

摘要：本发明公开了一种特氏盐芽孢杆菌HalobacillustrueperiS61及其应用，该菌株已于2016年9月12日保存在广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：60078。该菌株及其菌悬液或次级代谢产物对镰刀菌引起的病害具有显著拮抗作用，且材料来源广泛，成本低，对环境安全。

主权项：1.一种特氏盐芽孢杆菌S61，其特征在于，该菌株已于2016年9月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：60078；所述的特氏盐芽孢杆菌S61的16SrDNA的序列为：SEQIDNO：1。

全文数据：一种特氏盐芽孢杆菌S61及其应用技术领域[0001]本发明属于微生物技术领域，其涉及一株来源于察尔汗盐湖的嗜盐菌及其生防应用，尤其涉及一种特氏盐芽孢杆菌S61及其应用。背景技术[0002]马铃薯属于茄科茄属一年生草本植物，营养丰富，含有较高的蛋白质、维生素和无机盐。马铃薯种植面积不断扩大，病害的发生也越来越严重。其中，镰刀菌干腐病是一种重要的马铃薯贮藏期病害之一，常导致马铃薯块茎品质降低和商品薯率大幅下降，严重影响其食用价值和经济价值，成为限制马铃薯产业发展的主要因素。目前主要采用化学杀菌剂对其进行控制，但以化学防治为主的措施不但不能遏制土传病害上升的趋势，而且还会抑制土壤中的有益微生物;化学药剂的频繁使用会导致病原菌产生抗药性、污染环境和危害人类健康。生物防治因其对环境、生态和人类健康安全的优点，在世界各国得到了广泛的重视并发挥着越来越重要的作用。寻找生防菌资源，利用植物根际有益促生细菌的拮抗作用，探索控制土传病害的生物防治途径，对农业可持续发展具有重大意义。[0003]目前国内学者所研究获得的马铃薯干腐病生防菌株包括：萎缩芽胞杆菌Bacillusatrophaeus、多产色链霉菌IStreptomycespolychromogenes1、球抱链霉菌球抱亚种（Streptomycesglobisporussubsp.Globisporus、锈赤錯黄链霉菌Streptomycesrubiginosohelvlus、放线菌DOl、一株枯草芽抱杆菌（BaciIIussubtilis、俄罗斯木霉（Trichodermarossicum、球抱链霉菌（Streptomycesglobisporus。此外，部分学者就马铃薯非亲和菌株粉红单端孢Trichotheciumroseum菌丝细胞壁提取物对马铃薯干腐病的拮抗作用进行了研究。同时，部分学者对拮抗马铃薯干腐病的机理机制进行了进一步的研究，研究表明寡雄蛋白处理能提高与马铃薯块茎组织苯丙烷代谢相关的苯丙氨酸解氨酶PAL、肉桂酸脱氢酶CAD、肉桂酸羟化酶C4H和4一香豆酰一辅酶A连接酶4CL的活性及相关基因的表达;同时抗性物质总酚、类黄酮及木质素含量也因寡雄蛋白处理而提高。[0004]截至目前，关于特氏盐芽孢杆菌的研究屈指可数，许帅等人对天津海底吹填淤泥的研究表明：特氏盐芽孢杆菌对黑麦草种子的萌发无显著影响，但对黑麦草植物生长有促生作用。此外，陆文静等人所发明的一种可降解木质纤维的微生物复合菌剂中对特氏盐芽孢杆菌也有所涉及。在此基础上，本研究从盐湖湖泥极端环境中分离、纯化得到特氏盐芽孢杆菌，并将其运用于马铃薯窖藏病害的防治的突破，使得生物防治马铃薯窖藏病害成为可能，同时为盐湖等极端环境资源的利用提供了依据，奠定了基础。发明内容[0005]本发明的目的在于提供一株从察尔汗盐湖湖水中分离纯化得到的特氏盐芽孢杆菌HalobacillustrueperiS61及其生防应用，旨在解决的技术问题是针对目前马铃薯干腐病生物防治技术的不足。[0006]本发明具体通过以下技术方案实现：[0007]本发明提供的一种特氏盐芽孢杆菌HalobacillustrueperiS61，该菌株已进行保藏，保藏单位:广东省微生物菌种保藏中心;保藏地址：中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼;保藏日期：2016年9月12日；保藏编号:GDMCCN0:60078。[0008]本发明特氏盐芽孢杆菌HalobacillustrueperiS61采用稀释平板富集培养法进行分离和纯化得到。革兰氏阳性菌，球形，有荚膜，周生鞭毛，大小为〇.6-0.8μπιX0.4-0·6μηι〇[0009]本发明特氏盐芽孢杆菌S61的16SrDNA的序列为:SEQIDNO:1。[0010]本发明所述的特氏盐芽孢杆菌S61在植物病害生物防治中的应用，所述的植物病害为镰刀菌引起的病害，所述的病害具体为干腐病、枯萎病、根腐病等，所述的植物为茄科或禾本科作物，优选为马铃薯。[0011]优选的，所述的特氏盐芽孢杆菌S61的菌悬液或次级代谢产物在植物病害生物防治中的应用也在本发明的保护范围内。[0012]所述的特氏盐芽孢杆菌S61菌悬液的制备方法为:在培养Id后的菌落边缘取少许菌苔接种到有100mlATCC213改良培养液的培养瓶中，每瓶接一菌针，STcCdOOrAiirr1培养2h，用血球计数板计数为：1.0X108cfuml。[0013]所述的特氏盐芽孢杆菌S61次级代谢产物的制备方法为:在培养Id后的菌落边缘取菌苔接种到有800mlATCC213改良培养液的培养瓶中，每瓶用培养液洗入一培养皿菌，37°C、SOOrmirT1培养5d，培养液经4000rmin离心15min得上清液，萃取有机相旋转蒸发得浸膏，用无菌水将浸膏配制为20mgml，用0.25μπι微孔水性滤膜过滤得母液。[0014]所述的ATCC213改良培养液为:MgS〇4·7H2010g，CaCl2·2H200.2g，KCl5g，蛋白胨2.5g，酵母膏10g，NaCl30g，琼脂粉12g，蒸馏水至1000ml，pH7·2-7·4。[0015]本发明所述的特氏盐芽孢杆菌S61在作为制备防治作物病害药物中的应用，通过常规的液体或固体培养，获得包括细菌菌体培养物，通过常规的液体发酵生产，然后加入表面活性剂如分散剂、稳定剂、湿润剂、粘结剂、消泡剂、崩解剂、抗冻剂等中的一种或几种，或吸附载体按一定比例混合后，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂;所述的作物包括茄科和禾本科作物，优选为马铃薯。[0016]当然本发明所述的特氏盐芽孢杆菌S61的菌悬液或次级代谢产物在作为制备防治作物病害药物中的应用也在本发明的保护范围内。[0017]本发明特氏盐芽孢杆菌S61防治作物病害的方法也属于本发明的保护范围，该方法是在植物生长过程中进行喷雾处理;所述喷雾为该特氏盐芽孢杆菌S61的菌悬液或发酵液或代谢产物或制备的农药制剂。[0018]本发明的有益效果为：[0019]本发明针对马铃薯收获后窖藏过程中严重影响马铃薯品质的干腐病为靶标，从察尔汗盐湖湖水中分离筛选到一种特氏芽孢杆菌属菌株S61，其本身可显著拮抗马铃薯干腐病病原菌，且菌悬液和次级代谢产物均对马铃薯干腐病病原菌有较好的防效，同时对马铃薯安全。本发明能够有效拮抗和控制马铃薯干腐病病原菌，且原料来源广泛，成本低，对环境安全。附图说明[0020]图1是本发明实施例特氏盐芽孢杆菌S61经Biolog系统鉴定后的结果；[0021]图2是本发明实施例特氏盐芽孢杆菌S61本身与马铃薯干腐病病原真菌的培养皿对峙培养结果；[0022]图3是本发明实施例特氏盐芽孢杆菌S61次级代谢产物氯仿萃取物拮抗病原真菌青9A-4-13的结果；[0023]图4是本发明实施例特氏盐芽孢杆菌S61次级代谢产物氯仿萃取物拮抗病原真菌青9A-5-2的结果；[0024]图5是本发明实施例特氏盐芽孢杆菌S61次级代谢产物氯仿萃取物拮抗病原真菌青9A-5-10的结果；[0025]图6是本发明实施例特氏盐芽孢杆菌S61次级代谢产物氯仿萃取物拮抗病原真菌65B-2-6的结果。具体实施方式[0026]下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。[0027]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0028]实施例1特氏盐芽孢杆菌S61的分离与鉴定[0029]1.1特氏盐芽孢杆菌S61的分离纯化[0030]1水样前处理:在无菌条件下，将水样混匀，用装有0.22μπι孔径的滤膜的滤器过滤，在滤膜上富集菌体。用于富集的水样量达到30ml时，取下滤膜，放入装有3ml无菌海水的玻璃试管中，为1〇_1水样。[0031]2土样前处理：取适量土样，风干（20d左右），120°C处理Ih。称取IOg处理好的土样，加入90ml无菌海水，放入已灭菌好的装有玻璃球的三角瓶内，充分振荡30min，静置后吸取上清液，此上清液为HT1土样。将上述HT1样品依次稀释为HT2和HT3倍，吸取150μ1各梯度样品，分别涂布于各培养基平板上，每个样品重复3次。涂布后的平板倒置于培养箱中，分别于28°C和37°C下倒置培养，观察到有菌落出现，挑取单菌落，纯化。纯化后的菌株保存于试管斜面，并放置在4°C冰箱中。培养基为ATCC213改良培养基：MgS〇4*7H2010g，CaCl2.2H200.2g，KCl5g，蛋白胨2.5g，酵母膏10g，NaCl30g，琼脂粉12g，蒸馏水至1000ml，pH7.2-7.4。置于37°：光照培养箱中31后，挑去单菌落培养。[0032]1.2菌株的鉴定[0033]1.2.1形态学鉴定[0034]将菌株于培养基上进行培养，光学显微镜下观察其形状、大小、鞭毛和荚膜等形态学特征。[0035]1.2.1.1革兰氏鉴定[0036]通过革兰氏染色来确定革兰氏阳性和阴性，具体操作步骤如下：接菌针挑取少许菌苔，涂布在干净玻片上的一滴无菌水中，酒精灯灼热固定，固定完成后滴加结晶紫的混合液染色Imin，无菌水冲洗，滴加碘液作用Imin，无菌水冲洗，紧接着用95%的乙醇溶液脱色，直至洗脱液无色，最后用番红染液染色2〜3min，冲洗干净后进行镜检。结果如表1所不。[0037]1.2.1.2鞭毛鉴定[0038]接种针挑取少许菌苔，涂布在干净玻片上的一滴无菌水中，酒精灯灼热固定，固定完成后滴加混合染液（丹宁酸5.^46：131.58、福尔马林（15%2.〇1111、似0!11%I.Oml、蒸馏水100ml染色IOmin，无菌水冲洗，滴加2gml的AgN〇3溶液染色30〜60s，冲洗干净后进行镜检。结果如表1所示。[0039]1.2.1.3荚膜鉴定[0040]接种针挑取少许菌苔，涂布在干净玻片上的一滴无菌水中，滴加一滴墨汁与菌液完全混匀，盖玻片将混合液刮成薄膜，空气中风干，甲醇固定Imin，滴加0.5%的番红染液冲去残余甲醇的同时染色30s，风干后镜检。结果如表1所示。[0041]表1菌株s61形态学鉴定结果[0044]由此可见，菌株S61为革兰氏阳性菌，球形，有荚膜，周生鞭毛，大小为0.6-0.8μπιX0·4-0·6ym〇[0045]1.2.2生理生化测定[0046]BIOLOG鉴定系统进行糖代谢的特性研究;API实验进行生理生化特性的获得。[0047]1.2.2.1BI0L0G系统分析鉴定[0048]Biolog软件将读取的96孔微平板反应结果如图IA所示。系统软件与数据库的匹配程度列出4个结果，每个结果均显示3种重要的参数，即可能性ProbabilityPROB，相似性SimilaritySm和位距DistanceDIS图1B。系统得到的3个参数与数据库匹配后在ID地址栏里显示出有一个最佳的匹配名称:Bacillusmajavensissubtilis〇[0049]1.2.2.2API生理生化鉴定[0050]1.2.2.2API生理生化鉴定[0051]将菌株s61的新鲜菌苔接种于培养液中，37°C培养1〜2h，吸取0.05〜0.08ml加到盛装有相应底物的微量生化管中；其中硝酸盐还原参照《微生物学实验技术》配制溶液A和B，菌株s61培养后加硝酸盐还原试剂溶液A和B各2滴，混匀，立即观察结果。其余生化管均采取穿刺法，将已接种的生化管套上无菌塑料帽，直立于三折吸塑短架内，于35〜37°C培养箱中培养，其中淀粉的生化管培养后加Iugal氏碘液2滴，观察结果。[0052]表2菌株s61的生理生化特征[0053][0054]利用生化鉴定管检查菌株s61的生理生化反应，鉴定结果见表3。从表2可以看出：培养物可水解明胶，能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，能利用半乳糖、淀粉和酪蛋白。[0055]1.2.3分子鉴定[0056]DNA提取按照上海生工生物工程上海股份有限公司的柱式细菌DNA提取试剂盒的程序操作。选用细菌通用引物对F27:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3'，Pl541:5'-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCGCA-3'。选取特定的引物，反应条件为94°C变性45s，50°C退火45s，72°C延伸75s，50μ1反应体系30个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，经克隆测序得到序列结果。所得到的16SrDNA全序列上传到网站https:www.ezbiocloud.net进行序列对比，进而确定其属名。[0057]对菌株s61进行16SrDNA测序，测序结果如SEQIDNO:1所示。将此序列上传到https:www.ezbiocloud·net进行序列对比，最终确定其最佳属名为：Halobacillustrueperi〇[0058]基于以上特征，所述菌种其分类命名为特氏盐芽孢杆菌（HalobacillustrueperiS61，已于2016年9月12日保存在广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCN0:60078。[0059]实施例2特氏盐芽孢杆菌S61对病原真菌的拮抗作用[0060]1.1菌培养[0061]将4株病原真菌（青9A-4-13、青9A-5-2、青9Α-5-ΠΚ65Β-2-6接种于PDA培养基，置于28°C的恒温培养箱培养一周;将特氏盐芽孢杆菌S61接种于ATCC213改良培养基，置于37°C培养箱培养Id。[0062]1·2对峙培养[0063]采用“十字划线法”，将病原真菌打孔为直径5mm的菌饼放于距离中心嗜盐菌菌落直径为5mm2.5cm处，在直径9cm的培养皿中进行对峙培养。结果如表3所不。[0064]表3s61与4株马铃薯干腐病病原真菌的对峙培养[0065][0067]由表3和图2可知，随着对峙培养时间的逐渐增加，4株马铃薯干腐病病原真菌的菌落半径逐渐增大，s61与病原真菌所产生的抑菌圈的宽度逐渐减小至消失，即特氏盐芽孢杆菌S61对4株病原真菌均表现为无诘抗作用。[0068]实施例3马铃薯活体复筛[0069]1.1发酵液的制备[0070]将实施例2培养的菌接种到盛装有无菌水的锥形瓶中，置于37°C、200rmin的恒温摇床中振荡培养5d后备用。[0071]1.2菌悬液的制备[0072]将实施例2培养的菌接种到盛装有无菌水的锥形瓶中，置于37°C、200rmin的恒温摇床中振汤2h，摇勾后备用。[0073]1.3试验方法[0074]用直径5_的打孔器在消毒后的马铃薯果实上刺两个直径为5_，深为3_的伤口马铃薯果实用2%NaC10溶液浸泡IOmin之后，用自来水冲洗干净，自然晾干）。先接种40μ1病原菌悬浮液，随后接种同体积特氏盐芽孢杆菌S61悬浮液。对照先接种40μ1病原菌悬浮液，随后接相同体积的无菌水。将果实放在托盘上，并放入人工培养箱（28°C，黑暗、RH40%-50%培养两周，观察果实的发病情况。每个处理3个马铃薯，实验重复3次。[0075]1.4实验指标的测定[0076]在接种后7d、14d、21d后分别观察坏果率和测定失重率、病斑深度及宽度。失重率采用称重法测定;坏果率采用观察法测定，果实上出现病斑、腐烂、裂痕均为坏果。[0077]失重率（％=贮藏期失重量入贮时总重量X100[0078]坏果率（％=坏果数贮藏总果数X100[0079]Microsoftexcel2010版和Spss19.0进行数据统计与分析。[0080]表4s61与4株病原真菌在马铃薯活体上的拮抗作用[0081][0082]由表4可知，在马铃薯活体上S61对病原真菌青9A-5-10具有明显拮抗作用，失重率、坏果率和病斑深度分别为:0.01、〇和0.32cm。S61对青9A-5-2、青9A-5-10和65B-2-6具有不同程度的抑制作用，失重率、坏果率和病斑深度分别为:0.06、0.02、0.02;89%、56%、89%;1.92、1.29和I.72cm。可见，特氏盐芽孢杆菌S61大分子物质对马铃薯干腐病病原真菌的拮抗作用较弱。[0083]实施例4特氏盐芽孢杆菌S61次级代谢产物对病原真菌的拮抗作用[0084]将实施例2中培养的嗜盐菌接种于液体培养基中，置于28°C、200rmin的恒温摇床中振荡培养5〜7d后，在大型离心机中4000rmin离心15min，取上清液分别与乙酸乙酯、氯仿、正丁醇等体积盛装于分液漏斗中摇匀，进行分液萃取。将萃取得到分层液体分别进行旋转蒸发，用甲醇溶解出旋蒸瓶中的浸膏，制得的粉末状物质保存与4°C冰箱中备用。[0085]将上述制备得到的粉末用无菌水配置成浓度为20mgml的原液，置于20000r111；[11、4€的低温离心机中离心15111；[11，然后抽滤灭菌，最终梯度稀释为2011^1111、1011^1111、5mgml和lmgml四个浓度梯度备用。采用“牛津杯”法进行嗜盐菌次级代谢产物与病原真菌的对峙培养，牛津杯中次级代谢产物溶液的量为200μ1。结果如表5所示。[0086]表5s61次级代谢产物与4株病原真菌的拮抗作用[0089]由表5和图3-6可知，随着培养时间的逐渐增加3d、7d、14d，4株病原真菌的菌落半径逐渐增大。然而，特氏盐芽孢杆菌S61次级代谢产物不同有机溶剂的拮抗作用有所不同，且差异显著。特别需要注意的是，s61次级代谢产物氯仿萃取物对4株马铃薯干腐病病原真菌均表现出明显的拮抗作用，且拮抗作用有强到弱依次为:青9A-5-10抑菌圈均值为：（0.55cm、青9A-5-20.53cm、青9A-4-130.47cm和65B-2-60.32cm。说明较s61大分子物质而言，小分子物质对马铃薯病原真菌具有拮抗作用，且大小分子物质均对青9A-5-10具有明显的拮抗作用。[0090]实施例5s61次级代谢产物马铃薯活体复筛[0091]在上述实施例的基础上，进一步利用特氏盐芽孢杆菌S61次级代谢产物进行马铃薯活体复筛实验，结果见表6。[0092]表6s61与4株病原真菌在马铃薯活体上的拮抗作用[0093][0095]由表6可知，特氏盐芽孢杆菌S61与4株马铃薯病原真菌在马铃薯活体上的拮抗作用结果表明：除失重率外，马铃薯病斑深度、病斑宽度和坏果率在4株病原真菌、同一病原真菌次级代谢产物的3种不同有机溶剂萃取物以及同一种有机溶剂萃取物的不同浓度梯度下均较阳性对照存在显著差异。尤其需要强调的是，特氏盐芽孢杆菌S61次级代谢产物的乙酸乙酯、氯仿以及正丁醇萃取物均对病原真菌青9A-5-10具有显著地拮抗作用。[0096]实施例6对马铃薯安全性评价实验[0097]表7—种特氏盐芽孢杆菌s61对马铃薯的安全性评价[0098][0099]由表7可知，只接无菌水的空白对照CK与只接特氏盐芽孢杆菌s61的阴性对照的失重率之间无显著差异，且病斑深度、病斑宽度以及发病率等衡量指标指标值均为零，即说明一种特氏盐芽胞杆菌s61对马铃薯安全。

权利要求：1.一种特氏盐芽孢杆菌S61，其特征在于，该菌株已于2016年9月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO:60078。2.根据权利要求1所述的一种特氏盐芽孢杆菌S61，其特征在于，所述的特氏盐芽孢杆菌S61的16SrDNA的序列为：SEQIDN0:1。3.权利要求1所述的特氏盐芽孢杆菌S61在植物病害生物防治中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的植物病害为镰刀菌引起的病害，所述的病害具体为干腐病、枯萎病或根腐病。5.权利要求1所述的特氏盐芽孢杆菌S61的菌悬液或次级代谢产物在植物病害生物防治中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的特氏盐芽孢杆菌S61菌悬液的制备方法为:在培养Id后的菌落边缘取少许菌苔接种到有100mlATCC213改良培养液的培养瓶中，每瓶接一菌针，37°C、20〇Γπΰη_1培养2h，用血球计数板计数为：1.0X108cfuml。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的特氏盐芽孢杆菌S61次级代谢产物的制备方法为:在培养Id后的菌落边缘取菌苔接种到有800mlATCC213改良培养液的培养瓶中，每瓶用培养液洗入一培养皿菌，37°C、200rmin_1培养5d，培养液经4000rmin离心15min得上清液，萃取有机相旋转蒸发得浸膏，用无菌水将浸膏配制为20mgml，用0.25μπι微孔水性滤膜过滤得母液。8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述的ATCC213改良培养液为:MgS〇4·7H2010g，CaCl2*2H200.2g，KCl5g，蛋白胨2.5g，酵母膏10g，NaCl30g，琼脂粉12g，蒸馏水至1000ml，pH7.2-7.4。9.权利要求I所述的特氏盐芽孢杆菌S61在作为制备防治作物病害药物中的应用。10.权利要求1所述的特氏盐芽孢杆菌S61的菌悬液或次级代谢产物在作为制备防治作物病害药物中的应用。

百度查询： 青海省农林科学院 一种特氏盐芽孢杆菌S61及其应用

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