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【发明授权】一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法_南京工业大学;南京同凯兆业生物技术有限责任公司_201910548086.4 

申请/专利权人:南京工业大学;南京同凯兆业生物技术有限责任公司

申请日:2019-06-24

公开(公告)日:2020-07-03

公开(公告)号:CN110218713B

主分类号:C12N9/22(20060101)

分类号:C12N9/22(20060101);C12R1/80(20060101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2020.07.03#授权;2019.10.08#实质审查的生效;2019.09.10#公开

摘要:本发明涉及生物技术领域,具体公开一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法。本发明通过在使用包含植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质的发酵培养基,对桔青霉进行半连续发酵,制备获得含有核酸酶P1的发酵液。该本发明方法单批发酵时间由56h缩短至20h,酶活由2500UmL提高至7100‑7500UmL。本发明所用的产酶促进剂添加量少,成本低,操作简单,效果明显。

主权项:1.一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其特征在于,使用包含植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质的发酵培养基,利用桔青霉进行半连续发酵,制备获得含有核酸酶P1的发酵液;其中,所述的桔青霉为CGMCCNo.2014;其中,所述的植酸类化合物为植酸钙镁和植酸锌的两种组合物;其中,所述的表面活性剂为吐温80和司盘80的两种组合物;其中,所述的核酸类物质为RNA;其中,发酵培养基中表面活性剂总浓度为1gL;植酸类化合物的总浓度为0.3gL;核酸类物质总浓度为0.5gL。

全文数据:一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法技术领域本发明涉及微生物发酵领域,具体涉及一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法。背景技术5'-核苷酸已广泛应用于食品、生化工业以及制药工业。在食品行业中,己经由最初的食品助鲜剂,扩展为具有提高生物体免疫功能的功能性食品添加剂,可以添加在面包、饼干等食品中,尤其在婴幼儿食品中的使用效果非常明显,能够有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力,减少腹泻的发生;在医药领域,5'-核苷酸不但能够作为药物使用,而且还是许多抗病毒抗肿瘤药物的生产原料;此外,核苷酸制剂还可以作为动植物生长调节剂,有着明显的增产、增重功效。核苷酸生产主要采取三种方法:化学合成法、微生物发酵法及酶解法。酶解法由于降解RNA可以一次得到四种核苷酸的混合物,且酶反应收率较高,国内外工业化生产核苷酸均采用此法。在酶解法制备核苷酸中所需的酶是核酸酶Pl,它是一种能够水解RNA获得四种5'-核苷酸的磷酸二酯酶,其酶解产物杂质少后续分离工艺简单,国外一般采用该方法进行核苷酸的生产。桔青霉属于不对称青霉组,绒状青霉亚组,桔青霉系,是核酸酶P1的重要生产菌种。国内外生产核酸酶P1主要通过桔青霉液体深层发酵,现有方法方法耗时较长酶活较低。如何高效的生产核酸酶P1,降低生产成本,已成为核苷酸生产的首要任务。发明内容本发明要解决的技术问题是针对现有技术存在的不足,提供一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法。为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其使用包含植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质的发酵培养基,利用桔青霉进行半连续发酵,制备获得含有核酸酶P1的发酵液。其中,所述的桔青霉为CGMCCNo.2014,该菌株记载在中国专利CN101067116A中。其中,所述的植酸类化合物为植酸钙镁、植酸钾和植酸锌中的任意一种或多种,优选植酸钙镁和植酸锌中的任意一种或两种组合,发酵培养基中植酸类化合物总浓度为0.001~1gL,优选0.1~0.8gL,更优选0.1~0.3gL。其中,所述的表面活性剂为吐温80、吐温60和司盘80的任意一种或多种,优选吐温80和司盘80中的任意一种或两种组合,发酵培养基中表面活性剂总浓度为0.001~5gL,优选0.1~3gL,更优选0.5~2gL。其中,所述的核酸类物质为RNA、DNA和核苷酸的任意一种或多种,优选RNA和核苷酸中的任意一种或两者组合,更优选RNA,发酵培养基中核酸类物质总浓度为0.001~5gL,优选0.1~3gL,更优选0.5~2gL。其中,所述的发酵培养基组分如下:葡萄糖0.5~50gL,蛋白胨0.05~5gL,磷酸二氢钾0.01~5gL,磷酸氢二钾0.01~5gL,硫酸镁0.01~5gL,氯化钙0.01~5gL,植酸类化合物0.001~1gL,表面活性剂0.001~5gL,核酸类物质0.001~5gL,溶剂为水,pH5~8;其中,所述的发酵培养基组分优选如下:葡萄糖20gL,蛋白胨2gL,磷酸二氢钾0.5gL,磷酸氢二钾0.5gL,硫酸镁0.2gL,氯化钙0.2gL,植酸钙镁0.2gL,植酸锌0.1gL,Tween-800.5gL,司盘-800.5gL,RNA0.5gL,pH6,溶剂为水。其中,所述的半连续发酵为桔青霉在发酵罐中发酵一段时间,开始周期性地放出部分含有产物的发酵液,然后再补加相同体积的新鲜培养基的发酵方法,具体方法:a,桔青酶在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7100-7500UmL左右;b,放出发酵液体积80%,发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子,向发酵罐补加相同体积无菌发酵培养基继续培养,发酵20个小时左右酶活稳定在7100-7500UmL左右;c,重复上述步骤b,如此循环补料5次,停止半连续发酵。其中,所述的含有核酸酶P1的发酵液的酶活为7100~7500UmL。本发明中,核酸酶P1酶活定义:将1.9mL的底物溶液含有浓度为1%左右的RNA;0.2MpH5.2的醋酸缓冲液以0.0005M的ZnSO4于70℃恒温水浴10min后,加入0.1mL经适当稀释的酶液,70℃保温15min后加入2.0mL核酸沉淀剂0.25%钼酸铵-2.5过氯酸,冰水浴20min后离心、取上清液用蒸馏水稀释一定倍数,测定其260nm处的吸光值为A260。以先加沉淀剂者作为对照,其它操作同前。在上述条件下,每分钟所生成的核苷酸量在260nm处的吸光值的差值为1.0时定义为1个酶活力单位。有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下技术优势:本发明通过添加植酸类化合物、表面活性剂类物质和核酸类物质进行发酵,单批发酵时间由56h缩短至20h,酶活由2500UmL提高至7100-7500UmL。该方法可以显著的缩短发酵工时提高发酵酶活,所用的产酶促进剂添加量少,成本低,操作简单,效果明显,减少生产成本。具体实施方式根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1:发酵培养基的配制:葡萄糖20gL,蛋白胨2gL,磷酸二氢钾0.5gL,磷酸氢二钾0.5gL,硫酸镁0.2gL,氯化钙0.2gL,植酸钙镁0.2gL,植酸锌0.1gL,Tween-800.5gL,司盘-800.5gL,RNA0.5gL,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。半连续发酵:10L搅拌罐中装入6L培养基,灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养,在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7300UmL左右,放出发酵液体积4.8L,发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子,配制4.8L发酵培养基打入发酵罐再次培养,20h后酶活稳定至7300UmL,再次放出4.8L发酵液,同样方法补入4.8L新鲜培养基。如此循环补料5次,酶活均在7300UmL左右,停止半连续发酵。对比例1:发酵培养基的配制:葡萄糖20gL,蛋白胨2gL,磷酸二氢钾0.5gL,磷酸氢二钾0.5gL,硫酸镁0.2gL,氯化钙0.2gL,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。半连续发酵同实施例1。用培养条件发酵,但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质,56h后酶活稳定至4100UmL,放出4.8L发酵液,同样方法补入4.8L新鲜培养基。发酵55h,酶活稳定在2650UmL,停止半连续发酵。实施例2:发酵培养基的配制:葡萄糖20gL,蛋白胨2gL,磷酸二氢钾0.5gL,磷酸氢二钾0.5gL,硫酸镁0.2gL,氯化钙0.2gL,植酸钙镁0.2gL,植酸锌0.1gL,Tween-800.5gL,司盘-800.5gL,RNA0.5gL,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。半连续发酵:100L搅拌罐中装入60L培养基,灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养,在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7400UmL左右,放出发酵液体积48L,发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子,配制48L发酵培养基打入发酵罐再次培养。20h后酶活稳定至7480UmL,再次放出48L发酵液,同样方法补入48L新鲜培养基。如此循环补料5次,酶活均在7340UmL左右,停止半连续发酵。对比例2:发酵培养基的配制:葡萄糖20gL,蛋白胨2gL,磷酸二氢钾0.5gL,磷酸氢二钾0.5gL,硫酸镁0.2gL,氯化钙0.2gL,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。半连续发酵同实施例2。用培养条件发酵,但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质,56h后酶活稳定至4170UmL,放出48L发酵液,同样方法补入48L新鲜培养基。发酵55h,酶活稳定在3730UmL,第2次补料发酵58h后酶活明显下降,只有2540UmL,停止半连续发酵。实施例3:发酵培养基的配制:葡萄糖20gL,蛋白胨2gL,磷酸二氢钾0.5gL,磷酸氢二钾0.5gL,硫酸镁0.2gL,氯化钙0.2gL,植酸钙镁0.2gL,植酸锌0.1gL,Tween-800.5gL,司盘-800.5gL,RNA0.5gL,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。半连续发酵:1000L搅拌罐中装入600L培养基,灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养,在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7500UmL左右,放出发酵液体积480L,发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子,配制480L发酵培养基打入发酵罐再次培养。20h后酶活稳定至7500UmL,再次放出480L发酵液,同样方法补入480L新鲜培养基。如此循环补料5次,酶活均在7500UmL左右,停止半连续发酵。对比例3:发酵培养基的配制:葡萄糖20gL,蛋白胨2gL,磷酸二氢钾0.5gL,磷酸氢二钾0.5gL,硫酸镁0.2gL,氯化钙0.2gL,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。半连续发酵同实施例3。用培养条件发酵,但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质,56h后酶活稳定至4220UmL,放出480L发酵液,同样方法补入480L新鲜培养基。发酵55h,酶活稳定在2690UmL,停止半连续发酵。实施例4:发酵培养基的配制:葡萄糖20gL,蛋白胨2gL,磷酸二氢钾0.5gL,磷酸氢二钾0.5gL,硫酸镁0.2gL,氯化钙0.2gL,植酸钙镁0.2gL,植酸锌0.1gL,Tween-800.5gL,司盘-800.5gL,RNA0.5gL,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。半连续发酵:2000L搅拌罐中装入1200L培养基,灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养,在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7480UmL左右,放出发酵液体积960L,发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子,配制960L发酵培养基打入发酵罐再次培养。20h后酶活稳定至7380UmL,再次放出960L发酵液,同样方法补入960L新鲜培养基。如此循环补料5次,酶活均在7410UmL左右,停止半连续发酵。对比例4:发酵培养基的配制:葡萄糖20gL,蛋白胨2gL,磷酸二氢钾0.5gL,磷酸氢二钾0.5gL,硫酸镁0.2gL,氯化钙0.2gL,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。半连续发酵同实施例4。用培养条件发酵,但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质,56h后酶活稳定至4190UmL,放出960L发酵液,同样方法补入960L新鲜培养基。发酵55h,酶活稳定在3830UmL,第4次补料发酵58h后酶活明显下降,只有2440UmL,停止半连续发酵。实施例5:发酵培养基的配制:葡萄糖20gL,蛋白胨2gL,磷酸二氢钾0.5gL,磷酸氢二钾0.5gL,硫酸镁0.2gL,氯化钙0.2gL,植酸钙镁0.2gL,植酸锌0.1gL,Tween-800.5gL,司盘-800.5gL,RNA0.5gL,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。半连续发酵:20T搅拌罐中装入12T培养基,灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养,在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7500UmL左右,放出发酵液体积9.6T,发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子,配制9.6T发酵培养基打入发酵罐再次培养。20h后酶活稳定至7500UmL,再次放出9.6T发酵液,同样方法补入9.6T新鲜培养基。如此循环补料5次,酶活均在7500UmL左右,停止半连续发酵。对比例5:发酵培养基的配制:葡萄糖20gL,蛋白胨2gL,磷酸二氢钾0.5gL,磷酸氢二钾0.5gL,硫酸镁0.2gL,氯化钙0.2gL,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。半连续发酵同实施例5。用培养条件发酵,但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质,56h后酶活稳定至4170UmL,放出9.6T发酵液,同样方法补入9.6T新鲜培养基。发酵55h,酶活稳定在3610UmL,第3次补料发酵58h后酶活明显下降,只有2640UmL,停止半连续发酵。实施例6:发酵培养基的配制:葡萄糖50gL,蛋白胨4gL,磷酸二氢钾4.8gL,磷酸氢二钾4.5gL,硫酸镁3.4gL,氯化钙3.8gL,植酸钙镁0.02gL,植酸钾0.07gL,Tween-800.05gL,司盘-800.005gL,RNA0.05gL,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。半连续发酵同实施例3。实施例7:发酵培养基的配制:葡萄糖10gL,蛋白胨0.96gL,磷酸二氢钾3.1gL,磷酸氢二钾3.6gL,硫酸镁0.9gL,氯化钙5.0gL,植酸钙镁0.52gL,植酸钾0.37gL,Tween-600.75gL,司盘-801.5gL,核苷酸3.5gL,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。半连续发酵同实施例1。实施例8:发酵培养基的配制:葡萄糖15gL,蛋白胨1.5gL,磷酸二氢钾4.1gL,磷酸氢二钾2.5gL,硫酸镁4gL,氯化钙2.1gL,植酸钙镁0.33gL,植酸锌0.26gL,Tween-600.75gL,司盘-800.5gL,DNA0.5gL,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。半连续发酵同实施例5。从实施例1~5与对比例1~5的结果可以看出,本发明通过添加植酸类化合物、表面活性剂类物质和核酸类物质进行发酵,单批发酵时间由56h缩短至20h,酶活由2500UmL提高至7100~7500UmL。且该方法可以显著的缩短发酵工时提高发酵酶活,所用的产酶促进剂添加量少,成本低,操作简单,效果明显,减少生产成本。

权利要求:1.一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其特征在于,使用包含植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质的发酵培养基,利用桔青霉进行半连续发酵,制备获得含有核酸酶P1的发酵液。2.根据权利要求1所述的提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其特征在于,所述的桔青霉为CGMCCNo.2014。3.根据权利要求1所述的提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其特征在于,所述的植酸类化合物为植酸钙镁、植酸钾和植酸锌中的任意一种或多种,发酵培养基中植酸类化合物总浓度为0.001~1gL。4.根据权利要求1所述的提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其特征在于,所述的表面活性剂为吐温80、吐温60和司盘80的任意一种或多种,发酵培养基中表面活性剂总浓度为0.001~5gL。5.根据权利要求1所述的提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其特征在于,所述的核酸类物质为RNA、DNA和核苷酸的任意一种或多种,发酵培养基中核酸类物质总浓度为0.001~5gL。6.根据权利要求1~5中任意一项所述的提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其特征在于,所述的发酵培养基的组分如下:葡萄糖0.5~50gL,蛋白胨0.05~5gL,磷酸二氢钾0.01~5gL,磷酸氢二钾0.01~5gL,硫酸镁0.01~5gL,氯化钙0.01~5gL,植酸类化合物0.001~1gL,表面活性剂0.001~5gL,核酸类物质0.001~5gL,溶剂为水,pH5~8。7.根据权利要求1所述的提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其特征在于,所述的半连续发酵,其发酵温度为30℃,单批发酵时间为20h。8.根据权利要求1所述的提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其特征在于,所述的含有核酸酶P1的发酵液的酶活为7100~7500UmL。

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