申请/专利权人：华南农业大学

申请日：2017-08-21

公开（公告）日：2020-07-03

公开（公告）号：CN107624768B

主分类号：A01N43/90(20060101)

分类号：A01N43/90(20060101);C07D487/04(20060101);C12P17/18(20060101);A01P1/00(20060101);C12R1/19(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.03#授权;2018.02.23#实质审查的生效;2018.01.26#公开

摘要：本发明公开了环二肽cyclo‑S‑pro‑R‑Ile在防治青枯病中的应用。本发明发明人首次发现了环二肽cyclo‑S‑pro‑R‑Ile对青枯菌有很强的抑制作用，为新型的青枯病生防制剂的制备提供了新的选择。本发明提供的环二肽cyclo‑S‑pro‑R‑Ile的制备方法，是以大肠埃希氏菌EscherichiacoliGZ‑34为菌种，经过培养、分离和提纯得到；该方法步骤简洁，操作简单，这有利于进行工业化生产。

主权项：1.环二肽cyclo-S-pro-R-Ile在防治青枯病中的应用。

全文数据：环二肽eyeIο-S-pro-⑻HIe在防治青枯病中的应用技术领域[0001]本发明属于植物病害防治领域，特别涉及环二肽cyclo-S-pro-⑻-Ile在防治青枯病中的应用。背景技术[0002]植物细菌性青枯病是由青枯劳尔氏菌Ralstoniasolanacearum引起的一种维管束毁灭性土传细菌性病害，在亚热带、热带和温带地区发生普遍系统侵染的毁灭性土传病害，俗称“植物瘟病”。青枯劳尔氏菌寄主广泛，可侵染54个科的450余种植物。目前，细菌性青枯病的防治是世界公认的一大难题，它广泛分布于世界各地，在我国南方省市发生严重，尤其在浙江，近年来不但茄科、瓜类受害，大面积发生的桑青枯病更对蚕业生产造成严重损失。[0003]青枯菌有很多小种，根据青枯菌的寄主范围分为5个生理小种，小种1主要危害多数茄科植物，包括番茄、马铃薯、茄子和烟草等，还危害其他科植物;小种2能侵染香蕉、海里康Heliconais和大蕉等植物;小种3主要危害马铃薯，也可弱侵染烟草和番茄;小种4侵染姜以及弱侵染马铃薯等其他植物。另有研究人员将从我国南方桑树上分离到的青枯病菌株命名为小种5。侵染马铃薯的青枯病菌主要是小种1和小种3。[0004]目前，青枯病的防治方法主要有加强田间管理、培育抗病品种、使用化学药剂和施用生防菌剂等，但实践证明，田间管理难以有效控制青枯病发生，抗性材料的选育耗时长，而化学防治污染环境、破坏生态平衡，且化学药剂的长期使用易使病原菌产生抗药性。[0005]因此，有必要寻找一种更为高效的防治青枯病的化合物。发明内容[0006]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供环二肽cyclo-S-pro-⑻-Ile在防治青枯病中的应用。[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:环二肽cyclo-S-pro-⑻-Ile在防治青枯病中的应用，其中，环二肽cyclo-S-pro-⑻-Ile的结构式如式I所示：[0009]所述的环二肽cyclo-S-pro-⑻-Ile通过如下步骤制备得到：[0010]1将大肠埃希氏菌GZ-34进行发酵，得到的发酵液进行固液分离;在得到的上清液中加入乙酸乙酯进行萃取，收集上层有机相，经旋转蒸发后溶解在甲醇中，用孔径为0.22μπι的滤膜去除不溶物，得到含活性成分的有机溶液I;[0011]2用葡聚糖凝胶LH-20装柱，将含活性成分的有机溶液I上样，通过葡聚糖凝胶LH-20吸附活性成分;再用甲醇洗脱，每收集250ml甲醇洗脱液为一个组分;收集第4个组分，经过旋转蒸发后溶解在甲醇中，过0.22μπι的滤膜去除不溶物。[0012]3对步骤（2去除不溶物的馏分4进行半制备高效液相层析；其中，溶剂A相为0.1%νν甲酸，溶剂为色谱纯水；溶剂B相为色谱纯乙腈;洗脱程序为：30%B，0-30min;30%B到100%B，30-30.lmin;100%B，30.1-42min;100%B到30%B，42-42.lmin;30%B，42.1-5〇!11；[11;流速为3.011^111；[]1—1，收集第26-29111；[11的洗脱液，冻干，得到环二肽07310-3-pro-R-Ile0[0013]步骤（I中所述的大肠埃希氏菌GZ-34,保藏编号为CCTCCN0:M2016353,于2016年6月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，已在中国专利申请CN105969707A公开。[0014]步骤⑴中所述的发酵所用的发酵培养基优选为LB培养基。[0015]所述的LB培养基的组成如下：蛋白胨10gL、酵母膏5gL、氯化钠10gL，pH7.0〜7.2。[0016]步骤⑴中所述的发酵的条件优选为于35〜37°C，200〜250rpm发酵;更优选为于37°C、220rpm发酵。[0017]步骤（1中所述的发酵的程度优选为达到大肠杆菌的对数生长期或稳定期;更优选为OD6〇q=3。[0018]步骤⑴中所述的固液分离的方式优选为离心。[0019]所述的离心的条件优选为8000〜12000Xg离心10〜20min;更优选为IOOOOg离心15min〇[0020]步骤⑴中所述的乙酸乙酯的用量优选为与所述的上清液等体积。[0021]步骤⑵中所述的用葡聚糖凝胶LH-20装柱中的柱子优选为柱高1.0m，柱直径5cm。[0022]步骤（3中所述的半制备高效液相层析中的柱子优选为C18半制备柱Phenomenex，Gemini_NX5μπιC18110A，250X10.0mm〇[0023]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：[0024]1本发明发明人首次发现了环二肽cycl〇-S-pro-⑻-Ile对青枯菌有很强的抑制作用，为新型的青枯病生防制剂的制备提供了新的选择。[0025]2本发明提供的环二肽cyclo-⑸-pro-⑻-Ile的制备方法，是以大肠埃希氏菌EscherichiacoliGZ-34为菌种，经过培养、分离和提纯得到;该方法步骤简洁，操作简单，这有利于进行工业化生产。附图说明[0026]图1是环二肽〇5^1〇-3-口1"〇-〇?-116的质谱图。[0027]图2是环二肽cyclo_S-pro-⑻-Ile的核磁图。[0028]图3是环二肽cyclo_S-pro-⑻-Ile对青枯菌的抑制效果图。[0029]图4是环二肽cycl〇-S-pro-⑻-Ile对青枯菌的MIC的检测结果图。具体实施方式[0030]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。[0031]实施例1[0032]1、菌种和培养基[0033]大肠埃希氏菌EscherichiacoliGZ-34,其保藏编号为CCTCCΝ0:Μ2016353,于2016年6月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，已在中国专利申请CN105969707A公开。[0034]青枯菌GMI1000,购买自ATCC。[0035]LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂15g，H20定容至1000ml，pH7.0-7.2。121°：灭菌20分钟。[0036]LB液体培养基:与LB固体培养基的区别仅在于:不含琼脂。[0037]TTC固体培养基的配制:胰蛋白胨IOg，酸水解酪蛋白Ig，葡萄糖5g，琼脂15g，H2O定容至1000ml，pH6.8-7.2;121°C灭菌20分钟，得到基本培养基。TTC2，3，5-氯化三苯基四氮唑）用蒸馏水配成〇.1%wV溶液并用细菌过滤器过滤灭菌，在基本培养基倒平板前冷却至约45°C，每IOOmL基本培养基加入0.5mL0.1%wvTTC溶液。[0038]TTC液体培养基:不含琼脂。[0039]2、实验步骤[0040]2.1培养基配制[0041]配制如步骤1的培养基。[0042]2.2大肠埃希氏菌62-34活化[0043]取-80°C保存的大肠埃希氏菌GZ-34在LB平板上划线活化，37°C培养箱过夜培养。[0044]2.3大肠埃希氏菌62-34发酵[0045]LB固体培养基活化的大肠埃希氏菌GZ-34菌株，挑取单菌落接种于IOmLLB液体培养基中，37°C、220rmin振荡培养12h获得种子液，按1%vv的接种量接入IOOOmLLB液体培养基，37°C、220rmin振荡培养，至OD6qq达到3.0，10000Xg离心15min去除菌体，收集上清液。[0046]2.4环二肽的提取[0047]向上清液中加入等体积的乙酸乙酯，混合均匀后倒入分液漏斗中静置分层，放出下层水相，从上面倒出上层有机相，旋转蒸发仪蒸干乙酸乙酯，加入ImL甲醇溶解，过0.22μπι的有机滤膜去除不溶物，得到粗提物，4°C保存。[0048]2.5环二肽的初步分离[0049]称取葡聚糖凝胶LH-20于干净三角瓶中，加入色谱甲醇浸泡24h后装柱，柱高I.Om，柱直径5cm，用3倍于葡聚糖凝胶的色谱甲醇冲洗干净后上样（S卩2.4得到的粗提物），然后再用色谱甲醇洗脱，每250mL洗脱液收集到一个干净的三角瓶中为一个馏分，旋转蒸发仪蒸干甲醇后，再溶于〇.5mL色谱甲醇中，过0.22μπι的有机滤膜去除不溶物，然后分别检测每部分的抑菌活性。[0050]2.6抑菌活性检测[0051]抑菌活性的检测采用琼脂扩散法，取-80°C保存的青枯菌GMI1000在TTC平板上划线活化，28°C培养3天，挑取单菌落接种在IOmLTTC液体培养基中，28°C220rmin振荡培养一天，再将青枯菌菌液加入到融化的TTC固体培养基中（冷却到45°C左右倒成平板，凝固后用无菌打孔器直径8mm在含菌平板中央打孔，每板1孔，取出菌块丢弃。用移液器在每个孔中加入1〇μ1待测溶液，吹干后28°C倒置培养2天，重复3次，观察抑菌圈，发现第4个馏分有活性。[0052]2.7环二肽的二次分离[0053]对有抑菌活性的馏分4进行半制备高效液相层析反相半制备柱反相C18半制备柱Phenomenex，Gemini_NX5μηιC18110A，250X10.0mm;溶剂A相为0.1%vv甲酸，溶剂为色谱纯水；溶剂B相为色谱纯乙腈；洗脱程序为：30%B，0-30min;30%B到100%8,30_30.111^11;100%8,30.1-4211^11;100%8到30%8,42-42.111^11;30%8,42.1-5011^11;流速为3.OmLmin—1，收集26-29min得到化合物。[0054]2.8环二肽的ESI-MS和NMR检测[0055]ESI-MS检测:将化合物溶解于适量色谱甲醇中并过滤，ESI-MS分析超高效液相四极杆串联飞行时间质谱联用仪）。[0056]NMR检测:化合物的溶剂挥发干，溶解于氘代甲醇中，再转移到干净的核磁管中，进行NMR测定。测定类型包括：1HNMR，13CNMR，D印tl35。[0057]2.9结果[0058]通过ESI-MS见图1和NMR检测（见图2，确定化合物为环二肽cyclo_S-pro-⑻-IIe，相对分子质量226，其结构如式I所示。[0059]实施例2:环二肽对青枯菌的抑菌活性测定[0060]1、培养基[0061]TTC培养基:同实施例1。[0062]TTC液体培养基：同实施例1。[0063]2、实验步骤[0064]2.1培养基配制[0065]同实例1。[0066]2.2菌种活化[0067]同实例1。[0068]2.3活性检测[0069]挑取青枯菌单菌落接种在IOmLTTC液体培养基中，28°C220rmin振荡培养一天，再将0.IMl的青枯菌菌液加入到IOmL融化的TTC固体培养基中（冷却到45°C左右）倒成平板，凝固后用无菌打孔器直径8mm在含菌平板中央打孔，每板1孔，取出菌块丢弃。用移液器在每个孔中加入1〇μ1环二肽溶液，吹干后28°C倒置培养2天，重复3次，观察抑菌圈。[0070]2.4环二肽对青枯菌的MIC[0071]1青枯菌在TTC平板上活化后，挑取单菌落接种于IOmL液体TTC培养基，28°C220rpm过夜；[0072]2培养好的菌液用新鲜的液体TTC培养基稀释到0D600=0.1，取96孔板，每孔加IOOyL稀释菌液；[0073]3加入抑菌物质（即环二肽），浓度分别为226、113、56.5、28.25、14.12ygmL，S外加菌液和TTC培养基两个做对照，28°C200rpm培养一天。[0074]⑷酶标仪检测OD6qq的值。[0075]3、结果[0076]环二肽cyclo-S-pro-⑻-IIe对青枯菌具有很强抑菌效果，见图3;其对青枯菌的MIC为226ygml，见图4。[0077]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.环二肽cyclo-S-pro-⑻-IIe在防治青枯病中的应用。2.根据权利要求1所述环二肽cyclo-S-pro-⑻-IIe在防治青枯病中的应用，其特征在于:所述的环二肽cyclo-S-pro-⑻-IIe通过如下步骤制备得到：1将大肠埃希氏菌GZ-34进行发酵，得到的发酵液进行固液分离;在得到的上清液中加入乙酸乙酯进行萃取，收集上层有机相，经旋转蒸发后溶解在甲醇中，用孔径为〇.22μπι的滤膜去除不溶物，得到含活性成分的有机溶液I;2用葡聚糖凝胶LH-20装柱，将含活性成分的有机溶液I上样，通过葡聚糖凝胶LH-20吸附活性成分;再用甲醇洗脱，每收集250ml甲醇洗脱液为一个组分;收集第4个组分，经过旋转蒸发后溶解在甲醇中，过〇.22μπι的滤膜去除不溶物；3对步骤（2去除不溶物的馏分4进行半制备高效液相层析；其中，溶剂A相为0.1%νν甲酸，溶剂为色谱纯水;溶剂B相为色谱纯乙腈;洗脱程序为:30%B，0-30min;30%B到100%B，30-30·lmin;100%B，30.l-42min;100%B到30%B，42-42.Imin;30%Β，42·1-50min;流速为3·OmLmin—1，收集第26-29min的洗脱液，冻干，得到环二肽cyclo-S-pro-⑻-Ile〇3.根据权利要求2所述环二肽cyclo-S-pro-⑻-IIe在防治青枯病中的应用，其特征在于:步骤1中所述的发酵所用的发酵培养基为LB培养基。4.根据权利要求2所述环二肽cyclo-S-pro-⑻-IIe在防治青枯病中的应用，其特征在于:步骤1中所述的发酵的条件为于35〜37°C，200〜250rpm发酵。5.根据权利要求2所述环二肽cyclo-S-pro-⑻-IIe在防治青枯病中的应用，其特征在于:步骤1中所述的发酵的程度为达到大肠埃希氏菌的对数生长期或稳定期。6.根据权利要求2所述环二肽cyclo-S-pro-⑻-IIe在防治青枯病中的应用，其特征在于:步骤⑴中所述的固液分离的方式为离心。7.根据权利要求6所述环二肽cyclo-S-pro-⑻-IIe在防治青枯病中的应用，其特征在于:所述的离心的条件为8000〜12000Xg离心10〜20min。8.根据权利要求2所述环二肽cyclo-S-pro-⑻-IIe在防治青枯病中的应用，其特征在于:步骤1中所述的乙酸乙酯的用量为与所述的上清液等体积。9.根据权利要求2所述环二肽cyclo-S-pro-⑻-IIe在防治青枯病中的应用，其特征在于:步骤2中所述的用葡聚糖凝胶LH-20装柱中的柱子的柱高为1.0m，柱直径为5cm。10.根据权利要求2所述环二肽cyclo-S-pro-⑻-Ile在防治青枯病中的应用，其特征在于：步骤（3中所述的半制备高效液相层析中的柱子为C18半制备柱Phenomenex,Gemini-NX5μπιC18110A,250X10.0mm。

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