申请/专利权人：镜株式会社

申请日：2016-05-10

公开（公告）日：2020-07-03

公开（公告）号：CN107407668B

主分类号：G01N30/88(20060101)

分类号：G01N30/88(20060101);G01N27/62(20060101);G01N30/06(20060101);G01N30/72(20060101)

优先权：["20150511 JP 2015-096959"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.03#授权;2018.05.29#专利申请权、专利权的转移;2018.03.02#实质审查的生效;2017.11.28#公开

摘要：本发明的结合型氨基酸的旋光性分析方法包括：使用氘代盐酸重水溶液及或重水对结合型氨基酸进行水解的步骤；对通过所述水解所生成的氨基酸的D异构体与L异构体进行光学拆分的步骤；自所述光学拆分的氨基酸生成碎片的步骤；自所述生成的碎片中通过质量分析而选择包含α碳且不包含侧链的规定的碎片,并进行解析的步骤。

主权项：1.一种结合型氨基酸的旋光性分析方法，其特征在于具有：使用氘代盐酸重水溶液或重水使结合型氨基酸水解的步骤；对通过所述水解所生成的氨基酸的D异构体与L异构体进行光学拆分的步骤；自所述光学拆分的氨基酸生成碎片的步骤；及自所述生成的碎片中通过质量分析选择包含α碳且不包含侧链的规定的碎片并进行解析的步骤。

全文数据：结合型氨基酸的旋光性分析方法及旋光性分析系统技术领域[0001]本发明涉及一种结合型氨基酸的旋光性分析方法及结合型氨基酸的旋光性分析系统。背景技术[0002]结合型氨基酸是氨基酸通过酰胺键肽键链状键结所形成的化合物，在生物体内以蛋白质或肽的形式存在，其与糖、脂质等同样，是一重要成分。氨基键结于键结有羧基的碳α碳而成的α-氨基酸，除了甘氨酸以外，是具有以α碳作为光学中心的光学异构物的D异构体、L异构体的旋光性分子。以往认为，生物体内存在的结合型氨基酸的大部分由L-氨基酸构成，作为其光学异构物的D-氨基酸仅存在于细菌的细胞壁的肽聚糖的构成成分等极其有限的生物体分子。[0003]然而，近年来，随着具有识别D-氨基酸及L-氨基酸的能力的旋光性分析技术的发展，逐渐阐明了以微生物或植物为首，哺乳动物中亦存在各种D-氨基酸，可对生理现象造成影响。[0004]关于包括蛋白质在内的结合型氨基酸的氨基酸残基的鉴定或定量，一般而言，对使用热或酸发生水解而生成的氨基酸，使用层析法等分离技术，但在所述过程中可能会产生以D异构体与L异构体互相转换的异构化为因的人工产物，而对内在性旋光性分子的准确分析造成障碍。[0005]非专利文献1中公开了一种旋光性分析方法，其中使用氘代盐酸使蛋白质水解后，使用具备旋光性管柱的LCESI-MSMSliquidchromatographyelectrosprayionization-tandemmassspectrometry，液相色谱电喷雾电离-串联质谱仪），算出氨基酸残基的D异构体与L异构体的比率（％D:DD+L。此时，关于水解过程中异构化的氨基酸，由于键结于α碳的氢原子被氘原子取代，因此在包含α碳的离子的质量分析中，利用质荷比不同的特点，与未异构化的氨基酸进行区分。[0006][先前技术文献][0007][非专利文献][0008]非专利文献1:T.Miyamoto，M.Sekine，T·Ogawa，M.Hidaka，H.Homma，H.Masaki:GenerationofEnantiomericAminoAcidsduringAcidHydrolysisofPeptidesDetectedbytheLiquidChromatographyTandemMassSpectroscopy,Chem.Biodivers.,7,1644-16492010.发明内容[0009]〈本发明要解决的课题〉[0010]然而，非专利文献1记载的方法中，具有侧链的氨基酸残基其侧链中包含的氢原子也有可能被氘原子取代，而在质量分析中，对于侧链中包含的氢原子经氘原子取代的人工产物、及键结于α碳的氢原子经氘原子取代的人工产物无法进行区分。因此会造成对结合型氨基酸中内在的微量的氨基酸残基进行旋光性分析时，导致其准确度明显降低的问题。[0011]对此，本发明的一形态鉴于上述现有技术所具有的问题，其目的在于提供一种能够以较高的准确度识别结合型氨基酸的分析过程中产生的人工产物、及结合型氨基酸中内在的D-氨基酸残基及或L-氨基酸残基结合型氨基酸的旋光性分析方法及旋光性分析系统。[0012]〈解决上述课题的手段〉[0013]根据本发明的一形态，提供一种结合型氨基酸的旋光性分析方法，其特征在于具有:使用氘代盐酸重水溶液及或重水使结合型氨基酸水解的步骤;对通过所述水解所生成的氨基酸的D异构体与L异构体进行光学拆分的步骤；自所述光学拆分的氨基酸生成碎片的步骤；自所述生成的碎片中通过质量分析选择包含α碳且不包含侧链的规定的碎片并进行解析的步骤。[0014]另外，根据本发明的一形态，提供一种结合型氨基酸的旋光性分析系统，其特征在于具有:光学拆分部，对通过使用氘代盐酸重水溶液及或重水使结合型氨基酸水解而生成的氨基酸的D异构体与L异构体进行光学拆分;碎片生成部，自所述光学拆分的氨基酸生成碎片;及质量分析部，自所述生成的碎片中通过质量分析选择包含α碳且不包含侧链的规定的碎片并进行解析。[0015]〈发明的效果〉[0016]本发明可提供一种结合型氨基酸的旋光性分析方法及旋光性分析系统，其能够以较高的准确度识别结合型氨基酸的分析过程中产生的人工产物、及结合型氨基酸中内在的D-氨基酸残基及或L-氨基酸残基。附图说明[0017]图1是表示本实施方式中的结合型氨基酸的旋光性分析系统的结构的一例的图。[0018]图2是表示肽的水解产物中包含的天冬氨酸及谷氨酸的旋光性分析的结果的图。具体实施方式[0019]以下，关于用以实施本发明的形态，参照附图进行说明。[0020]本实施方式中的结合型氨基酸的旋光性分析方法具有：使用氘代盐酸重水溶液及或重水使结合型氨基酸水解的步骤;对通过所述水解所生成的氨基酸的D异构体与L异构体进行光学拆分的步骤；自所述光学拆分的氨基酸生成碎片的步骤；自所述生成的碎片中通过质量分析选择包含α碳且不包含侧链的规定的碎片并进行解析的步骤。[0021]根据本实施方式的结合型氨基酸的旋光性分析方法，能够以较高的准确度识别结合型氨基酸的分析过程中产生的人工产物、及结合型氨基酸中内在的D-氨基酸残基及或L-氨基酸残基。[0022]结合型氨基酸是氨基酸通过酰胺键肽键链状键合所形成的化合物，例如，在生物体内以蛋白质或肽的形式存在。[0023]结合型氨基酸的水解一般是指，水与结合型氨基酸产生反应，并获得作为分解产物的游离氨基酸的反应。[0024]在使结合型氨基酸水解的步骤中，可以使用氘代盐酸重水溶液、重水等，并应用公知的水解方法，例如，可以使用非专利文献1所记载的水解方法。[0025]在此，温度或氘代盐酸、重水的浓度、时间等水解条件可任意设定。另外，经这种水解而获得的游离氨基酸中，可包含维持结合型氨基酸残基的立体排布的产物、及在反应中产生异构化的产物。[0026]作为一例，对通过使结合型氨基酸与氘进产生应使而水解获得的游离天冬氨酸进行说明。[0027]首先，结合型氨基酸中内在的天冬氨酸残基如化学式⑴所示。[0029]其次，使结合型氨基酸水解而获得的，且在反应步骤中未异构化的天冬氨酸如化学式2—4所示。[0031]进而，使结合型氨基酸水解而获得的，且在反应步骤中异构化的天冬氨酸如化学式5—7所示。[0033]然后，对结合型氨基酸经水解而获得的氨基酸的D异构体与L异构体进行光学拆分。[0034]作为对氨基酸的D异构体与L异构体进行光学拆分的方法，并无特别限定，可列举：利用结晶化、旋光度、酶反应中的相异性质的方法;或非对映异构体法;使用不对称要素相异的相分配的方法等。其中，优选使用具有旋光性识别能力的固定相管柱的层析法。[0035]如上述天冬氨酸这种具有包含可被氘原子取代的氢原子的侧链的氨基酸残基的情况，例如化学式3及化学式5中，针对1分子有1个氢被氖取代，因此表不相同的质量。同样，化学式⑷及化学式⑹中，针对1分子有2个氢被取代为氖，因此表不相同的质量。在这种结构的分子中，虽然步骤中的异构化历程不同，但无法以质量进行分离。[0036]在本实施方式中，进而，对光学拆分的氨基酸或氨基酸衍生物分别进行碎片化而生成碎片。在此，通过碎片化，可生成质量小于碎片化之前的氨基酸或氨基酸衍生物的一个以上的碎片。[0037]通过热、压力、分子碰撞等，可由光学拆分的D异构体及L异构体分别生成这种碎片，例如，可以利用质量分析仪所具备的分子碰撞机构来生成。[0038]作为一例，就天冬氨酸而言，例如生成化学式8所示的包含α碳且不包含侧链的碎片。并且，此时亦可生成包含α碳及或侧链的碎片。[0040]然后，通过质量分析并基于质量来分离、检测所生成的碎片，选择包含α碳且不包含侧链的规定的碎片并进行解析。具体而言，能够对包含α碳且不包含侧链的规定的碎片中的，键结于α碳的氢原子被氘原子取代者及未经取代者进行识别。接下来，可基于该数据，鉴定维持结合型氨基酸残基的立体排布者及步骤中经异构化者，并解析D-氨基酸与L-氨基酸的存在比率或量。[0041]如此，即使是具有包含可被氘原子取代的氢原子的侧链的氨基酸残基，也能够通过生成、分离、检测、选择、解析包含α碳且不包含侧链的规定的碎片，来排除侧链导入有氘原子的人工产物。[0042]由此，能够以较高的准确度识别结合型氨基酸的分析过程中产生的人工产物、及结合型氨基酸中内在的D-氨基酸残基及或L-氨基酸残基。[0043]在此，例如可以通过对分析对象的氨基酸经同位素取代的标准品的质量分析光谱进行解析，来推断碎片的结构。[0044]在结合型氨基酸的旋光性分析方法中，为了提高光学拆分或质量分析的效率，可以在对氨基酸的D异构体与L异构体进行光学拆分之前、或对氨基酸的D异构体与L异构体进行光学拆分之后，使氨基酸衍生化。[0045]作为使氨基酸衍生化时使用的衍生化试剂，并无特别限定，可列举:4_氟-7-硝基苯并呋喃（4-Fluoro_7-nitrobenzofurazan、4_氣_7_硝基-2,1，3_苯并恶二卩坐（4_Fluor〇-7_nitr〇-2，I，3-benzoxadiazole、邻苯二甲酸（o-Phthalaldehyde、异硫氨酸苯酯IsothiocyanicAcidPhenylEster、焚光胺（Fluorescamine、丹横酰氯（DansylChloride等。[0046]本实施方式中的结合型氨基酸的旋光性分析方法适合用于对结合型氨基酸中所包含的，且具有包含可在水解步骤中被氘原子取代的氢原子的侧链的氨基酸残基的D异构体及L异构体进行识别的分析。在此情形下，可以使用本实施方式中的结合型氨基酸的旋光性分析方法，对结合型氨基酸中包含的所有氨基酸残基的D异构体及L异构体进行分析，亦可仅对具有包含可被氘原子取代的氢原子的侧链的氨基酸残基的D异构体及L异构体进行分析。[0047]作为包含可被氘原子取代的氢原子的基，并无特别限定，可列举亚甲基等，例如为键结于羧基等吸电子基的亚甲基等。[0048]作为具有键结于羧基的亚甲基的氨基酸，并无特别限定，可列举:天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu等。[0049]在此，本实施方式中的结合型氨基酸的旋光性分析方法并不限于天然存在的结合型氨基酸，亦可应用于人工合成的结合型氨基酸。[0050]图1是表示本实施方式中的结合型氨基酸的旋光性分析系统100的结构的一例的图。本实施方式中的结合型氨基酸的旋光性分析系统100具有:光学拆分部104,其对通过使用氘代盐酸重水溶液及或重水使结合型氨基酸水解而生成的氨基酸的D异构体与L异构体进行光学拆分;碎片生成部106，其使光学拆分的氨基酸生成包含α碳且不包含侧链的碎片；质量分析部108，其通过质量分析，检测生成的碎片。[0051]在此，结合型氨基酸的旋光性分析系统100还可以具有水解部102,其使结合型氨基酸与重水产生反应而水解。另外，结合型氨基酸的旋光性分析系统100还可以具有氨基酸分离部103,以在结合型氨基酸包含多种氨基酸的情况下，对经过水解部102水解的各氨基酸进行分离。另外，结合型氨基酸的旋光性分析系统100还可在质量分析部108内具有用于对检测出的信息进行解析的信息解析数据处理部，或亦可不限于质量分析部108内，另外具有对检测出的信息进行解析的信息解析数据处理部110。[0052]水解部102例如具备，可在使包含结合型氨基酸的试料干燥并保持真空状态的反应恒温槽中，使结合型氨基酸水解的机构。但是，水解部102亦可採用以离线方式进行水解处理的结构，而非作为规定的装置配置在旋光性分析系统100中。[0053]氨基酸分离部103例如包含逆相微管柱等，自其他成分分离出目标氨基酸。另外，氨基酸分离部103可与光学拆分部104—体构成。[0054]光学拆分部104例如具备基于层析法的分离机构，其中利用可对水解后的试料的光学活性进行识别的固定相。[0055]碎片生成部106例如具有通过对光学拆分后的试料赋予分子碰撞等的能量而使其碎片化的机构。[0056]质量分析部108例如具备使试料离子化，通过电性、磁性作用等并根据质荷比使碎片离子分离并进行检测，从而获得与质荷比、检测强度相关的质谱。[0057]信息解析部108例如具备自质谱中选择作为对象的碎片离子，进行定性、定量解析，并输出检测量、比率数据等的机构。信息解析部108的结构可由任意的计算机的CPUcentralprocessingunit，中央处理器）、存储器、下载到存储器的程序、储存该程序的硬盘等存储单元、网络连接用界面为中心，通过硬件及软件的任意组合来实现。[0058]这种结构的结合型氨基酸的旋光性分析系统100能够以较高的准确度识别结合型氨基酸的分析过程中产生的人工产物、及结合型氨基酸中内在的D-氨基酸残基及或L-氨基酸残基。[0059][实施例][0060]作为结合型氨基酸，向全由L异构体的氨基酸合成的肽H2N-Gly-Pro-Glu-Ala-Asp-Ser-Gly-C00H渡边化学工业公司制造）Img中加入氘化率为100%的0·IM氘代盐酸ACROSORGANICS公司制造250yL，并在4°C下静置1晚后，使水蒸发而使之干燥。进而，加入氘化率为100%的61氖代盐酸仏〇?0301«^见03公司制造20^1^，使用加热器¥丨6^公司制造），在110°C下进行20小时的水解后，使水蒸发而使之干燥。然后，加入水IOOyL，通过孔径为〇.45μηι的过滤器Millipore公司制造进行过滤后，以8000rpm进行了5分钟的离心分离，获得了游离氨基酸水溶液l〇〇yL。[0061]在获得的游离氨基酸水溶液IOyL中加入pH值为8.0的400mM硼酸钠缓冲能够溶液IOyL及NBD-F4-Fluor〇-7_nitrobenzofurazan，4-氣_7_硝基苯并呋喃）（东京化成公司制造）的40mM乙腈溶液5yL后，并在60°C下进行2分钟的反应后，加入2体积％三氟乙酸水溶液75yL，终止反应，而获得了氨基酸的NBDnitrobenzofurazan，硝基苯并呋喃衍生物。[0062]使用二维HPLC-FL-MSMShighperformanceIiquidchromatography-fluorescencespectrophotometry-tandemmassspectrometry，高效液相层析法-萤光分光光度法-串联质谱仪系统，分析了氨基酸的NBD衍生物。此时，二维HPLC-FL-MSMS系统的装置结构及分析条件如下所述。在此，在氨基酸分离部103使用第一维的管柱，分离了各氨基酸的NBD衍生物。并且，在光学拆分部104使用第二维的管柱，分离了各氨基酸的D异构体与L异构体。[0063]•装置结构[0064][0065]输液栗:3301资生堂公司制造）[0066]管柱烘箱:3004资生堂公司制造）[0067]自动取样器:3033资生堂公司制造）[0068]萤光检测器:3213资生堂公司制造）[0069]数据处理程序:EzchromeElite资生堂公司制造）[0070][0071]输液栗:3201资生堂公司制造）[0072]除气器:3202资生堂公司制造）[0073]管柱烘箱:3014资生堂公司制造）[0074]自动取样器:3033资生堂公司制造）[0075]高压阀：3011资生堂公司制造）[0076]萤光检测器:3013资生堂公司制造）[0077]质量分析仪:TQ_5500ABSciex公司制造）[0078]数据处理程序:AnalystABSciex公司制造）[0079]•分析条件[0080][0081]管柱：单片型0DS0ctadecylsilyl，十八烷基硅烷基）管柱（0.53mm内径）X1000mm[0082]流动相！O'-'SSmiriw.UOO%，35—55min;A100%-B100%梯度（gradient100min；B100%,IOOs^130min；C100%,130^180niin；A100%[0083]流动相的流速:25yLmin[0084]A:5质量％乙腈、0.05质量％三氟乙酸水溶液[0085]B:18质量％乙腈、0.05质量％三氟乙酸水溶液[0086]C:85质量％乙腈水溶液[0087][0088]管柱：Sumichiral0A-3200S1·5mm内径）X250mm[0089]谷氨酸用流动相:0.8质量％甲酸的乙腈甲醇体积比：8020溶液[0090]天冬氨酸用流动相：1质量％甲酸的乙腈甲醇体积比：5050溶液[0091]流动相的流速：150yLmin[0092]萤光检测装置:计测激发波长470nm、萤光波长530nm时的萤光强度[0093]质量分析装置:计测对于离子化电压5500V、温度600°C下生成的母离子mz:299Asp;313Glu赋予碰撞能量37eVAsp;21eVGlu所获得的碎片离子[0094]质量分析装置对应于碎片生成部106及质量分析部108。[0095]作为通过质量分析进行检测的碎片离子，[0096]选择了⑴源自天冬氨酸的NBD衍生物的包含α碳及侧链的离子mz:192Asp，有侧链）；[0097]2源自天冬氨酸的NBD衍生物的包含α碳且不包含侧链的离子mz:237Asp，无侧链）；[0098]3源自谷氨酸的NBD衍生物的包含α碳及侧链的离子mz:247Glu，有侧链）；及[0099]⑷源自谷氨酸的NBD衍生物的包含α碳且不包含侧链的离子mz:149Glu，无侧链。[0100]在此，（1及⑶以键结于α碳的氢原子未被氘原子取代的碎片作为对象。[0101]图2表示肽的水解产物中所包含的天冬氨酸及谷氨酸的旋光性分析的结果。图2中，除了上述1〜4的结果以外，还表示萤光检测结果。[0102]另外，根据萤光、MS各者的层析图，通过下式[0103]D异构体的层析的波峰的高度标准品的D异构体的层析的波峰的高度{L异构体的层析的波峰的高度标准品的L异构体的层析的波峰的高度+D异构体的层析的波峰的高度标准品的D异构体的层析的波峰的高度}X100,算出了％D。[0104]根据图2可知，即使是全由L异构体的氨基酸合成的肽，也被检测出D异构体。其理由被推测为，可能因试剂的纯度、蛋白质的结合水、反应中使用的氘代盐酸或试料中内在的质子，键结于α碳的氢原子在异构化反应时未被氘原子取代，从而产生的人工产物。但是，根据图2可知，在源自天冬氨酸的NBD衍生物的包含α碳且不包含侧链的碎片离子Asp，无侧链）中，与源自天冬氨酸的NBD衍生物的包含侧链的碎片离子Asp，有侧链或萤光检测结果相比，D异构体的检测量降低。根据信噪比（SN算出检测极限，并对检测灵敏度进行比较的情况下，在源自天冬氨酸的NBD衍生物的包含α碳且不包含侧链的碎片离子中，与完全不具有人工产物的识别、选择能力的萤光检测相比，检测灵敏度提高18.5倍，与包含侧链的碎片离子相比，检测灵敏度提高1.6倍。[0105]另外，在源自谷氨酸的NBD衍生物的包含α碳且不包含侧链的碎片离子Glu，无侧链）中，与源自谷氨酸的NBD衍生物的包含侧链的碎片离子Glu，有侧链或萤光检测结果相比，D异构体的检测量降低。根据信噪比（SN算出检测极限，并对检测灵敏度进行比较的情况下，在源自谷氨酸的NBD衍生物的包含α碳且不包含侧链的碎片离子中，与萤光检测相比，检测灵敏度提高41.2倍，与包含侧链的碎片离子相比，检测灵敏度提高8.3倍。[0106]上述情况表示通过选择包含α碳且不包含侧链的碎片离子作为检测的碎片离子，能够以较高的准确度识别分析过程中产生的人工产物、及结合型氨基酸中内在的D-氨基酸残基及或L-氨基酸残基。[0107]以上，对本发明的优选实施方式及实施例进行了详述，但本发明并不限定于所述规定的实施方式及实施例，可以在权利要求书记载的本发明要旨的范围内，进行各种变化、变更。[0108]本国际申请根据2015年5月11日提出的日本专利申请2015-096959号请求优先权，并包括其所有内容。

权利要求：1.一种结合型氨基酸的旋光性分析方法，其特征在于具有：使用氘代盐酸重水溶液及或重水使结合型氨基酸水解的步骤；对通过所述水解所生成的氨基酸的D异构体与L异构体进行光学拆分的步骤；自所述光学拆分的氨基酸生成碎片的步骤;及自所述生成的碎片中通过质量分析选择包含α碳且不包含侧链的规定的碎片并进行解析的步骤。2.如权利要求1所述的结合型氨基酸的旋光性分析方法，其特征在于，通过层析法对通过所述水解所生成的氨基酸的D异构体与L异构体进行光学拆分。3.如权利要求1所述的结合型氨基酸的旋光性分析方法，其特征在于，还包括使通过所述水解所生成的氨基酸衍生化的步骤，对所述衍生化后的氨基酸的D异构体与L异构体进行光学拆分。4.如权利要求1所述的结合型氨基酸的旋光性分析方法，其中，在所述生成碎片的步骤中，自所述光学拆分的氨基酸的D异构体及L异构体分别生成所述碎片，在所述进行解析的步骤中，对所述光学拆分的氨基酸的D异构体及L异构体，分别选择包含α碳且不包含侧链的所述规定的碎片，并基于所述D异构体的所述规定的碎片及所述L异构体的所述规定的碎片，解析所述结合型氨基酸中原本包含的所述氨基酸的D异构体或L异构体的存在比率。5.如权利要求4所述的结合型氨基酸的旋光性分析方法，其中，在所述进行解析的步骤中，所述规定的碎片是包含α碳但不包含侧链，且键结于所述α碳的氢原子未经氘原子取代的碎片。6.如权利要求1所述的结合型氨基酸的旋光性分析方法，其中，在生成所述碎片的步骤中，通过热、压力或分子碰撞，自所述氨基酸生成所述碎片。7.—种结合型氨基酸的旋光性分析系统，其特征在于具有：光学拆分部，对通过使用氘代盐酸重水溶液及或重水使结合型氨基酸水解而生成的氨基酸的D异构体与L异构体进行光学拆分；碎片生成部，自所述光学拆分的氨基酸生成碎片;及质量分析部，自所述生成的碎片中通过质量分析选择包含α碳且不包含侧链的规定的碎片并进行解析。8.如权利要求7所述的结合型氨基酸的旋光性分析系统，其特征在于，还具有水解部，使用氘代盐酸重水溶液及或重水使所述结合型氨基酸水解。9.如权利要求7所述的结合型氨基酸的旋光性分析系统，其特征在于，所述质量分析部中具有对检测出的信息进行解析的信息解析数据处理部。10.如权利要求7所述的结合型氨基酸的旋光性分析系统，其特征在于，还具有对检测出的信息进行解析的信息解析数据处理部。

百度查询： 镜株式会社 结合型氨基酸的旋光性分析方法及旋光性分析系统

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