申请/专利权人：广西壮族自治区兽医研究所

申请日：2018-01-26

公开（公告）日：2020-07-17

公开（公告）号：CN108018367B

主分类号：C12Q1/6893(20180101)

分类号：C12Q1/6893(20180101);C12Q1/686(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.17#授权;2018.06.05#实质审查的生效;2018.05.11#公开

摘要：本发明公开了一种检测阿米巴的PCR引物及方法。该PCR引物包括amb‑F:CGGACGGCTCATTATAACAGT，amb‑R:TCCCGTTATTTTCTGAATCACC。其扩增片段为16SrRNA，扩增长度为790bp。检测方法包括1提取待检样品的DNA；2对待检样品进行PCR扩增反应；3对PCR扩增产物进行电泳检测。本发明的方法具有检测快速，特异性强等优点，为简便、快速地检测阿米巴原虫带来便利。

主权项：1.一种检测阿米巴的PCR引物，其特征在于，该引物为：amb-F:CGGACGGCTCATTATAACAGT，amb-R:TCCCGTTATTTTCTGAATCACC。

全文数据：一种检测阿米巴的PCR引物及方法技术领域[0001]本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种检测阿米巴原虫的PCR引物组及方法。背景技术[0002]阿米巴原虫病主要是由溶组织内阿米巴Entamoebahistolytica引起的一种高发病率、高度致病性的人兽共患寄生性原虫病。该原虫多寄生于人和动物的肠道和肝脏，弓丨发阿米巴痢疾或肝脓肿。临床上表现发热、腹痛腹胀、呕吐、恶臭痢疾血便等症状，病理剖解多见肠炎、肠道出血水肿、溃疡、增生等，个别病例肝脏上出现脓肿。阿米巴原虫病分布范围广泛，易感动物较多，呈世界性流行传播。自1875年FederLosch首次在人体发现该原虫以来，该病已给人和动物的健康带来了严重的影响，同时也造成了巨大的经济损失。比如食蟹猴等动物被阿米巴原虫感染，不仅给养殖业带来经济损失，还严重影响动物质量和动物跟踪研究检测结果的准确性，同时威胁动物饲养人员、兽医工作者及相关密切接触人群身体健康，因此快速的检测出阿米巴原虫感染情况，及时控制清除病原，保持动物的清洁，具有重要的公共卫生意义和研究意义。[0003]溶组织内阿米巴以滋养体和包囊两种存在形式。滋养体大小为7um〜60um，形态多变，其胞质分内外两层，内质较浓密呈颗粒状，外质透明，运动时外质伸出，形成伪足，能做定向运动，细胞核呈泡状，核膜薄，核仁细小，居中或偏离中心。包囊多呈球形，直径为IOum〜16um，未染色时为一折光性圆形小体，碘染色后呈黄色，夕卜周包围一层透明的囊壁，内含1个〜4个核，每个核具有1个位于中央的核仁。未成熟包囊，有1个〜2个核，常见含有染成棕色的糖原泡和透明的杆状拟染色体;成熟包囊具有4个核，糖原泡和拟染色体不易见到。目前用于实验动物原虫检测还是采用粪便涂片或沉淀染色法等传统检测手段，如GBT18448.9，GBT18448.10，这些方法虽然要求设备仪器不高，但由于原虫体积较小，常常受杂质影响较大，显微镜检查时检出率较低;染色法需要配制试剂种类多，步骤繁琐，要求显微镜操作者非常熟悉各类原虫及卵囊形态，具有超强辨别能力和较好的视力，否则受人为因素影响较大。对于大批量的样品检测，需要大量的人力物力，特别是显微镜观察者眼睛极易疲劳，难以在短时间内完成大量检测样品的工作。[0004]因此利用现代新的分子生物学知识和新仪器设备研究开发新的快速检测原虫病方法，制定出操作规程或标准，非常迫切。发明内容[0005]本发明的目的是提供一种检测阿米巴的PCR引物及方法，能够更为简便、快捷的检测阿米巴原虫，而且该方法的特异性强、灵敏性高、对模板的纯度要求不高，适用性好。[0006]—种检测阿米巴的PCR引物为：[0007]amb-F:CGGACGGCTCATTATAACAGT，[0008]amb-R:TCCCGTTATTTTCTGAATCACC〇[0009]本发明的引物是基于溶组织内阿米巴序列设计的，其扩增片段为16SrRNA，扩增完之后长度为790bp。[0010]本发明的检测阿米巴的非疾病诊断目的的方法采用本发明的PCR引物来检测阿米巴原虫，具体检测过程包括如下步骤：[0011]1提取待检样品的DNA;[0012]2对待检样品进行PCR扩增反应;先建立PCR反应体系，以每25yL体积为计：[0013][0014]而后进行PCR扩增反应，反应条件是先在95°C反应5min;随后进行循环95°C变性3〇8,51〜57°：退火4〇8,72°：延伸5〇8，如此循环30次；最后72°：延伸1〇11^11。[0015]3对PCR扩增产物进行电泳检测。在PCR扩增反应结束之后将PCR扩增产物放置在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。[0016]作为技术方案的优选，上述退火温度为53〜55°C。在这个温度条件下扩增出现的特异性带最为明显。[0017]检测完成之后，将有目的条带的PCR产物进行切胶回收、克隆、测序，准确后用质粒提取试剂盒进行提取质粒。[0018]本发明的有益效果是：[0019]1特异性强，所检测的阴性对照均无阳性结果出来。[0020]2灵敏度高，卩0?方法的检测限为2.055\10_4即^。[0021]3PCR检测能快速得出结果，效率高，整个过程在2.5小时左右就能得出结果。[0022]4本发明设计利用现代分子生物学理论知识、核酸扩增技术，针对阿米巴原虫设计的特异性引物，建立一套快速、灵敏、准确检测阿米巴原虫的PCR检测方法，该技术不同于ELISA方法和镜检的方法。采用ELISA抗体检测的方法只能检测抗体，不能检测病原，因此很难区别是新近感染还是既往感染，且成本费用较高等缺点；采用镜检的方法存在很多缺点或不足:①操作比较繁琐，需自己配制染色液一碘液，对样品进行染色才能观察;②对操作人员身体健康影响较大，碘液染色液易挥发，形成刺鼻的气味，刺激操作者眼睛和鼻子，使操作者身体健康受到威慑;③常常受杂质影响较大，显微镜检查时检出率较低，而且要求显微镜操作者非常熟悉各类原虫及卵囊形态，否则难以找到原虫;④对于大批量的样品检测，需要大量的人力物力，特别是显微镜观察者眼睛极易疲劳，难以在短时间内完成大量检测样品的工作。因此，本发明使用PCR方法可以快速、准确地得出结果，该方法不仅具有较高的敏感度，特异性强，而且操作简便，只需按建立的体系加样即可，为简便、快捷准确地检测阿米巴原虫带来便利。该技术将为早期判断和大批量检测样品提供技术支持，为今后食蟹猴等动物阿米巴原虫病临床诊断、病原监测、进出口检验检疫以及综合防控提供指导。附图说明[0023]图1是本方明PCR方法退火温度筛选结果图；1〜7:退火温度分别为51°C、52°C、53°C、54°C、55°C、56°C、57°C;M为IOObpLadder;N为阴性对照。[0024]图2是本发明的特异性检测结果图，图中I〜5分别为阿米巴、鞭虫、纤毛虫、沙门氏菌、大肠杆菌;M为DM2000;6为阴性对照。[0025]图3是本发明的敏感性检测结果图；质粒样品原始浓度为20.550ngAxL，l〜7:分别为浓度10°〜KT6;M为DM2000;N为阴性对照。[0026]图4临床样品检测结果图；1〜19:临床样品检测编号（共50份临床样品，只列出19份），M为IOObpLadder;P为阳性对照;N为阴性对照。具体实施方式[0027]本发明用下列实施例进行说明，但不是对本发明的使用范围的限制。[0028]实施例[0029]1、材料的准备[0030]阿米巴、鞭虫、纤毛虫、大肠杆菌、沙门氏菌均为广西兽医研究所分离保存。粪便基因组DNA提取试剂盒、2XESTaqMasterMix、MarkerDM2000、IOObpLadder、快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、快速质粒小提试剂盒、PUC-T、DH5a等，均购自北京康为世纪生物科技有限公司;PCR仪，购自天根生化科技北京有限公司；BIOWEST凝胶琼脂，购自GENE公司；凝胶成像系统，购自bio-rad公司。[0031]2、PCR引物的设计[0032]根据GenBank中已经发表的溶组织内阿米巴序列，利用〇lig〇7软件设计1对引物，得到具体引物信息如下：[0033]表IPCR引物信息[0035]3、待检样品的DNA抽提[0036]DNA抽提按照粪便基因组DNA提取试剂盒进行提取，其具体步骤操作如下：[0037]1取100_300mg奠便样本，置于离心管中，加入ImLBufferSW，渦旋振荡3_5min，使样本均勾分散于溶液中，12000rpm离心lmin，弃掉上清。[0038]2加入ImLBufferSL，涡旋振荡3-5min，使样本均匀分散于溶液中，65°C水浴20min，期间可每隔5min渦旋振荡158。12000印!11离心5分钟，将上清移至新的离心管中。[0039]3向上清液中加等体积BufferGL，颠倒混勾15-25次，冰上放置5min，12000rpm离心5min〇[0040]4将步骤3所得上清加入已装入收集管的吸附柱中，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。[0041]5向吸附柱中加入500yLBufferGWl使用前检查是否加入无水乙醇），12000rpm离心Imin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。[0042]6向吸附柱中加入500yLBufferGW2使用前检查是否加入无水乙醇），12000rpm离心Imin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。[0043]⑺重复步骤6。[0044]812000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。[0045]9将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加50-100yLBufferGE，室温放置2-5min，12000rpm离心Imin，收集DNA溶液，-20°C保存。[0046]4、PCR反应体系建立及扩增[0047]PCR反应体系，按25μ1体系配置：[0048][0049]PCR扩增反应条件参数为:95°C反应5min;随后进行30个循环95°C30s，51〜57°C4〇8,721：5〇8的循环;最后72°：延伸1〇1^11。反应结束后，取7以1^?0財广增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。然后有目的条带的PCR产物进行切胶回收、克隆、测序，准确后用质粒提取试剂盒进行提取质粒。[0050]5、PCR检测试验[0051]1特异性试验[0052]按照试剂盒说明书，分别提取阿米巴、鞭虫、纤毛虫、大肠杆菌、沙门氏菌，以DNA为模板，同时分别做阴阳性对照，采用PCR反应体系配置反应液及最佳方法PCR扩增条件:95。:反应5min;随后进行循环95°C变性3〇8,53〜55°：退火4〇8,72°：延伸5〇8的循环30个;最后72°C延伸lOmin。）进行扩增，以验证该检测方法的特异性，结果如图2。[0053]由图2可知，只有阿米巴有预期大小的目的条带，而其他未得到相应的条带，这说明建立阿米巴原虫的PCR检测方法具有良好的特异性。[0054]2敏感性检测[0055]以阿米巴DNA为模板，用引物amb-F3amb-R3进行PCR扩增，然后胶回收、克隆、转化、测序。将测序正确的序列进行提取质粒并测浓度。以阿米巴重组质粒PMD18-T-16SrRNA进行10倍梯度稀释6个稀释度，取2yL作为模板进行PCR敏感性试验，结果如图3。从图3可以看出，PCR方法检测线为2.055X10_4ngAiL。说明建立阿米巴原虫的PCR检测方法具有良好的敏感性。[0056]3PCR的的重复性试验[0057]按照建立的PCR方法，用引物amb-F和amb-R对阿米巴、鞭虫、纤毛虫、大肠杆菌、沙门氏菌分别进行3次PCR扩增，结果均一致，说明该PCR方法具有良好的重复性。可以特异性地稳定地检出阿米巴原虫。[0058]4临床样品的检测[0059]采用本发明的方法，对来自广西不同猴场的50份粪便样品进行检测，其中8份呈现阳性，如图4所示（图4列出19份样品）。与显微镜检查结果相符。这表明该方法可以快速准确检测猴粪便中的阿米巴原虫。

权利要求：1.一种检测阿米巴的PCR引物，其特征在于，该引物为：amb-F:CGGACGGCTCATTATAACAGT，amb-R:TCCCGTTATTTTCTGAATCACCo2.根据权利要求1所述的检测阿米巴的PCR引物，其特征在于，所述引物设计基于溶组织内阿米巴序列，其扩增片段为16SrRNA，扩增长度为790bp。3.—种检测阿米巴的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求1或2所述的PCR引物检测阿米巴原虫。4.根据权利要求3所述的检测阿米巴的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，包括如下步骤：1提取待检样品的DNA;⑵对待检样品进行PCR扩增反应；⑶对PCR扩增产物进行电泳检测。5.根据权利要求4所述的检测阿米巴的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述步骤⑵中先建立PCR反应体系，以每25μ1体积为计：6.根据权利要求4所述的检测阿米巴原虫的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件是先95°C反应5min;随后进行循环95°C变性30s，51〜57°C退火40s，72°C延伸50s，如此循环30次;最后72°C延伸IOmin。7.根据权利要求4所述的检测阿米巴原虫的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述退火温度为53〜55_°C。8.根据权利要求4所述的检测阿米巴原虫的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述步骤3中对PCR扩增产物进行电泳检测是在PCR扩增反应结束之后将PCR扩增产物放置在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

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