申请/专利权人：青岛啤酒股份有限公司

申请日：2018-04-13

公开（公告）日：2020-07-10

公开（公告）号：CN108342458B

主分类号：C12Q1/6851(20180101)

分类号：C12Q1/6851(20180101);C12Q1/6876(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.10#授权;2018.08.24#实质审查的生效;2018.07.31#公开

摘要：本发明提供了一种基于基因表达监控的麦芽浸出率评价方法，涉及食品检测领域。该方法包括总RNA的提取与纯化、逆转录反应制备cDNA模板、多重PCR反应、毛细管电泳得到基因电泳图谱、图谱数据分析得到麦芽水解相关基因的表达峰高H、利用麦芽水解相关基因的表达峰高H计算麦芽浸出率，针对麦芽水解相关基因LD，AMY1，AMY4，GLU，ASP，CYS，SERⅠ，SERⅢ，MET，TRX，PDI，SEP，WRKY和内控基因ACT。该方法能够基于淀粉、蛋白水解酶的基因表达监控，建立预测麦芽浸出率的方法，从而用于评价麦芽浸出率；与传统的测定方法相比，准确度高，效率高且方法简便。

主权项：1.基于基因表达监控的麦芽浸出率评价方法，其特征在于，包括总RNA的提取与纯化、逆转录反应制备cDNA模板、多重PCR反应、毛细管电泳得到基因电泳图谱、图谱数据分析得到麦芽水解相关基因的表达峰高H、利用麦芽水解相关基因的表达峰高H计算麦芽浸出率，针对麦芽水解相关基因LD，AMY1，AMY4，GLU，ASP，CYS，SERⅠ，SERⅢ，MET，TRX，PDI，SEP，WRKY和内控基因ACT；逆转录反应制备cDNA模板应用引物为SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16、SEQIDNO.18、SEQIDNO.20、SEQIDNO.22、SEQIDNO.24、SEQIDNO.26和SEQIDNO.28,合成cDNA第一链；以所述的cDNA第一链为模板进行多重PCR反应，多重PCR反应中应用引物为SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15、SEQIDNO.17、SEQIDNO.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23、SEQIDNO.25和SEQIDNO.27；其中，利用上述麦芽水解相关基因的表达峰高H计算麦芽浸出率的公式如下：麦芽浸出率=82.864+10*[0.233*HAMY1HACT-0.272*HTRXHACT-0.207*HSERⅠHACT+0.381*HMETHACT+0.195*HCYSHACT+0.061*HPDIHACT-0.182*HASPHACT+0.009*HSEPHACT-0.122*HWRKYHACT-0.970*HLDHACT-2.094*HAMY4HACT-0.088*HGLUHACT+0.097*HSERⅢHACT]。

全文数据：基于基因表达监控的麦芽浸出率评价方法技术领域[0001]本发明涉及食品检测领域，尤其涉及一种基于基因表达监控的麦芽浸出率评价方法。背景技术[0002]啤酒中的各种组分来源于麦芽、酒花、酵母。麦芽的质量好坏直接影响着啤酒的质量。麦芽为酵母发酵提供糖、氨基酸等营养物质，为啤酒泡沫提供蛋白、多糖等生物大分子骨架，同时增加啤酒醇厚柔滑的口感。麦芽对啤酒的生产、质量、成本、风味稳定起着举足轻重的作用。选择高品质的麦芽，成为啤酒生产企业的生产高质量啤酒的关键。[0003]评价麦芽质量的指标很多，其中浸出率是一个关键指标。浸出率是指从麦芽中浸出并溶解于水的干物质占麦芽干物质的百分比，浸出率高收得率就高。它包括了麦芽本身的可溶性物质和在糖化时经酶作用形成的可溶性物质，因此说浸出率反映了大麦在制麦芽过程中，麦芽溶解的程度和形成酶的数量，同时也反映了大麦经制麦成为干麦芽后，麦粒干物质的损失多少的特性。[0004]目前使用的浸出率测定方法是通过用标准协定糖化法测定生成麦汁的糖度、密度等指标，然后换算成浸出率。这种方法存在滞后性，无法在大麦萌发阶段提前做出判断。此外该方法操作繁琐、复杂，费时费力。如果能建立起一种更加快速的预测方法，从大麦萌发初期就能预测麦芽浸出率，就能为制麦工艺调整提供依据，快速指导生产。[0005]而向源头追溯，麦芽浸出率的差异则是由于制麦过程中淀粉、蛋白水解酶的差异造成。胚乳的溶解，首先是生成的蛋白酶作用于胚乳细胞壁间的蛋白质，接着葡聚糖酶，戊聚糖酶和半纤维素酶分解细胞壁使其形成多孔结构，随后淀粉酶和蛋白酶等进入胚乳细胞内，进行一系列分解反应，致使胚乳组织疏松，并且淀粉质外露而呈现粉状结构。从溶解过程可以看出，酶在制麦过程中发挥了十分重要的作用。这些水解酶的种类和活性直接决定着胚乳的溶解状况，进而决定了麦芽质量。而这些水解酶的活性则由制麦过程中相关基因的表达量高低决定。目前并没有基于这些水解酶基因的浸出率评价方法。发明内容[0006]本发明的目的在于提供一种基于基因表达监控的麦芽浸出率评价方法，基于淀粉、蛋白水解酶的基因表达监控，建立预测麦芽浸出率的方法，从而用于评价麦芽浸出率；与传统的测定方法相比，准确度高，效率高且方法简便。[0007]为了达到上述目的，本发明提供了一种基于基因表达监控的麦芽浸出率评价方法，包括总RNA的提取与纯化、逆转录反应制备CDNA模板、多重PCR反应、毛细管电泳得到基因电泳图谱、图谱数据分析得到麦芽水解相关基因的表达峰高H、利用麦芽水解相关基因的表达峰高H计算麦芽浸出率，[0008]针对麦芽水解相关基因LD，AMYI，AMY4，GLU，ASP，CYS，SERI，SERm，MET，TRX，PDI，SEP，WRKY和内控基因ACT;[0009]逆转录反应制备cDNA模板应用引物为SEQIDN0.2、SEQIDN0.4、SEQIDN0.6、SEQIDN0.8、SEQIDN0.10、SEQIDN0.12、SEQIDN0.14、SEQIDN0.16、SEQIDN0.18、SEQIDNO.20、SEQIDNO.22、SEQIDNO.24、SEQIDNO.26和SEQIDNO.28;[0010]多重PCR反应中应用引物SEQIDN0.1、SEQIDN0.3、SEQIDN0.5、SEQIDN0.7、SEQIDN0.9、SEQIDN0.11、SEQIDN0.13、SEQIDN0.15、SEQIDN0.17、SEQIDN0.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23、SEQIDNO.25和SEQIDNO.27;[0011]其中，利用上述麦芽水解相关基因的表达峰高H计算麦芽浸出率的公式如下：[0012]麦芽浸出率=82.864+10*[0.233相仏1^1!1仏0'-0.272*!10'1«!1仏0'-0·207*HSERIHACT+0·381*HMETHACT+0·195*HCYSHACT+0·061*HPDIHACT-0·182*HASPHACT+0·009*HSEPHACT-0·122*HWRKYHACT-0·970*HLDHACT-2·094*HAMY4HACT-0·088*H®LUHACT+0·097*HSERmHACT]。[0013]具体的麦芽浸出率评价方法步骤如下：[0014]1使用下述多重引物进行麦芽浸出率预测：[0015]筛选与大麦发芽过程蛋白、多糖水解相关的基因和内控基因，设计符合GeXP多重PCR反应特点的、且与大麦发芽过程蛋白、多糖水解相关的基因表达的特异性上下游引物，参见表1。[0016]表1麦芽浸出率相关基因的特异性上下游引物[0017][0018][0019]其中每条引物分别配制成ΙΟΟμΜ的储存液，等比例混合制备混合引物工作液。下游混合引物工作液为500ηΜ，上游混合引物工作液为200ηΜ;[0020]2总RNA提取与纯化:采用通用的RNA提取和纯化方法，从大麦的麦芽细胞中提取得到纯化的麦芽总RNA;[0021]3逆转录反应制备CDNA模板：以麦芽总RNA为模板合成CDNA第一链，使用BeckmanCoulter公司的GenomeLab™GeXP启动试剂盒，以上述步骤1中的多重引物的下游引物为特异性引物，反应体系为l〇yL，具体见表2。[0022]表2逆转录反应制备cDNA模板的反应体系[0023][0024]逆转录反应制备cDNA模板反应参数设置如下：[0025]48°C1分钟;42°C60分钟;95°C5分钟。[0026]4多重PCR:以上述合成的逆转录反应制备cDNA模板为模板，上述（I中的多重引物的上游引物为特异性引物，进行多重PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，采用BeckmanCoulte公司的DNA聚合酶以及GenomeLab™GeXP启动试剂盒进行，具体反应条件见表3。[0027]表3多重PCR的反应条件[0030]RT-PCR扩增参数设置如下：[0031]95°C10分钟，94°C30秒，56°C30秒，71°C1分钟；35个循环。[0032]5多重PCR产物毛细管电泳:取IyLPCR多重产物加到分装有39yL的95%去离子甲酰胺SLS和400bpMarker混合液的上样板的孔中，用移液枪混匀后覆盖一滴石錯油。另夕卜，在缓冲液板每孔中加入250yL的分离缓冲液。全部准备完后，上机进行毛细管电泳，得到毛细管电泳图谱。[0033]⑹分析毛细管电泳图谱，得到麦芽水解相关基因的表达峰高H。[0034]⑺利用麦芽水解相关基因的表达峰高H计算麦芽浸出率，公式如下：[0035]麦芽浸出率=82.864+10*[0.233相（八1^1!1八0'-0.272*!10'1«!1八0'-0·207*HSERIHACT+0·381*HMETHACT+0·195*HCYSHACT+0·061*HPDIHACT-0·182*HASPHACT+0·009*HSEPHACT-0·122*HWRKYHACT-0·970*HLDHACT-2·094*HAMY4HACT-0·088*H®LUHACT+0·097*HSERmHACT]。[0036]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：[0037]1采用本发明的评价方法能够快速、准确地评价浸出率。[0038]2本发明采用的GeXP多重基因表达定量分析技术与常规的基因表达定量分析技术荧光定量PCR相比具有更强的特异性和灵敏性、自动化程度高等特点，保证了结果的可靠性和可重复性。另外，由于GeXP多重基因表达定量分析技术可以同时检测多达30个基因的表达丰度，大大缩短了实验时间。[0039]3本发明能够提前对麦芽浸出率进行预判，相比传统获得麦芽后再进行浸出率检测的方式，把预测时间提前了3-4天，从而能够指导工厂进行工艺调整。附图说明[0040]图1为本发明实施例1所提供的毛细管电泳图谱；[0041]图2为本发明实施例2所提供的毛细管电泳图谱；[0042]图3为本发明实施例3所提供的毛细管电泳图谱。具体实施方式[0043]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0044]实施例1[0045]本发明实施例提供了一种基于基因表达监控的加拿大麦芽浸出率评价方法。[0046]上述方法包括总RNA的提取、逆转录反应制备cDNA模板、多重PCR反应、毛细管电泳得到基因电泳图谱、图谱数据分析得到麦芽水解相关基因的表达峰高H、利用麦芽水解相关基因的表达峰高H计算麦芽浸出率，[0047]针对麦芽水解相关基因LD，AMYI，AMY4，GLU，ASP，CYS，SERI，SERm，MET，TRX，PDI，SEP，WRKY和内控基因ACT;[0048]逆转录反应制备cDNA模板应用引物为SEQIDN0.2、SEQIDN0.4、SEQIDN0.6、SEQIDN0.8、SEQIDN0.10、SEQIDN0.12、SEQIDN0.14、SEQIDN0.16、SEQIDN0.18、SEQIDNO.20、SEQIDNO.22、SEQIDNO.24、SEQIDNO.26和SEQIDNO.28;[0049]多重PCR反应中应用引物SEQIDN0.1、SEQIDN0.3、SEQIDN0.5、SEQIDN0.7、SEQIDN0.9、SEQIDN0.11、SEQIDN0.13、SEQIDN0.15、SEQIDN0.17、SEQIDN0.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23、SEQIDNO.25和SEQIDNO.27。[0050]1根据LD，AMYl，AMY4，GLU，ASP，CYS，SERI，SERm，MET，TRX，PDI，SEP，WRKY和ACT基因的全长序列，使用PrimerPremier5软件设计符合GeXP多重PCR反应特点的，与大麦发芽过程蛋白、多糖水解相关的，特异性上下游引物，引物序列见表4。[0051]表4麦芽浸出率相关基因的特异性上下游引物[0052][0053]2在制麦过程中，取发芽1天的绿麦芽，液氮研磨粉碎得麦芽样品，样品立即进行RNA提取，或者放置于-80°C进行保存。[0054]3TRIZOL法提取总RNA[0055]1取50_100mg样品，加ImlTrizol;[0056]2震荡裂解后于4°C12000g离心5min，将上清移至Phasemarker管，静置5min;[0057]3加入0·2ml氯仿，手动摇晃15s，静置[0058]4取上清约450-550μ1至EP管中，添加250微升96%乙醇，枪尖混合；[0059]5将混合液硅胶吸附，12000g离心lmin，去除流下的废液；[0060]6加700μ1WBlThermoFisherRNA纯化试剂盒：GeneJETPlantRNAPurificationKit，12000g离心lmin，去除流下的废液；[0061]7加500μ1WB2ThermoFisherRNA纯化试剂盒：GeneJETPlantRNAPurificationKit，12000g离心lmin，去除流下的废液；[0062]8加500μ1WB2ThermoFisherRNA纯化试剂盒：GeneJETPlantRNAPurificationKit，12000g离心lmin，将娃胶管移至1.5mlEP管；[0063]9加50μ1nuclease-free水，静置lmin，12000g离心lmin;[0064]10收集离心下来的RNA溶液，放置于_80°C保存。[0065]⑷逆转录反应制备cDNA模板：[0066]以上述RNA为模板，使用BeckmanCoulter公司的GenomeLab™GeXP启动试剂盒，上述表5中的多重引物的下游引物为特异性引物，合成cDNA第一链，反应体系为IOyL。[0067]cDNA第一链合成反应体系设置见表5，其中NTC和Rr为阴性对照：[0068]表5逆转录反应制备cDNA模板的反应条件[0069][0070]逆转录反应制备cDNA模板反应参数设置如下：[0071]48°C1分钟;42°C60分钟;95°C5分钟。[0072]⑸RT-PCR:[0073]采用BeckmanCoulter公司的DNA聚合酶及GenomeLab™GeXP启动试剂盒进行。以上述表2中合成的逆转录反应制备cDNA模板为模板，上述表5中的多重引物的上游引物为特异性引物，进行RT-PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，具体反应条件见表6。[0074]表6RT-PCR的反应条件「00751[0076]RT-PCR扩增参数设置如下：[0077]95°：10分钟；941€30秒；561€30秒；71°：1分钟（35个循环）。[0078]6多重PCR产物毛细管电泳:取IyLPCR多重产物加到分装有39yL的95%去离子甲酰胺SLS和400bpMarker混合液的上样板的孔中，用移液枪混匀后覆盖一滴石錯油。另夕卜，在缓冲液板每孔中加入250yL的分离缓冲液。全部准备完后，上机进行毛细管电泳，得到毛细管电泳图谱，参见图1。[0079]⑺分析毛细管电泳图谱[0080]利用GeXP系统参数对毛细管电泳结果进行分析，记录结果，如图1所示，每个不同大小的峰均对应其相应的基因，且每个峰的高度对应着基因的表达量，测量麦芽水解相关基因的表达峰高H，结果如下表7。[0081]表7加拿大麦芽浸出率相关基因峰高H[0084]⑻利用麦芽水解相关基因的表达峰高H计算麦芽浸出率，公式如下：[0085]麦芽浸出率=82.864+10*[0.233相（八1^1!1八0'-0.272*!10'1«!1八0'-0·207*HSERIHACT+0·381*HMETHACT+[0086]0·195*HCYSHACT+0·061*HPDIHACT-0·182*HASPHACT+0·009*HSEPHACT-0·122*HWRKYHACT-0·970*HLDHACT-2·094*HAMY4HACT-0·088*H®LUHACT+0·097*HSERmHACT]。[0087]计算得到麦芽浸出率=81.6%，相比于传统的比重瓶法得到的浸出率为80.3%，二者浸出率相近，说明本发明的基于基因表达监控的麦芽浸出率评价方法准确度高，效率尚。[0088]实施例2[0089]本发明实施例提供了一种基于基因表达监控的澳大利亚麦芽浸出率评价方法。[0090]步骤⑴-⑹同实施例1，毛细管电泳图谱参见图2。[0091]⑺分析毛细管电泳图谱[0092]利用GeXP系统参数对毛细管电泳结果进行分析，记录结果，如图2所示，每个不同大小的峰均对应其相应的基因，且每个峰的高度对应着基因的表达量，测量麦芽水解相关基因的表达峰高H，结果如下表8。[0093]表8澳大利亚麦芽浸出率相关基因峰高H[0094][0095][0096]⑻利用麦芽水解相关基因的表达峰高H计算麦芽浸出率，公式如下：[0097]麦芽浸出率=82.864+10*[0.233相仏1^1!1仏0'-0.272*!10'1«!1仏0'-0·207*HSERIHACT+0·381*HMETHACT+0·195*HCYSHACT+0·061*HPDIHACT-0·182*HASPHACT+0·009*HSEPHACT-0·122*HWRKYHACT-0·970*HLDHACT-2·094*HAMY4HACT-0·088*H®LUHACT+0·097*HSERmHACT]。[0098]计算得到麦芽浸出率=79.8%，相比于传统的比重瓶法得到的浸出率为79.4%，二者浸出率十分接近，说明本发明的基于基因表达监控的麦芽浸出率评价方法准确度高，效率高。[0099]实施例3[0100]本发明实施例提供了一种基于基因表达监控的国产麦芽浸出率评价方法。[0101]步骤1-⑹同实施例1，毛细管电泳图谱参见图3。[0102]⑺分析毛细管电泳图谱[0103]利用GeXP系统参数对毛细管电泳结果进行分析，记录结果，如图3所示，每个不同大小的峰均对应其相应的基因，且每个峰的高度对应着基因的表达量，测量麦芽水解相关基因的表达峰高H，结果如下表9。[0104]表9国产麦芽浸出率相关基因峰高H[0105][0106]⑻利用麦芽水解相关基因的表达峰高H计算麦芽浸出率，公式如下：[0107]麦芽浸出率=82.864+10*[0.233相仏1^1!1仏0'-0.272*!10'1«!1仏0'-0·207*HSERIHACT+0·381*HMETHACT+0·195*HCYSHACT+0·061*HPDIHACT-0·182*HASPHACT+0·009*HSEPHACT-0·122*HWRKYHACT-0·970*HLDHACT-2·094*HAMY4HACT-0·088*H®LUHACT+0·097*HSERmHACT]。[0108]计算得到麦芽浸出率=78.6%，相比于传统的比重瓶法得到的浸出率为78.9%，二者浸出率接近，说明本发明的基于基因表达监控的麦芽浸出率评价方法准确度高，效率尚。

权利要求：1.基于基因表达监控的麦芽浸出率评价方法，其特征在于，包括总RNA的提取与纯化、逆转录反应制备cDNA模板、多重PCR反应、毛细管电泳得到基因电泳图谱、图谱数据分析得到麦芽水解相关基因的表达峰高H、利用麦芽水解相关基因的表达峰高H计算麦芽浸出率，针对麦芽水解相关基因LD，AMYl，AMY4，GLU，ASP，CYS，SERI，SERm，MET，TRX，PDI，SEP，WRKY和内控基因ACT;逆转录反应制备cDNA模板应用引物为SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDN0.8、SEQIDN0.10、SEQIDN0.12、SEQIDN0.14、SEQIDN0.16、SEQIDN0.18、SEQIDNO.20、SEQIDNO.22、SEQIDNO.24、SEQIDNO.26和SEQIDNO.28;多重PCR反应中应用引物SEQIDN0.1、SEQIDN0.3、SEQIDN0.5、SEQIDN0.7、SEQIDN0.9、SEQIDN0.11、SEQIDN0.13、SEQIDN0.15、SEQIDN0.17、SEQIDN0.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23、SEQIDNO.25和SEQIDNO.27;其中，利用上述麦芽水解相关基因的表达峰高H计算麦芽浸出率的公式如下：麦芽浸出率=82·864+10*[0·233*HAMYlHACT-0·272*HTRXHACT-0·207*HSERIHACT+0·381*HMETHACT+0·195*HCYSHACT+0·061*HPDIHACT-0·182*HASPHACT+0·009*HSEPHACT-0·122*HWRKYHACT-0·970*HLDHACT-2·094*HAMY4HACT-0·088*H®LUHACT+0·097*HSERmHACT]。2.根据权利要求I所述的基于基因表达监控的麦芽浸出率评价方法，其特征在于，所述多重PCR反应的反应体系中，总反应体系为20yL，其中，25mMMgCl24.0yL、5XPCR缓冲液4.OyUDNA聚合酶0.7yL、逆转录反应制备cDNA模板应用引物2yL、多重PCR反应中应用引物9.3yL;扩增参数为：95°C预变性10min;94°C变性30s;56°C退火30s;71°C延伸lmin，循环35次。3.根据权利要求1-2任一项所述基于基因表达监控的麦芽浸出率评价方法，其特征在于，所述麦芽水解相关基因LD的产物大小为290bp，AMYl的产物大小为148bp，AMY4的产物大小为339bp，GLU的产物大小为374bp，ASP的产物大小为222bp，CYS的产物大小为208bp，SERI的产物大小为180bp，SERm的产物大小为395bp，MET的产物大小为197bp，TRX的产物大小为176bp，PDI的产物大小为218bp，SEP的产物大小为268bp，WRKY的产物大小为283bp;内控基因ACT的产物大小为237bp。

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