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【发明授权】一种肿瘤突变肽MHC亲和力预测方法及其应用_四川康德赛医疗科技有限公司_201811448569.9 

申请/专利权人:四川康德赛医疗科技有限公司

申请日:2018-11-30

公开(公告)日:2020-07-03

公开(公告)号:CN109682978B

主分类号:C12Q1/6886(20180101)

分类号:C12Q1/6886(20180101)

优先权:["20171130 CN 2017112429327"]

专利状态码:有效-授权

法律状态:2020.07.03#授权;2019.05.21#实质审查的生效;2019.04.26#公开

摘要:本发明提出了一种肿瘤突变肽MHC亲和力的预测方法,包括如下步骤:一肿瘤特异性突变序列的获取;二对突变肽MHC亲和力预测,以所述突变序列翻译成预定长度的氨基酸FASTA序列,获得测试肽;对所述测试肽分别进行与MHCI分子、MHCII分子的亲和力评估,按照确定的等级标准筛选突变肽;三对步骤二中筛选出的具有高亲和力所述突变肽,进行蛋白酶体切割预测,筛选出能够被蛋白酶体有效切割的所述突变肽;四实验验证实验合成步骤三验证突变肽与患者特有MHC的亲和力。本发明还提出了一种基于肿瘤突变肽MHC亲和力的预测方法在筛选肿瘤新生抗原及制备个性化肿瘤疫苗中的用途。

主权项:1.一种肿瘤突变肽MHC亲和力预测方法,包括如下步骤:一肿瘤特异性突变序列的获取对肿瘤组织及正常组织分别抽取DNA进行外显子深度测序,采用GMS分析,获得突变序列;二对突变肽MHC亲和力预测以所述突变序列翻译成19个氨基酸的FASTA序列,替换氨基酸每侧9个氨基酸,获得测试肽;对所述测试肽分别进行与MHCI分子、MHCII分子的亲和力评估,按照确定的等级标准筛选突变肽;其中,所述亲和力评估是分别利用NetMHCpan预测与MHCI类分子结合的所述测试肽链,NetMHCIIpan预测与MHCII类分子结合的所述测试肽链;其中,所述等级标准包括:1包含预测的结合表位的新开放阅读框novelopenreadingframes,neoORFs;2由于锚定残基突变导致小于150nM的高亲和力的体细胞核苷酸突变;3由于非锚定残基其他位置的突变导致小于150nM的高亲和力的体细单核苷酸突变;4没有预测结合表位的新开放阅读框;5较低于2和3亲和力的新开放阅读框;在进行所述等级标准筛选后,在每个排名组中,首先,突变肽MHC亲和力强,WT序列肽MHC亲和力弱优先;其次,原癌基因突变优先;再次,以突变肽亲和力的不同进行排序;最后,基于亲和力相同的情况下,按照突变的等位基因频率用作进一步排序;三蛋白酶体切割预测对步骤二中筛选出的具有高亲和力所述突变肽,进行蛋白酶体切割预测,筛选出能够被蛋白酶体有效切割的所述突变肽;四实验验证实验合成步骤三筛选出的所述突变肽,与已知高亲和力结合MHC的肽进行MHC竞争结合实验,验证突变肽与患者特有MHC的亲和力。

全文数据:一种肿瘤突变肽MHC亲和力预测方法及其应用技术领域本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种MHC亲和力预测方法、用途及基于亲和力预测的个性化肿瘤疫苗制备方法。背景技术随着NGS测序技术的发展,筛选肿瘤特异性抗原实现了技术上的突破。2013年,Rosenberg团队率先利用外显子技术,在肿瘤细胞系上发现新生抗原neoantigens,并验证了其免疫反应。通过使用NGS技术和构建算法模型,外显子测序和转录组测序能准确表征肿瘤细胞的DNA和RNA,找出可能引起免疫细胞识别的肿瘤突变,生物信息学工具的发展则提高了肿瘤新生抗原的筛选能力,基因组大数据和计算机算法加速了肿瘤表位预测以及MHC主要组织相容性复合体亲和力预测,推动了癌症个性化免疫治疗personalvaccineagainstcancer的发展。鉴于癌症预后与免疫反应成正相关,因而特定的免疫细胞被作为免疫治疗的潜在靶标。免疫系统中最有效且最主要的抗原呈递细胞是树突状细胞dendriticcell,DC,因此这类细胞也成为个性化癌症免疫治疗策略之一。SébastienAnguille等利用含有WT1RNA自体树突状细胞免疫AML患者,II期临床试验结果显示可以预防或延缓化疗后43%的AML患者的复发,改善的总体生存期BloodClinicalTrialsandObservations,Aug.23,2017。癌症个性化免疫治疗另一个新的热点利用高通量测序识别肿瘤特异性的突变蛋白。基因组测序的最新进展表明,在癌症起始和进展的过程中,存在数以万计的不同的体细胞突变。大多数突变过客突变不赋予肿瘤生长优势,但会导致肿瘤基因组的不稳定。只有较少数量的癌症突变驱动突变干扰正常细胞调节并有助于癌症生长和对靶向治疗产生抗性。迄今为止,已经鉴定出约140个可以驱动肿瘤发生的基因。然而,驱动突变和过客突变都可能改变氨基酸编码序列,统称为非同义突变,形成肿瘤表达的突变蛋白,这些突变蛋白不被正常细胞表达。这些异常蛋白质序列在胞内被蛋白酶体加工成短肽,然后再被主要组织相容性复合物MHC,在人类中也称为人类白细胞抗原HLA结合,呈递到细胞表面上,从而作为外来抗原被T细胞识别。2017年7月,来自美国波士顿Dana-Farber癌症中心NeonTherapeutics公司支持的临床项目和德国美因茨大学的两个研究团队BiopharmaceuticalNewTechnologies,BioNTech公司支持的临床项目最近展示了高通量测序在肿瘤“个性化疫苗”在临床上取得的重大突破,并分别在《Nature》上发表了题为"Animmunogenicpersonalneoantigenvaccineforpatientswithmelanoma"Nature22991,July5,2017和"PersonalizedRNAmutanomevaccinesmobilizepoly-specifictherapeuticimmunityagainstcancer"Nature23003,July5,2017的成果文章。两个临床项目都是首先对患者肿瘤组织样本进行测序,并分别使用独特算法预测哪些突变最有可能引起免疫反应,并基于预测结果,分别开发出了以多肽片段和RNA为基础的疫苗,在晚期黑色素瘤3期或4期的中晚期复发高危人群身上进行临床实验。在来自DanaFarbar研究所的Wu博士带领的团队中,研究人员为每位患者量身定制了含有13-20种不同新生抗原的多肽疫苗。常规临床数据显示该类晚期肿瘤的复发率高达50%,而结果显示6位患者中,4位患者在接受疫苗两年后没有出现复发迹象。另外2名患者出现了复发迹象,但是在接受了PD-1抗体药物治疗后获得了完全缓解。类似结果在另一组研究中也被发现。由UgurSahin教授率领的美因茨大学团队为每位患者研发了含有10种不同肿瘤的新生抗原的两个多聚表位RNA疫苗。13位受试者中,8位在接受疫苗后一年内没有出现复发迹象,其他5名患者在接受疫苗时肿瘤已经出现扩散,其中2名在接受疫苗后肿瘤缩小,另外1名患者在接受PD-1抗体药物后得到完全缓解。该两项研究证实了在癌症治疗中利用高通量测序预测的个性化肿瘤新生抗原允许患者免疫系统更加高效精准的识别癌症抗原,这为开发癌症个性化免疫治疗方案提供了极其关键的参考。癌症个性化免疫治疗法和CAR-T在技术原理上有相识之处:首先筛查个性化的癌症特异性抗原,然后通过基因工程在体外放大肿瘤特异性抗原,从而激活T淋巴细胞,产生主动免疫。但癌症个性化免疫治疗法比CAR-T的技术流程更简洁,因此临床应用前景更好。一般而言,肿瘤新生抗原的预测主要分为两个步骤:首先,要鉴定出肿瘤细胞特有的非同义体细胞突变,这些突变是新生抗原的可能来源。然后,要基于非同义体细胞突变筛选出可被T细胞识别的新生抗原,筛选标准主要依据该新生抗原的表达、加工处理、被HLA呈递到肿瘤细胞表面以及被T细胞识别。肿瘤新生抗原的预测过程实际上是多组学结合、多算法融合的生物信息学过程。基于成对样本的全外显子组测序的结果,可以准确、全面地鉴定出肿瘤特异非同义体细胞突变,高深度的RNA-seq测序,筛选出表达的体细胞突变。最后,结合鉴定出的患者特异的HLA,通过各种算法预测患者特定HLA与体细胞突变相应新生抗原之间的亲和性,采用陪审团策略筛选出与HLA分子亲和性强的新生抗原,这些预测得到的新生抗原将会给患者进行靶向肿瘤特异的T细胞诱导或改造的靶点。对于个性化肿瘤疫苗技术的突破,关键的一步是采用合适的算法,能够根据肿瘤样本的测序结果,对新生抗原表达,加工递呈以及被MHC和TCR识别进行预测。肿瘤细胞的体细胞突变是随机的,相同病理类型肿瘤的不同患者之间出现相同新抗原的几率低于1%,不可能预制新抗原。所以每一个肿瘤患者接受治疗前,都必须检测肿瘤突变,并分析和预测可能作为治疗靶点的新生抗原。这也是为什么肿瘤新生抗原的研究在上个世纪前半叶就已经开启,但受限于检测和分析技术,临床应用非常缓慢。目前在对新生抗原的预测上虽然取得一定的突破,但是,准确预测新抗原依旧是构建个性化肿瘤疫苗的最主要挑战,其核心是算法,每个实验室都有一套自己的算法和流程,标准不统一,而且由于分析复杂度的问题,业界认为目前的算法准确性预计丁平一种肿瘤突变肽MHC亲和力预测方法及其应用2019CN201711242932.72017-11-309PatentInversion3.3110PRT人工序列(artificialsequence1GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly1510212PRT人工序列artificialsequence)2GlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGly1510310PRT人工序列(artificialsequence)3GlyGlySerLeuGlyGlyGlyGlyGlyGly1510426PRT人工序列(artificialsequence)4MetArgValThrAlaProArgThrLeuIleLeuLeuLeuSerGlyAla151015LeuAlaLeuThrGluThrTrpAlaGlySer2025555PRT人工序列(artificialsequence)5IleValGlyIleValAlaGlyLeuAlaValLeuAlaValValValIle151015GlyAlaValValAlaThrValMetCysArgArgLysSerSerGlyGly202530LysGlyGlySerTyrSerGlnAlaAlaSerSerAspSerAlaGlnGly354045SerAspValSerLeuThrAla5055618DNA人工序列(artificialsequence)6ccaccatgccaagagaag18718DNA人工序列(artificialsequence)7ttaaggtgaataaggtgg18821DNA人工序列(artificialsequence)8gcatgatcgaaacatacaacc21921DNA人工序列(artificialsequence)9gtattatgaagactcccagcg21

权利要求:1.一种肿瘤突变肽MHC亲和力预测方法,包括如下步骤:一肿瘤特异性突变序列的获取对肿瘤组织及正常组织分别抽取DNA进行外显子深度测序,采用GMS分析,获得突变序列;二对突变肽MHC亲和力预测以所述突变序列翻译成预定长度的氨基酸FASTA序列,获得测试肽;对所述测试肽分别进行与MHCI分子、MHCII分子的亲和力评估,按照确定的等级标准筛选突变肽;三蛋白酶体切割预测对步骤二中筛选出的具有高亲和力所述突变肽,进行蛋白酶体切割预测,筛选出能够被蛋白酶体有效切割的所述突变肽;四实验验证实验合成步骤三筛选出的所述突变肽,与已知高亲和力结合MHC的肽进行MHC竞争结合实验,验证突变肽与患者特有MHC的亲和力。2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述GMS分析相关突变包括如下步骤:1构建一个正常对照和两个肿瘤样品的180-280bp文库;2AglientSureSelect4HumanAllExonV6捕获文库,并使用picard-tools去除PCR扩增所形成的重复;3IlluminaHiSeq4000平台上生成外显子序列数据,FastQ数据质控;4BWA对外显子读数比对,联合多重设置过滤假阳性。3.如权利要求2所述的方法,其特征在于:所述联合多重设置过滤假阳性包括如下步骤:1Localrealignment将由indel导致错配的区域进行重新比对,降低indel附近的比对错误率;2unidifiedGenotyper中的stand_call_conf:在变异检测过程中,用于区分低质量变异位点和高质量变异位点的阈值;3VarScanSomatic过滤假阳性。4.如权利要求1-3任一所述的方法,其特征在于:所述步骤二中,还包括通过PCR-rSSO对肿瘤患者的HLAI类和II类分子类型进行测定,并通过PCR-SSP进行进一步验证。5.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述FASTA序列是由9-21个氨基酸构成的氨基酸序列,优选的是替换氨基酸每侧4-10个氨基酸,更优选的是替换氨基酸每侧的9个氨基酸。6.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述亲和力评估是分别利用NetMHCpan预测与MHCI类分子结合的所述测试肽链,NetMHCIIpan预测与MHCII类分子结合的所述测试肽链。7.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述等级标准包括如下五个等级:1包含预测的结合表位的新开放阅读框novelopenreadingframes,neoORFs;2由于锚定残基突变导致小于150nM的高亲和力的体细胞核苷酸突变;3由于非锚定残基其他位置的突变导致小于150nM的高亲和力的体细单核苷酸突变;4没有预测结合表位的新开放阅读框;5低与2和3亲和力的新开放阅读框。8.如权利要求7所述的方法,其特征在于:在进行所述等级标准筛选后,在每个排名组中,首先,突变肽MHC亲和力强,WT序列肽MHC亲和力弱优先;其次,原癌基因突变优先;再次,以突变肽亲和力的不同进行排序;最后,基于亲和力相同的情况下,按照突变的等位基因频率用作进一步排序。9.如权利要求1-8任一所述的方法,其特征在于:所述蛋白酶体切割预测是采用NetChopC-term3.0预测能被蛋白酶体C-末端切割位点的肽。10.如权利要求9所述的方法,其特征在于:采用NetChopC-term3.0预测能被蛋白酶体C-末端切割位点的肽的预测阈值是0.5,以区分肽C末端切割位点和肽表位内的切割位点。11.一种如权利要求1-10任一所述的预测方法在筛选肿瘤新生抗原及制备个性化肿瘤疫苗中的用途。

百度查询: 四川康德赛医疗科技有限公司 一种肿瘤突变肽MHC亲和力预测方法及其应用

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