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【发明授权】一株耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌及其应用_南京工业大学_201910191640.8 

申请/专利权人:南京工业大学

申请日:2019-03-13

公开(公告)日:2020-07-03

公开(公告)号:CN109868242B

主分类号:C12N1/20(20060101)

分类号:C12N1/20(20060101);C12P7/26(20060101);A01G22/40(20180101);C12R1/125(20060101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2020.07.03#授权;2019.07.05#实质审查的生效;2019.06.11#公开

摘要:本发明公开了一株耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌,其分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis,菌株号为NRCB002,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCCNO.17213,保藏日期为2019年1月18日。本发明还公开了上述枯草芽孢杆菌的应用。本发明的枯草芽孢杆菌株NRCB002通过纯培养试验、实验室平板试验和温室盆栽实验证明其具有耐盐特性,能够产生乙偶姻,并且能促进苜蓿的生长,具有良好的应用前景。

主权项:1.一株耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌,其分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis,菌株号为NRCB002,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCCNO.17213,保藏日期为2019年1月18日。

全文数据:一株耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌及其应用技术领域本发明属于微生物技术领域,涉及枯草芽孢杆菌及其在促进作物生长中的应用。背景技术目前在农业生产内部,由于化肥等农业投入品长期不合理使用,不仅造成农田土壤酸化、板结、次生盐渍化等问题日趋严重,还破坏了土壤根际微生物群落结构,使许多有益微生物从优势菌群变为次要菌群。紫花苜蓿MedicagosativaL.是世界上分布最广的多年生豆科牧草,素有“牧草之王”之称。我国苜蓿的种植面积约为377.5万hm2,但是苜蓿产量低,每年都要从国外进口苜蓿以满足国内畜牧业的需求。苜蓿具有中强度的耐盐性,但随着土地盐碱化程度的不断加剧,紫花苜蓿的种植范围逐步减小。因此提高苜蓿的耐盐能力不仅是改良利用盐碱地的重要方法,也是扩大苜蓿种植范围提高苜蓿产量的根本途径。植物根际促生细菌PGPR在植物根部有很强的定殖能力,同时能促进作物的生长,如提高种子的发芽率、促进根系生长和增加作物的产量。现在已经从水稻、小麦、玉米、花生等多种作物的根际分离得到了大量的PRPG菌株,并被广泛用于微生物肥料和微生物菌剂领域。其中芽孢杆菌因其良好的环境适应性,应用最为广泛。微生物肥料和微生物菌剂在施用时一般要求施用在根部或蘸根处理,原因是一般的芽孢杆菌的促生机制为:1、提高作物根际养分的可利用性,如溶磷、解钾等;2、分泌植物激素,如吲哚乙酸IAA、赤霉素GAs等;3、很少有人提及菌株产生挥发性化合物能促进作物生长,而挥发性物质可以在不接触根系的情况下发挥作用。如果能获得具备一般芽孢杆菌促生特征并且产生一定量挥发性物质的菌株,将有效扩大微生物肥料和微生物菌剂施用时距离根系的范围,具有高效、安全、施用方便等优点。专利CN102827793A公开了一株产ACC脱氨酶的苜蓿假单胞菌的使用方法,其特征在于产ACC脱氨酶的苜蓿假单胞菌能够提高苜蓿的抗逆性并促进苜蓿生长,但其专利中所述土壤含盐量仅0.037%。专利CN201611205485.3公开了一种苜蓿专用生物肥的使用方法,其特征值在于其苜蓿专用肥包含了枯草芽孢杆菌等菌株,其虽然提高了苜蓿的产量,但是却没有提及促进盐碱地苜蓿的生长。专利CN105296381A公开了一株枯草芽孢杆菌CYY-25及其应用的方法,其特征在于能促进盐碱地苜蓿的生长,但其并没有说明盐碱土的含盐量,并且其操作比较繁琐,其在苜蓿生长过程中,需每7d浇一次CYY-25菌悬液。枯草芽孢杆菌虽然能促进盐碱地和非盐碱地苜蓿的生长,但是,其应用的盐碱土含盐量比较低且操作流程繁琐,很难满足中度和重度盐碱地土壤的要求。发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一株耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌,该菌株具有优异的在高盐和弱碱条件下促进苜蓿等植物生长的能力,促进苜蓿在中度和重度盐碱地土壤的生长。本发明还要解决的技术问题是提供上述枯草芽孢杆菌的应用。为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:一株耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌,其分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis,菌株号为NRCB002,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCCNO.17213,保藏日期为2019年1月18日,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮政编码100101。其中,所述的耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌NRCB002是发明人于2018年8月从江苏省宜兴市大铺镇水稻根际土中分离得到,该菌落呈圆形,不透明,罕见半透明,淡黄色白色和凸起,边缘不规则,易挑起。对菌株的16SrDNA序列进行测定,通过系统发育分析和生理生化鉴定,确定为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis,并命名为NRCB002。该菌能够生成吲哚乙酸、溶解无机磷、溶解不溶性钾,这与大多数芽孢杆菌相同。此外,该菌还可以生成挥发性气体乙偶姻,在菌体不接触作物根系的时候发挥作用,有效扩大微生物肥料和微生物菌剂施用时距离根系的范围,具有高效、安全、施用方便的优点。本发明的枯草芽孢杆菌株NRCB002通过纯培养试验、实验室平板试验和温室盆栽实验证明其具有耐盐特性,能够产生乙偶姻,并且能促进苜蓿的生长,具有良好的应用前景。本发明的其他特征将在后面的具体实施部分予以详细说明。其中,所述的枯草芽孢杆菌是嗜盐型枯草芽孢杆菌,在液体培养基中,其耐盐度最高可达100gL。其中,所述的枯草芽孢杆菌,在土壤中,其耐盐度最高可达20gkg。上述耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌在发酵生产乙偶姻中的作用也在本发明保护范围之内。上述耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌在提高植物耐盐迫能力中的应用也在本发明保护范围之内。其中,所述的植物优选为苜蓿。具体应用方法是,将枯草芽孢杆菌NRCB002应用于盐碱土壤,所述的盐碱土壤含可溶性盐浓度最高达20gkg。上述耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌在促进植物生长中的应用也在本发明保护范围之内。其中,所述的植物优选为苜蓿。本发明所述的耐盐性能,所述的盐是指KCl、K2SO4、K2CO3、KNO3、NaCl、Na2SO4、Na2CO3等无机盐中的一种或几种。有益效果:本发明提供的枯草芽孢杆菌NRCB002能显著提高苜蓿等作物的耐盐能力,在可溶性盐含量为0gkg,15gkg,20gkg时枯草芽孢杆菌NRCB002均能显著地促进苜蓿的生长,其中在可溶性盐含量为20gkg时,促生效果最好,接种该菌株NCBR002的苜蓿的干重较空白增加102%。使用本发明提供的微生物菌剂可以扩大苜蓿的种植范围,提高作物的种植面积。附图说明图1为枯草芽孢杆菌NRCB002在固氮培养基上的菌落形态。图2为枯草芽孢杆菌NRCB002的耐盐性实验结果。图3为枯草芽孢杆菌NRCB002乙偶姻色谱检测结果,其中,A是1gL乙偶姻标样,B为130的48h发酵液。其中此发酵液NaCl含量为60gL。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其进行限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的普通技术人员来说,依然可以对前述实施例进行修改,或者对其中部分进行替换;而这些修改或替换,并不使相应的技术方案脱离本发明所要求保护的技术方案的范围。实施例1菌株NRCB002的分离及筛选取10g水稻根际土放入装有90mL盐溶液的锥形瓶中,在28℃、200rmin条件下,振荡1h,制成10-1的土壤悬液,取10-1的土壤悬液10mL,放入装有90mL盐溶液的瓶中,配成10-2的稀释液,以此类推。分别配成10-3、10-4、10-5的稀释液。然后用移液器分别移取10-3、10-4、10-5的稀释液100μL涂布于固氮固体培养基上,每个梯度三个重复。在28℃恒温生化培养箱中培养2~4d,每天观察其生长情况,出现单菌落后,在超净工作台中用接种环挑取比较大的菌落接种到BMS培养基上进行纯化,纯化5~6代后,用30%的甘油保藏在-80℃中,待用。实施例2菌株NRCB002的鉴定菌株外观形态见图1。16SrDNA鉴定通过16SrDNA序列分析,经NCBI中BLAST比对后与枯草芽孢杆菌同源较高,相似度为100%,在根据其外形以及生理生化特性,初步鉴定菌株NRCB002为枯草芽孢杆菌。生理生化性质见表1:淀粉水解、V-P反应、明胶液化、葡萄糖产酸、溶菌酶、甲基红试验均为阳性。表1菌株NRCB002生理生化性质菌株编号淀粉水解V-P反应甲基红试验明胶液化葡萄糖产酸溶菌酶NRCB002++++++实施例3枯草芽孢杆菌NRCB002的耐盐性分析将分离纯化的耐盐菌株枯草芽孢杆菌NRCB002菌悬液,分别转接相同量到不同盐浓度的液体培养基中,25~30℃,150~200rmin摇床培养,观察生长情况,每隔1d时间测其菌浓度OD600,以确定细菌耐盐程度,菌株的耐盐性能见图2。从图中可以看出随着NaCl浓度的增加,菌株NRCB002OD600逐渐增大,这可以推断菌株NRCB002为嗜盐菌。实施例4枯草芽孢杆菌NRCB002产挥发性气体乙偶姻的测定发酵种子培养基:采用LB培养基酵母粉5gL,蛋白胨10gL,NaCl10gL,培养条件为旋转式摇床28℃,200rmin。发酵培养基:酵母膏5gL,玉米浆4gL,尿素4gL,葡萄糖100gL,NaCl10~100gL,在培养条件为28℃,200rmin摇床里面培养48h后,用气相色谱测定发酵液中乙偶姻含量。乙偶姻采用Agilent7890AGC分析,GC条件为:氢火焰检测器220℃,进样口温度210℃,载气N2,程序升温。菌株NRCB002产乙偶姻能力见表2。实施例5枯草芽孢杆菌NRCB002产吲哚乙酸IAA能力鉴定采用Salkowski比色法测定菌株NRCB002分泌IAA的能力。发酵培养基:酵母粉5gL,蛋白胨10gL,NaCl10g~100gL,色氨酸1gL。将活化好的菌株按1%的接种量接入发酵培养基中,在28℃,200rmin下培养2~3d,每株菌3个重复。发酵液在8000rmin离心5min,取上清液1mL于4mL离心管中,加入2mL比色液,摇匀,在室温黑暗条件下放置15~20min,在530nm处测定吸光值。用IAA标品配不同浓度的IAA溶液,与测样品相同方法处理并测定吸光值,绘制标准曲线。参考标准曲线确定IAA含量。枯草芽孢杆菌NRCB002产吲哚乙酸IAA的情况见表2。实施例6枯草芽孢杆菌NRCB002的溶磷活性分析利用钼锑抗比色法测定其溶磷能力。发酵培养基:KH2PO4,0.2gL;K2HPO4,0.8gL;MgSO4·7H2O,0.2gL;NaCl10g~100gLCaSO4·2H2O,0.1gL;Ca3PO42,5gL;FeCl3,微量;Na2Mo4·2H2O,微量;酵母提取物,0.5gL;甘露醇,20gL.将活化好的菌株NRCB002按1%的接种量将活化的菌株接入发酵培养基中,在28℃,200rmin下培养2~3d,每株菌3个重复。发酵液在8000rmin离心,取上清液5mL于50mL容量瓶中,加去离子水约30mL,加入二硝基苯酚指示剂2滴,用氢氧化钠和稀硫酸调溶液至微黄,然后加入钼锑抗显色剂5mL,摇匀,定溶,在700nm处比色。枯草芽孢杆菌NRCB002的溶磷活性见表2。实施例7枯草芽孢杆菌NRCB002的解钾能力测定发酵种子培养基:采用LB培养基酵母粉5gL,蛋白胨10gL,NaCl10gL,培养条件为旋转式摇床28℃,200rmin。发酵培养基:蔗糖50gL,MgSO4·7H2O0.5gL,CaCl20.1gL,FeCl30.005gL,NaCl10g~100gL,钾长石粉1.0gL,去离子水1.0L,pH值7.2~7.5,在培养条件为28℃,200rmin摇床培养3d后,用原子吸收光谱仪测定发酵液中速效钾的含量。枯草芽孢杆菌NRCB002的解钾能力见表2。从表中可以看出,在发酵液NaCl浓度为10gL时,菌株NRCB002IAA分泌量最高为70mgL;在发酵液NaCl浓度为60gL时,菌株NRCB002分泌乙偶姻能力最强达16gL;在发酵液NaCl浓度为40gL时,菌株NRCB002具有较好的溶磷量解钾能力,分别达到75mgL和7.8mgL。表2枯草芽孢杆菌NRCB002的促生特性实施例8由枯草芽孢杆菌NRCB002发酵产生的有机性挥发气体乙偶姻对苜蓿的促生作用将枯草芽孢杆菌NRCB002接种于LB液体养基中,在25~30℃,150~200rmin摇床下培养至对数中期OD600=1.0,4℃离心收集菌体,菌体用0.86%生理盐水重悬,待用。苜蓿种子表面消毒,过程如下:70%乙醇浸泡15s,2.5%次氯酸钠浸泡15min,再用无菌水冲洗7~8次,将苜蓿种子移到12MS培养基后,放入24℃光照培养箱中催芽2天。将发芽的苜蓿种子移到带有隔板的13*13cm培养皿的一室中,每皿移栽五株,培养基另一室加200μL无菌水悬浮的NRCB002的菌液OD600=1。培养基两边均为含0gL、15gL和20gLNaCl的12MS固体培养基,以200μL无菌水为对照。培养皿用封口膜封住,放置于24℃,16h光照、8h黑暗的光照培养箱中培养。培养7d后,测量苜蓿的株高、鲜重、干重。从表3可以看出由枯草芽孢杆菌NRCB002产生的有机性挥发气体能在NaCl含量为0gL,15gL和20gL时均能显著地促进苜蓿的生长,其中在NaCl含量为15gL时,促生效果最好,接种该菌剂的苜蓿的干重较空白增加18.1%。表3枯草芽孢杆菌NRCB002产生的有机性挥发气体对苜蓿促生实验数据实施例9供试土壤的理化性质依据鲁如坤主编的《土壤农业化学分析方法》进行测定,供试土壤初始理化性质见表4。表4供试土壤的理化性质实施例10枯草芽孢杆菌NRCB002在含可溶性盐土壤中对盆栽苜蓿的促生作用将枯草芽孢杆菌NRCB002接入LB培养基,在28℃、200rmin条件下,摇床培养,每隔2小时测OD600,当OD600值为1时,将菌液在8000rmin离心,收集已经活化的菌株。将收集菌体用0.86%生理盐水清洗,然后用等体积的无菌水重悬,并将其稀释100倍后制成菌悬液待用。将挑选大小一致,无损伤的苜蓿种子用清水冲洗后,放入装有待测菌悬液的培养皿内,浸泡2~3h后,将其移入装有NaCl浓度为13.7gkg,18.7gkg和0gkg的农田土花盆中其中装填的供试土壤为实施例9所述土壤每盆移入20颗苜蓿籽,每处理播种4盆,在自然光照条件下,生长14d时统计发芽率,生长30d测量株高、叶面积、鲜重,以不接种菌株NCBR002为空白对照。实验结果见表5。从表5可以看出在可溶性盐含量为1.3gkg,15gkg,20gkg时枯草芽孢杆菌NRCB002均能显著地促进苜蓿的生长,其中在可溶性盐含量为15gkg时,促生效果最好,接种该菌剂的苜蓿的干重较空白增加124%。表5枯草芽孢杆菌NRCB002对盆栽苜蓿促生实验数据序列表南京工业大学一株耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌及其应用1SIPOSequenceListing1.011393DNA枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis1tacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggc60ccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgc120agtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcg180cggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataagggg240catgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagag300tgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaaccca360acatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggg420gacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgc480ttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttc540agtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaagggg600cggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaat660cctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttc720gccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctc780ctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggcttt840cacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgct900tgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggt960accgtcaaggtaccgccctattcgaacggtacttgttcttccctaacaacagagctttac1020gatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcgga1080agattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccg1140atcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccgttacctcaccaactag1200ctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtttgaacca1260tgcggttcaaacaaccatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttaca1320ggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccat1380ctgtccgctcgac1393

权利要求:1.一株耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌,其分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis,菌株号为NRCB002,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCCNO.17213,保藏日期为2019年1月18日。2.根据权利要求1所述的耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述的枯草芽孢杆菌是嗜盐型枯草芽孢杆菌,在液体培养基中,其耐盐度最高可达100gL。3.根据权利要求1所述的耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述的枯草芽孢杆菌,在土壤中,其耐盐度最高可达20gkg。4.权利要求1所述的耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌在发酵生产乙偶姻中的应用。5.权利要求1所述的耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌在提高植物耐盐迫能力中的应用。6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的植物为苜蓿。7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,将枯草芽孢杆菌NRCB002应用于盐碱土壤,所述的盐碱土壤含可溶性盐浓度最高达20gkg。8.权利要求1所述的耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌在促进植物生长中的应用。9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的植物为苜蓿。

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