买专利,只认龙图腾
首页 专利交易 科技果 科技人才 科技服务 商标交易 会员权益 IP管家助手 需求市场 关于龙图腾
 /  免费注册
到顶部 到底部
清空 搜索

【发明授权】一种L-木糖的酶法制备方法_上海凌凯医药科技有限公司_201711366823.6 

申请/专利权人:上海凌凯医药科技有限公司

申请日:2017-12-18

公开(公告)日:2020-07-03

公开(公告)号:CN108165591B

主分类号:C12P19/02(20060101)

分类号:C12P19/02(20060101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2020.07.03#授权;2018.07.13#实质审查的生效;2018.06.15#公开

摘要:本发明公开了一种L‑木糖的酶法制备方法,属于生物工程领域。本发明将2‑酮基‑L‑古龙酸溶于含有镁离子和焦磷酸硫胺素的缓冲液中,再向缓冲液中加入丙酮酸脱羧酶,在适宜的温度下进行酶催化反应,反应结束后利用高效液相色谱仪检测,证明有L‑木糖的生成。采用本发明方法,找到一种新的生产L‑木糖的方法,原料成本低,对环境无污染,具有重要的经济效益和社会效益。

主权项:1.一种酶法催化反应制备L-木糖的方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤1:将2-酮基-L-古龙酸溶于pH7.5的50mM的MES缓冲液中;步骤2:向pH7.5的50mM的MES缓冲液中加入丙酮酸脱羧酶、氯化镁以及焦磷酸硫胺素得到催化反应体系,所述氯化镁浓度为5mM,所述焦磷酸硫胺素的浓度为1mM;步骤3:将催化反应体系放在45℃的温度环境下进行反应。

全文数据:一种L-木糖的酶法制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种L-木糖的酶法制备方法,属于生物工程领域。背景技术[00°2]木糖是一种五碳糖,D-木糖主要存在于植物和动物体内。木糖属于无热量甜味剂,广泛应用于食品、医药、化工等领域。食用木糖能改善人体的微生物环境,提高机体免疫能力,是糖尿病人理想的甜味剂。[0003]目前制备木糖均采用酸法提取,酸法生产木糖多采用硫酸进行水解,但酸法生产木糖有如下缺点:①生产过程中采用大量硫酸,硫酸使原料中的纤维素和半纤维素及其它糖类物质水解,产生多种副产物,影响后提取工艺和产品质量。②酸法提取木糖由于生产过程中加入大量强酸强碱液体,生产过程中产生大量生产废液,对环境造成了巨大污染。③由于酸水解的糖液杂质多,使得后处理效率低,化工程序多,对设备要求高,增加环保成本。[0004]目前,L-木糖的生产主要是由化学合成的方法,存在上述的不利因素。L-木糖也可由L-木酮糖转化生成,但是L-木酮糖属于稀有糖,价格较高,不宜作为生产^木糖的原料。发明内容[0005]本发明的目的是提供一种酶法催化反应制备L-木糖的方法。[0006]本发明所述的酶法催化反应制备L-木糖的方法,其步骤如下:[0007]步骤1:将2-酮基-L-古龙酸溶于缓冲液中。[0005]步骤2:向缓冲液中加入丙酮酸脱羧酶、氯化镁以及焦磷酸硫胺素得到催化反应体系。[0009]步骤3:将催化反应体系放在一定温度环境下进行反应。[0010]在本发明的一种实施方式中,步骤1中使用的原料2-酮基-L-古龙酸浓度为1〇〇一600mM,例如300mM。[0011]在本发明的一种实施方式中,步骤2缓冲液浓度为10-l〇〇mM、pH为5_9,例如pH为7.5的50mM梓檬酸缓冲液或者磷酸缓冲液或者MES缓冲液。[0012]在本发明的一种实施方式中,步骤2中丙酮酸脱羧酶的酶用量为40〜48UmL,例如2.5mL反应体系中添加2mL酶活50-60UmL的酶液。[0013]在本发明的一种实施方式中,步骤2催化反应体系中氯化镁浓度1〜1〇碰,焦磷酸硫胺素的浓度为〇〜2mM;例如氯化镁浓度5mM,焦磷酸硫胺素的浓度*lmM。'[0014]在本发明的一种实施方式中,步骤3在40-60°C条件下进行催化反应,例如在如^环境下反应15tu[0015]2-酮基-L-古龙酸为维生素C前体,已实现工业化生产,原料价格低,由2—酮基一L_古龙酸在丙酮酸脱竣酶的催化下生成L_木糖,尚未发现与此相关的文献报道。由实验验证可得,采用本发明的方法,可以由2-酮基-L-古龙酸在丙酮酸脱羧酶的催化下生成卜木糖,为L-木糖的生产提供了新的原料和方法。而且由于酶法制备木糖,具有高效、专一、能耗低污染小、操作简单易控,而且原料单一,副产物少,产物易纯化;利用酶法制备L-木糖对菌种无毒害性,可直接用于酵母菌的生物转化实验,生产木糖醇,此种方法不需要脱毒,发酵性能好,利于木糖转化为木糖醇,并且酶法催化2_酮基_L-古龙酸制备L_木糖的过程中没有强酸强碱等腐蚀性溶液的加入,不会给环境带来污染,因此,这种制备L-木糖的方法为以后绿色工业化生产奠定基础。附图说明[0016]图1:2-酮基-L-古龙酸在丙酮酸脱羧酶的催化下生成L-木糖的原理[0017]图2:丙酮酸脱羧酶蛋白电泳图[0018]图3:L-木糖标准样品的液相色谱图[0019]图4:2-酮基-L-古龙酸的液相色谱图[0020]图5:优化条件下的转化进程图具体实施方式[0021]实施例1:[0022]1制备丙酮酸脱羧酶[0023]根据Genebank中酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因序列设计引物,如下:[0024]上游引物:CATGCCATGGATTCAATTACTTTGGGTAAATATTTGTTCG[0025]下游引物:CCGCTCGAGTTGCTTAGCGTTGGTAGCAGCAGTC[0026]将丙酮酸脱羧酶的PCR产物插入到质粒pET-22b后,构建重组表达质粒pET-22b-pdc〇[0027]取O.Olg重组表达质粒pET-Mb-pdc转化大肠杆菌BLMDE3感受态细胞后,在600此的LB培养基中培养lh,取lOOixL菌液涂布于含有氨苄青霉素的固体LB平板,37°C培养10h,从而获得可以高效表达丙酮酸脱羧酶的基因工程菌。[0028]将构建好的工程菌接种于含有氨苄青霉素的TB培养基中,37°C下培养至菌体0D_达到0•6时,加诱导剂IPTG至终浓度为0•5mmolL,30°C下继续培养13h,离心收集菌体细胞,用磷酸缓冲液重悬,用超声破碎仪对细胞进行超声破碎,10000X离心20min,上清即为丙酮酸脱羧酶酶液,经测定,酶液的酶活为56.8UmL。(蛋白电泳图如图2[0029]2反应体系包含2mL步骤⑴制备的丙酮酸脱羧酶,卜10mM氯化镁,0-2mM焦磷酸硫胺素和300mM的2-酮基-L-古龙酸溶解于50mM的pH5.8的柠檬酸缓冲液中,将反应体系放置于50°C条件下反应15h。[0030]⑶反应结束后,离心去除不溶物,并将上清过0•22mm滤膜,所得的反应液采用高效液相色谱法进行检测,木糖含量的分析使用AminexHPX-87H色谱柱,色谱条件:柱温:40°C;流动相:5mMLH2S〇4;进样量:1〇此;检测器:RID;流速:0.5mLmin。(色谱图如图3、4、5。结果显不5mM氯化儀,ImM焦磷酸硫胺素时,2-酮基-L-古龙酸的转化率最高,值为45.3%,即生成了20.4gLL-木糖。[0031]实施例2[0032]与实施例1基本相同,不同之处在于缓冲液为MES缓冲液,pH7.5,5mM氯化镁,1視焦磷酸硫胺素和300mM2-酮基-L-古龙酸,转化率与实施例1相比,提高了16.9%,即生成了28.0gLL-木糖。[0033]实施例3[0034]与实施例1基本相同,不同之处在于反应温度为45°C,5mM氯化镁、lmM焦磷酸硫胺素、30〇11^2-酮基-1^古龙酸,转化率与实施例1相比,提高了24.5%,即生成了31.48几匕-木糖。[0035]实施例4[0036]实施例1基本相同,不同之处在于,缓冲液为ffiS缓冲液,pH7•5,5mM氯化镁,lmM焦磷酸硫胺素和3〇〇mM2_酮基-L-古龙酸,在45°C下进行转化反应,结果显示,转化率与实施例1相比,提高了49•6%,总转化率为94•9%,即生成了42.7gLL-木糖。[0037]虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

权利要求:1.一种酶法催化反应制备L-木糖的方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤1:将2-酮基-L-古龙酸溶于缓冲液中;步骤2:向缓冲液中加入丙酮酸脱羧酶、氯化镁以及焦磷酸硫胺素得到催化反应体系;步骤3:将催化反应体系放在一定温度环境下进行反应。2.根据权利要求1所述的一种酶法催化反应制备L-木糖的方法,其特征在于,步骤1中使用的原料2-酮基-L-古龙酸浓度为100-600mM。3.根据权利要求1所述的一种酶法催化反应制备L-木糖的方法,其特征在于,步骤2缓冲液浓度为10-100mM、pH为5-9。4.根据权利要求1所述的一种酶法催化反应制备L-木糖的方法,其特征在于,步骤2中丙酮酸脱羧酶的酶用量为40〜48UmL。5.根据权利要求1所述的一种酶法催化反应制备L-木糖的方法,其特征在于,步骤2催化反应体系中氯化镁浓度1〜10mM,焦磷酸硫胺素的浓度为〇〜2碰。6.根据权利要求1所述的一种酶法催化反应制备L-木糖的方法,其特征在于,步骤3在40-60°C条件下进行催化反应。八’7.根据权利要求1或2所述的一种酶法催化反应制备L-木糖的方法,其特征在于,步骤丄中使用的原料2-酮基-L-古龙酸浓度为300mM。’八’8.根据权利要求1〜7任一所述的一种酶法催化反应制备L-木糖的方法,其特征在于,步骤2缓冲液为PH7.5的50mM的MES缓冲液。’9.根据权利要求1或5所述的一种酶法催化反应制备L-木糖的方法,其特征在于,氯化镁浓度5mM,焦磷酸硫胺素的浓度为ImM。'’

百度查询: 上海凌凯医药科技有限公司 一种L-木糖的酶法制备方法

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息,力求客观、公正,但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解,仅供参考使用,不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。