申请/专利权人：南京大学;南京诺源医疗器械有限公司

申请日：2017-03-07

公开（公告）日：2020-07-03

公开（公告）号：CN106860875B

主分类号：A61K47/69(20170101)

分类号：A61K47/69(20170101);A61K31/337(20060101);A61K47/59(20170101);A61P35/00(20060101);C08G81/00(20060101);C08G63/91(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.03#授权;2017.07.14#实质审查的生效;2017.06.20#公开

摘要：本发明涉及一种抗肿瘤的pH敏感和非pH敏感的葡聚糖‑聚乳酸‑聚乙二醇的纳米药微球的制备。所述方法以价廉易得的聚乙二醇为起始原料，与乳酸（D，L‑lactide）开环聚合形成聚乳酸‑聚乙二醇的聚合物mPEG‑PLA，再与丁二酸酐反应，生成带羧基的聚乳酸‑聚乙二醇的聚合物mPEG‑PLA‑COOH，然后与葡聚糖通过酯化反应得到葡聚糖‑聚乳酸‑聚乙二醇的载体Dextran‑PEG‑PLA，在此载体的基础上，上述聚合物分别与甲氧基丙烯、丙酸酐得到pH敏感Acetalated‑Dextran‑PEG‑PLAADP和非pH敏感的葡聚糖‑聚乳酸‑聚乙二醇纳米载体Propionic‑Dextran‑PEG‑PLAPDP，本专利纳米载体制备方法简单，原料廉价易得，制备过程操作简单，适合用做临床药物的载体。

主权项：1.一种pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇纳米微球载体，具有下述式结构： 其中n1、m1、X1。

全文数据：抗肿瘤的pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇纳米载药体系的制备方法技术领域[0001]本发明属于高分子材料的技术领域范畴，特别涉及到一种pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇的紫杉醇载药体系的设计与合成。背景技术[0002]纳米技术nanotechnology是20世纪80年代末崛起的新科技，是研究结构尺寸在Inm至IOOOnm范围内材料性质和应用的一种技术，适用于材料合成、生物和医药学等多个领域。目前，纳米载体已成为药学领域的重要研究热点。它能够解决药物溶解性问题，优化药物的药代动力学特征，延长血液半衰期112，扩大治疗窗。此外，纳米载体的被动enhancedpermeabilityandretention,，EPR效应和主动祀向作用，使它具有肿瘤特异性，能在肿瘤局部富集，减小了对正常组织的毒性，提高了生物利用度。最典型的例子是紫杉醇，它不溶于水，静脉给药时需要使用毒性溶剂Cremophor-EL蓖麻油和乙醇的混合物）增加溶解性，这种溶剂会引起严重的过敏和骨髓抑制等副作用。[0003]目前，纳米载体广泛的用于常规化疗药物运输的研究，如紫杉醇、顺铂、阿霉素、喜树碱等，部分有价值的成果已经进展到临床实验阶段。但是在超效化疗药物纳米载体的研究方面，由于药物来源困难非商业性），基本处于空白阶段。许多纳米载体的关键问题如载体的选择、纳米粒子构建、抗肿瘤活性和毒性的系统评估、药物代谢特征等都是未知数。[0004]肿瘤部位的pH低于正常组织，大多数实体瘤的pH值小于6.5，低于周围正常组织pH为7.4。肿瘤的细胞内pH和正常组织相近，但细胞外pH比正常组织低，这就引起肿瘤与正常组织的跨膜pH梯度不同。同时，细胞中的细胞质、核内体、溶酶体、内质网、高尔基体、线粒体及细胞核都保持各自独特的pH值，pH值从4.5溶酶体到8.0线粒体不等。纳米载体可以通过掺入或者结合上pH敏感性物质以达到将大分子高效传递到相关细胞及在细胞内准确定位的效果。[0005]pH敏感型纳米载体的物理性质例如膨胀或退胀、粒子的分散和聚集都对环境条件的变化产生响应。这些物理性质的改变也会使纳米载体与细胞之间的相互作用发生改变，从而导致药物在肿瘤部位不同速度的释放。但是，目前pH敏感型纳米载体关于控释机制、聚合物的选择、毒理学等方面仍然不成熟。[0006]本专利拟合成新型具有生物相容性、生物降解性和pH与非pH敏感型的纳米粒子作为载体用于肿瘤靶向的药物运输。该纳米微球载体以葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇为基本结构，分别接上甲氧基丙烯、丙酸酐使其拥有PH敏感性和非pH敏感性，这些结构能使载体拥有良好的生物相容性和生物降解性。同时，本专利还以紫杉醇为例，从细胞、动物水平，阐述纳米紫杉醇的抗肿瘤活性及毒性。发明内容[0007]本发明的是为克服现有技术不足而提供的一种抗肿瘤的pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇纳米微球载体的制备方法。[0008]本发明的技术方案为：[0009]一种pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇纳米微球载体，具有下述式结构：[0010][0011]其中nl、ml、Xl[0012]所述的pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇纳米载体，包含步骤：[0013]1以式I所示的聚乙二醇和聚乳酸为原料，在辛酸亚锡的作用下，聚合形成式II所示的聚乳酸-聚乙二醇聚合物[0014][0015]其中nl、ml[0016]2所述式II的聚乳酸-聚乙二醇聚合物与丁二酸酐的作用形成式III所示的羧酸化的聚乳酸-聚乙二醇聚合物衍生物[0017][0018]其中nl、ml[0019]3所述式III的羧酸化的聚乳酸-聚乙二醇聚合物衍生物与葡聚糖、N，N’_羰基二咪唑CDI的作用下形成式IV所示的的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇聚合物[0020][0021]其中nl、ml、Xl[0022]4所述式IV的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇聚合物分别与甲氧基丙烯、丙酸酐得到pH敏感V和非pH敏感VI的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇纳米载体[0023][0024]5所述式pH敏感V和非pH敏感VI的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇纳米载体负载不同比例的紫杉醇。[0025]所述的方法，其特征在于步骤1中的开环反应温度在90-140°C，反应时间8-12h。[0026]所述的方法，其特征在于步骤2中的丁二酸酐与所述式II的聚乳酸-聚乙二醇聚合物的摩尔比为0.8-1.5。[0027]所述的方法，其特征在于步骤3中的聚乳酸-聚乙二醇聚合物衍生物与葡聚糖聚合物的摩尔比为0.8-1.3。聚乳酸-聚乙二醇聚合物衍生物与N，N’_羰基二咪唑CDI摩尔比为0.8-1.3。[0028]所述的方法，其特征在于步骤4中的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇聚合物与甲氧基丙烯的反应时间为2-4h，葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇聚合物与丙酸酐反应时间为3-24h。[0029]所述的方法，其特征在于步骤5中的重量配比组分为3-20%的紫杉醇、80-97%的载药材料混合组成，特征步骤包括:配药、溶药、稀释、纯化、过滤、干燥。[0030]有益效果：[0031]1、本发明的是为克服现有技术不足而提供的一种抗肿瘤的pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇纳米微球载体的制备方法，该纳米载体制备方法简单，毒性小、较高的载药率，原料廉价易得，制备过程操作简单，适合用做临床药物的载体。[0032]2、采用高分子化学合成方法，以价廉易得的聚乙二醇为起始原料，与乳酸开环聚、甲氧基丙烯、丙酸酐通过一系列化学反应制备PH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇纳米载体，通过对紫杉醇进行负载，验证了负载紫杉醇的纳米载体对治疗肿瘤效果的作用。附图说明[0033]1.图1是本发明提供的一种抗肿瘤的pH敏感和非pH敏感载药微球的制备方法流程示意图。[0034]2.图2是纳米TEM图，其中图2a是本发明的pH敏感型纳米载药微球的纳米TEM图；图2b是本发明的非pH敏感型纳米载药微球的纳米TEM图。[0035]3.图3是红外图，其中图3a为本发明的pH敏感型纳米载药微球的红外图；图3b为本发明的非PH敏感型纳米载药微球的红外图。[0036]4.图4是本发明的负载紫杉醇的非pH敏感载药微球、本发明的负载紫杉醇的pH敏感载药微球、紫杉醇在不同浓度紫杉醇条件下的细胞抑制率图。[0037]5.图5是本发明的pH敏感和非pH敏感载药微球的抑瘤的效果评价图，其中图5a为高剂量组；图5b为低剂量组。具体实施方式[0038]一种抗肿瘤的pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇的紫杉醇载药微球的制备方法，其具体步骤如下：[0039]实施例1:[0040]⑴mPEG-PLA的合成[0041]mPEG2.4g，0.48mmol，D，L_lactide2g，13.8mmol和SnOct20.2%，ww，140°：油浴的条件下搅拌反应8h。将反应液倾倒入冰水浴中，向其中加入二氯甲烷来提取反应液中的聚合物，分离有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液用乙醚与甲醇的混合液进行沉降，过滤收集滤渣，干燥得白色固体。[0042]⑵mPEG-PLA-COOH的合成[0043]mPEG-PLA500mg溶解在无水DMSO中，向上述反应液中依次加入丁二酸酐500mg，4_二甲氨基吡啶DMAPIOmg，三乙胺0.2mL，混合液室温下搅拌5小时后，反应液用分子量3.5K的透析膜在去离子水中透析3天，透析液在-50°C条件下冻干，得到白色粉末状产物。[0044]3Dextran-mPEG-PLA合成[0045]将葡聚糖Mr=6K，200mg，mPEG-PLA-C00H200mg，N，N’-羰基二咪唑（CDI5mg，物质的量比⑶I:COOH=1.2:1溶解在无水DMSO中。将混合液置于60°C搅拌过夜。进一步提纯，将反应混合液用分子量3.5K的透析膜在去离子水中进行透析，透析3天。透析后的溶液在-50°C条件下冻干，最终得到白色粉末状产物。[0046]⑷Acetalated-Dextran-PEG-PLAADP纳米粒子的制备[0047]Dextran-PEG-PLA50mg，甲氧基丙稀（ImL，卩比啶-苯磺酸（5mg加入到无水DMSO中，混合均匀。反应液在室温下搅拌反应3小时。多余的甲氧基丙烯减压旋转蒸除去，进一步提纯，将反应混合液用分子量3.5K的透析膜在PBSpH7.4中进行透析，透析3天。透析液在-50°C条件下冻干，得到白色粉末状产物。[0048]5丙酸酐改性的Dextran-PEG-PLAPDP纳米粒子的制备[0049]Dextran-PEG-PLA50mg，丙酸酐（0.5mL，N,N-二甲基吡啶（DMAPIOmg，三乙胺0.ImL加入到无水DMSO中，混合均匀。反应液在室温下搅拌反应5小时。进一步提纯，将反应混合液用分子量3.5K的透析膜在去离子水中进行透析，透析3天。透析液在-50°C条件下冻干，得到白色粉末状产物。[0050]6ADPP-taxol和]^PP-taxolNanoparticIes的合成[0051]ADPP-taxolNanoparticles的制备：将ADPIOmg和taxol的（2mg溶解在DMSO2mL中。将反应混合液用分子量3.5K的透析膜在PBSpH=7.4中进行透析，透析24小时，透析液在_50°C条件下冻干，PDPP-taxol纳米颗粒的制备反应同上。图3红外图中1585.30nm是紫杉醇的苯环特征峰，证明了药物已经被包裹。[0052]实施例2:[0053]⑴mPEG-PLA的合成[0054]mPEG5g，lmmol，D，L-lactide4g，27.6mmol^PSn0ct20.2%，ww，90°C^iS的条件下搅拌反应12h。将反应液倾倒入冰水浴中，向其中加入三氯甲烷来提取反应液中的聚合物，分离有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液用乙醚与甲醇的混合液进行沉降，过滤收集滤渣，干燥得白色固体。[0055]⑵mPEG-PLA-COOH的合成[0056]mPEG-PLA500mg溶解在无水DMSO中，向上述反应液中依次加入丁二酸酐500mg，4_二甲氨基吡啶DMAPIOmg，三乙胺0.2mL，混合液室温下搅拌5小时后，反应液用分子量3.5K的透析膜在去离子水中透析3天，透析液在-50°C条件下冻干，得到白色粉末状产物。[0057]3Dextran-mPEG-PLA合成[0058]将葡聚糖Mr=6K，250mg，mPEG-PLA-C00H200mg，N，N’-羰基二咪唑（CDI5mg，物质的量比⑶I:COOH=1.2:1溶解在无水DMSO中。将混合液置于60°C搅拌过夜。进一步提纯，将反应混合液用分子量3.5K的透析膜在去离子水中进行透析，透析3天。透析后的溶液在-50°C条件下冻干，最终得到白色粉末状产物。[0059]⑷Acetalated-Dextran-PEG-PLAADP纳米粒子的制备[0060]Dextran-PEG-PLA50mg，甲氧基丙稀（0·5mL，卩比啶-苯磺酸（5mg加入到无水DMSO中，混合均匀。反应液在室温下搅拌反应5小时。多余的甲氧基丙烯减压旋转蒸除去，进一步提纯，将反应混合液用分子量3.5K的透析膜在PBSpH7.4中进行透析，透析3天。透析液在-50°C条件下冻干，得到白色粉末状产物。[0061]5丙酸酐改性的Dextran-PEG-PLAPDP纳米粒子的制备[0062]Dextran-PEG-PLA50mg，丙酸酐（ImL，N,N-二甲基吡啶（DMAPIOmg，三乙胺0.ImL加入到无水DMSO中，混合均匀。反应液在室温下搅拌反应24小时。进一步提纯，将反应混合液用分子量3.5K的透析膜在去离子水中进行透析，透析3天。透析液在-50°C条件下冻干，得到白色粉末状产物。[0063]6ADPP-taxol和]^PP-taxolNanoparticIes的合成[0064]ADPP-taxolNanoparticles的制备：将ADPIOmg和taxol的（Img溶解在DMSO2mL中。将反应混合液用分子量3.5K的透析膜在PBSpH=7.4中进行透析，透析24小时，透析液在-50°C条件下冻干，PDPP-taxolNanoparticIes的制备反应同上。TEM结果见图2a和图2b。[0065]体外细胞毒性分析[0066]通过进行细胞毒性分析来测试freetaxol，ADPP-taxol以及PDPP-taxolnanoparticIes对癌细胞生长的影响。在进行药物处理的前一晚，将生长在含有10%FBS的培养液中的KB-3-1细胞按照一个孔洞5000个细胞的密度种到96孔板中。taxol，ADPP-taxol以及FOPP-taxoInanoparticles的样品溶液用培养基稀释使taxo1得浓度在3·75-60ngmL范围内。结果见图4,与单独使用紫杉醇相比，用pH敏感和非pH敏感载药微球负载紫杉醇后，药物对细胞的杀伤性明显降低，体外细胞毒性减小。[0067]体内抗肿瘤疗效分析[0068]实验用动物被饲养在正常状态下，保持12小时昼夜交替，并给予充足的水和食物。动物实验年龄四到六周，雄性所有的过程都经由埃默里大学动物保护与使用委员会批准。通过向小鼠的右背注射浓度为每1〇〇μ1含有5000KB-3-1细胞的悬液使小鼠携带KB-3-1。将完成注射的小鼠随机分成八个实验组，每个实验组五只小鼠。四组高剂量组：空白对照组、了31〇1组、40??-七31〇1即8组、？0??-七31〇1即8组，每组注射剂量按七31〇1的注射量为20mgKg计算。四组低剂量组：空白对照组、Taxol组、ADPP-taxolNPs组、PDPP-taxolNPs组，每组注射剂量按taxol的注射量为10mgKg计算。在开始处理前，小鼠身上的肿瘤需要生长到100-200mm3。对小鼠进行处理，先以每周两次的频率处理五次，后以每周一次的频率处理四次。肿瘤的大小在每次注射前测量，通过用游标卡尺测量长和宽，并根据公式:体积=长*宽*宽2进行计算。结果见图5a和图5b，无论是高剂量组还是低剂量组，pH敏感和非pH敏感的纳米载药微球负载紫杉醇后，抑瘤效果与单独的紫杉醇相比相差不多甚至有比较明显的优势。

权利要求：1.一种pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇纳米微球载体，具有下述式结构：其中nl、ml、Xl。2.—种权利要求1所述的pH敏感和非pH敏感的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇纳米载体的制备方法，其特征在于按如下步骤实现：1以式I所示的聚乙二醇和聚乳酸为原料，在辛酸亚锡的作用下，聚合形成式II所示的聚乳酸-聚乙二醇聚合物其中nl、ml2所述式II的聚乳酸-聚乙二醇聚合物与丁二酸酐的作用形成式III所示的羧酸化的聚乳酸-聚乙二醇聚合物衍生物其中nl、ml3所述式III的羧酸化的聚乳酸-聚乙二醇聚合物衍生物与葡聚糖、N，N羰基二咪唑的作用下形成式IV所示的的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇聚合物其中nl、ml、Xl4所述式IV的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇聚合物分别与甲氧基丙烯、丙酸酐得到pH敏感V和非pH敏感VI的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇纳米载体5所述式pH敏感V和非pH敏感VI的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇纳米载体负载紫杉醇。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1中的开环反应温度在90-140°C，反应时间8-12h。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤2中的丁二酸酐与所述式II的聚乳酸-聚乙二醇聚合物的摩尔比为0.8-1.5。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤3中的聚乳酸-聚乙二醇聚合物衍生物与葡聚糖聚合物的摩尔比为0.8-1.3;聚乳酸-聚乙二醇聚合物衍生物与N，N’_羰基二咪唑摩尔比为0.8-1.3。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤4中的葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇聚合物与甲氧基丙烯的反应时间为2_4h，葡聚糖-聚乳酸-聚乙二醇聚合物与丙酸酐反应时间为3-24h〇7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤5中的重量配比组分为3-20%的紫杉醇、80-97%的载药材料混合组成。

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