申请/专利权人：苏州科技大学

申请日：2018-02-06

公开（公告）日：2020-07-17

公开（公告）号：CN108159303B

主分类号：A61K31/7048(20060101)

分类号：A61K31/7048(20060101);A61K36/899(20170101);A61K8/9794(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.17#授权;2018.07.13#实质审查的生效;2018.06.15#公开

摘要：本发明提供了一种荩草黄酮提取工艺及其应用。提取工艺包括如下步骤：取荩草地上部分，洗净晾干烘干并粉碎后过筛；以石油醚为抽提剂，萃取荩草中的叶绿素并弃去含叶绿素的上清液，所得荩草粉末室温下晾干后，利用超声波进行提取，抽滤后旋蒸浓缩，柱层析分离及冷冻干燥后，即得荩草黄酮。本发明通过单因素实验和BOX‑Behnken中心组合响应面试验设计优化荩草黄酮的提取工艺，筛选出最优提取工艺。本发明首次对荩草黄酮的提取工艺及其应用进行研究，产物提取率和纯度较高。通过研究荩草黄酮的抗氧化和抑菌作用得知，其具有一定的抗氧化活性，并对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及梨轮纹病病原菌均具有较强的抑菌、杀菌活性，应用前景广泛。

主权项：1.一种荩草黄酮提取工艺，其特征在于，所述荩草黄酮提取工艺包括以下步骤：（1）原料预处理：取荩草地上部分，洗净烘干后测定含水量并粉碎，过筛，备用；（2）原料中叶绿素的去除：在步骤（1）所得的荩草粉末中加入与其液固比mLg为15：1的石油醚，然后通过离心去除荩草中的叶绿素成分，将荩草粉末沉淀在室温下晾干；（3）荩草黄酮粗提液的超声提取：向步骤（2）去除叶绿素的荩草粉末中加入体积分数为40～90%的乙醇溶液超声提取荩草黄酮，乙醇溶液与荩草粉末的液固比mLg为（15～45）：1，提取温度为40～80℃，超声波功率为100～600W，超声提取时间为10～50min；超声完成后将反应体系进行真空抽滤收集滤液，将滤液旋蒸浓缩后的产物进行冷冻干燥，得到荩草黄酮粗提液；（4）荩草黄酮粗提液的分离纯化：将步骤（3）制得的荩草黄酮粗提液用大孔树脂进行分离纯化，荩草黄酮纯化液经检测后再进行旋蒸浓缩和冷冻干燥，得到高纯度的荩草黄酮。

全文数据：荩草黄酮提取工艺及其应用技术领域[0001]本发明属于提取分离领域，涉及一种黄酮的提取工艺及其应用，特别是涉及一种荩草黄酮的提取方法，以及该黄酮物质的抗氧化、抗菌、抑菌应用。背景技术[0002]草草[Arthraxo_nhispidusThunb·Makino]是一年生禾本科植物，别名箓竹、王会、马耳草、黄草等。草草杆细弱无毛，基部倾斜，高30_45cm，分枝多节。叶鞘短于节间，有短硬疣毛；叶舌膜质，边缘具纤毛；叶片卵状披针形，长2-4cm，宽8-15mm，除下部边缘生纤毛夕卜，余均无毛，花、果期8-11月。《神农本草经》中有这样的描述，“荩草，叶似竹而细薄，茎亦圆小。生平泽溪涧之侧，荆襄人煮以染黄，色极鲜好”。荩草是一味由来已久的中药，具有止咳定喘，杀虫解毒的功效。现在，主要将它用于治疗久咳气喘，肝炎，咽喉炎，口腔炎，鼻炎，淋巴结炎，乳腺炎，疮疡疥癣等症。同时，荩草在古代作为黄色燃料直接染棉、毛、丝等物，也用于与蓝靛相套染绿色。文献记载，荩草的叶和茎中含有荩草素、木犀草素、木犀草素-7-葡萄糖甙等黄酮类成分。荩草在全国均有分布，且再生性好，生长速度快，因此荩草资源的开发利用具有原料来源广、成本低廉的优点。[0003]目前，有关荩草研究主要集中在其形态、生理生态特征特性、分株特征及生殖分配、种质资源形态多样性、化学成分及作为植物染料的研究。而有关荩草黄酮的研究尚未开展。本方法通过优化的荩草黄酮提取工艺对荩草黄酮进行提取、制备，并对其抗氧化、抗菌作用进行科学评价，对于进一步开发和利用荩草这种优质植物资源具有十分重要的意义。发明内容[0004]本发明提供一种荩草黄酮提取工艺，以荩草黄酮得率为评价指标，通过单因素实验和响应面试验设计对超声波辅助提取荩草黄酮的工艺进行优化，并对荩草黄酮的抗氧化活性及其抑菌作用进行研究。旨在得到荩草黄酮的最优提取工艺条件和应用范围，为其进一步开发应用提供科学依据。本发明所述的荩草黄酮的提取工艺包括以下步骤：一种荩草黄酮提取工艺，所述荩草黄酮提取工艺包括以下步骤：1原料预处理:取荩草地上部分，洗净并烘干后，测定含水量，烘干并粉碎，过筛，备用；⑵原料中叶绿素的去除:在步骤⑴所得的荩草粉末中加入与其液固比mLg为15:1的石油醚，然后通过离心去除荩草中的叶绿素成分，将荩草粉末沉淀在室温下晾干；3荩草黄酮粗提液的超声提取:向步骤2去除叶绿素的荩草粉末中加入体积分数为40〜90%的乙醇溶液超声提取荩草黄酮，乙醇溶液与荩草粉末的液固比mLg为（15〜45:1，提取温度为40〜80°C，超声波功率为100〜600W，超声提取时间为10〜50min;超声完成后将反应体系进行真空抽滤收集滤液，将滤液旋蒸浓缩后的产物进行冷冻干燥，得到荩草黄酮粗提液；4荩草黄酮粗提液的分离纯化:将步骤3制得的荩草黄酮粗提液用大孔树脂进行分离纯化，荩草黄酮纯化液经检测后再进行旋蒸浓缩和冷冻干燥，得到高纯度的荩草黄酮。[0005]优选的，所述步骤1中烘干温度为35tC，过筛时筛子目数为60目。[0006]优选的，所述步骤3中乙醇溶液的体积分数为60〜80%;乙醇溶液与荩草粉末的液固比mLg为30〜40:1;超声波功率为300〜500W;超声提取时间为20〜40min。[0007]优选的，所述步骤⑶中乙醇溶液的体积分数为70.2%。[0008]优选的，所述步骤3中乙醇溶液与荩草粉末的液固比mLg为39.8:1。[0009]优选的，所述步骤3中超声波功率为315W。[0010]优选的，所述步骤3中超声提取时间为23min。[0011]进一步的，本发明所述的提取工艺制得的荩草黄酮。[0012]进一步的，本发明所述的荩草黄酮在制备抑菌或杀菌产品的应用。[0013]进一步的，本发明所述的荩草黄酮在制备抗氧化产品的应用。[0014]本发明制得的抑菌或杀菌产品、抗氧化产品，可以应用于食品、化妆品、日化产品、药品、保健品中。[0015]有益效果:本发明提供了一种荩草黄酮提取工艺及其应用，本发明与现有技术相比，其显著优点在于:第一，本发明首次利用优化工艺提取分离、纯化得到高纯度的荩草黄酮。第二，本发明首次对荩草黄酮的抗氧化及抗菌、抑菌活性进行了研究，通过试验结果得出，本发明提取的荩草黄酮对自由基具有较好的清除作用;本发明提取的荩草黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、梨轮纹病原菌均具有较强的抑菌活性，且对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强，同时，荩草黄酮对灰绿青霉也有一定的抑制作用。第三，本发明采用目前最优的提取技术一超声波技术，并结合单因素和响应面设计方法优化荩草黄酮提取工艺，确保了提取工艺条件准确可靠，具有安全、经济等特点，适用于大规模生产。附图说明[0016]图1为荩草黄酮提取工艺及分析的工艺流程图；图2为超声波功率对荩草黄酮得率的影响结果图；图3为提取剂浓度对荩草黄酮得率的影响结果图；图4为超声提取时间对荩草黄酮得率的影响结果图；图5为乙醇提取剂与荩草粉末的液固比对荩草黄酮得率的影响结果图；图6为提取温度对荩草黄酮得率的影响结果图；图7为超声波功率与超声提取时间交互作用对荩草黄酮得率影响的响应面和等值线图；图8为超声提取时间与乙醇体积分数交互作用对荩草黄酮得率影响的响应面和等值线图；图9为超声提取时间与液固比交互作用对荩草黄酮得率影响的响应面和等值线图；图10为超声波功率与乙醇体积分数交互作用对荩草黄酮得率影响的响应面和等值线图；图11为超声波功率与液固比交互作用对荩草黄酮得率影响的响应面和等值线图；图12为乙醇体积分数与液固比交互作用对荩草黄酮得率影响的响应面和等值线图。具体实施方式[0017]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。[0018]实施例1:荩草黄酮的提取工艺优化及成分分析步骤1:取12月下旬采集的荩草，用清水洗净，在常温下晾干外表水，将其在35°C下烘干并粉碎，过60目筛后备用；步骤2:将步骤1所得荩草粉末中加入与其液固比mLg为15:1的石油醚进行叶绿素萃取和清除。[0019]步骤3:向步骤2所得荩草粉末中加入与其液固mLg比分别为15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1和45:1的提取剂；乙醇体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%和90%;提取温度分别为40°：、50°：、60°：、70°：、80°：;超声波功率分别为1001、2001、3001、4001、5001和600¥的条件下，超声萃取l〇min、20min、30min、40min、50min，然后用真空抽滤机抽滤，旋蒸浓缩后进行冷冻干燥，得到荩草粗黄酮，接着进行大孔树脂分离纯化，通过黄酮检测后将所获得的黄酮纯化液进行旋蒸浓缩和冷冻干燥，得到纯化后的荩草黄酮。[0020]步骤4:将步骤3初步优选出的各个黄酮提取的影响因素：以提取温度为70°C，在液固比mLg为30:1、35:1、40:1，超声波功率为3001、4001、5001的条件下，超声萃取2011^11、30min、40min;乙醇体积分数为60%、70%、80%，利用这些不同的影响因素的3个水平，采用响应面设计优化荩草黄酮提取工艺。[0021]步骤5:在单因素试验基础上，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，以超声提取时间、超声波功率、乙醇体积分数和液固比四个因素为自变量分别以Xl424344表示），以荩草黄酮得率为响应值设计了四因素三水平共29个实验点的响应面分析实验，其中分为24个析因点和5个零点。[0022]1.响应面试验1响应面试验具体包括如下几个方面实验：Xl:超声提取时间（20min〜40min对荩草黄酮得率的影响X2:超声波功率300W〜500W对荩草黄酮得率的影响X3:乙醇体积分数60%〜80%对荩草黄酮得率的影响X4:液固比mLg30:1〜40:1对荩草黄酮得率的影响2响应面试验设计表：表1三因素三水平响应面分析试验设计表实验以随机次序进行，将实验所得的荩草黄酮得率用Design-Expert8.06程序进行分析，并得出回归拟合方程以及方差分析表及响应面分析图。响应面实验设计与结果见表2。[0023]表2响应面中心组合实验方案及结果3模型的建立与方差分析根据Box-Behnken中心组合设计原理，利用Design-Expert.V8.0.6软件对表2中的实验数据进行多元回归拟合，可得超声波功率、超声提取时间、液固比和超声提取温度荩草黄酮得率R之间相互关系的二次多元回归方程：R=I.77-0.079*Xi-0.036*X2+0.019*X3+0.11*Χ4+0.065*Χι*Χ2+0.019*Xi*X2-〇.13*Xi*X4+8·250E_3*X2*X3-0·17*X2*X4-0·015*X3*X4-0·060*Xi2-0·072*X22-0·18*X32+0·098*X42式中X1、X2、X3和X4的各项系数的绝对值大小直接反映出各因素对荩草黄酮得率的影响程度，系数的正负反映出荩草黄酮得率增加或减小。对表2中的实验结果进行统计分析，分析结果如表3所示。[0024]表3回归模型方差分析表备注:表3中ProbF值小于O.Ol时表示有极显著影响，用**表示，ProbF小于0.05时表示有显著影响，用*表示，而当ProbF值大于0.05时，则表示影响不显著。[0025]由表3可知，模型的一次项中液固比X4对方程影响最显著，说明液固比直接关系到荩草黄酮的得率，其次是超声提取时间Xl，而超声功率和乙醇体积分数对荩草黄酮得率影响较小。二次项中的超声功率X2，乙醇体积分数X3和液固比X4均对荩草黄酮得率有显著影响，且其影响呈二次关系。由F值可知，各因素对荩草黄酮得率的影响次序为:液固比X4超声时间Xl超声功率X2乙醇体积分数X3。整体模型的ProbF值小于0.01，表明该回归模型达到极显著水平；回归模型的相关系数R2=O.9155Radj2=0.8309，且失拟项不显著ProbF值为0.30930.05，说明模型与数据之间拟合度较好，因此可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。同时做出中心组合设计试验所得的6组响应面曲面图，参见附图。[0026]4荩草黄酮最佳提取条件的预测与检验响应面图形是特定的响应值Y对应的因素Xl、X2、X3、X4构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，可以直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响。图中可看到拟合曲面有最大值，对拟合方程求偏导，可得出模型最大值，即为最优的试验方案。[0027]在实验范围内，通过Design-Expert.V8.0.6软件对回归方程分析预测，得出草草黄酮的最优提取工艺条件为：超声波功率为315W，超声提取时间为23min，乙醇体积分数70.2%，液固比mLg为39.8:1，超声提取温度为70°C，理论最高得率为2.23%。[0028]为验证响应面分析法所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行试验:超声波功率为315W，超声提取时间为23min，液固比mLg为39.8:1，乙醇体积分数70.2%，超声提取温度为70°C。在此工艺条件下，按照前面所述提取分离纯化流程操作，最后荩草黄酮得率的平均值为2.21%，与预测得率的误差为0.9%。说明了回归方程的预测值与试验值之间具有较好的拟合度。因此，基于BOX-Behnken中心组合设计的响应面法所得的优化工艺参数准确可靠，具有较好的实用价值。[0029]5草草总黄酮分析a、荩草中总黄酮含量测定以前面处理好的荩草粉末为原料，准确称取45.OOg三组重复，每组15g，在前面所得的优化工艺条件组合下下提取3次，将3次所得提取液旋转蒸发至近干，用95%的乙醇溶解，定容到IOOOmL容量瓶，即得荩草提取液。通过分光光度法，以芦丁为标准品，利用AlCl3-NaNO2法对实验所得的荩草提取液的总黄酮含量进行测定，结果表明，荩草总纯黄酮含量为荩草干物质的2.06%。[0030]b、荩草黄酮提取物纯度、得率及提取率测定通过分光光度法，以芦丁为标准品，利用AlCl3-NaNO2法对实验所得的荩草黄酮提取物的纯度进行了测定，测得其纯度为85%，符合国家二类新药原料以及黄酮类保健食品要求。由荩草黄酮提取物得率为2.21%，纯度为85%来计算，荩草总黄酮的最后得率为干物重的1.88%，S卩：每IOOg荩草干物质，可得1.88g荩草总黄酮，根据荩草中所含总黄酮为干物质的2.06%可知，荩草总黄酮的提取率达91.2%，所以所得荩草黄酮的纯度和提取率达到了较高的水平。[0031]实施例2:荩草黄酮抑菌作用步骤1:荩草黄酮制备取荩草干燥粉末IOOOg，利用实施例1中所得的荩草黄酮优化提取工艺超声波功率为315W，超声提取时间为23min，液固比mLg为39.8:1，乙醇体积分数70.2%，超声提取温度为70°C，进行荩草黄酮制备，分离纯化，黄酮冷冻干燥后得到21.9g浅黄色黄酮，荩草黄酮的得率为2.19%。[0032]步骤2:荩草黄酮抑菌作用1供试菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、梨轮纹病原菌、灰绿青霉（以上菌种均由苏州科技大学微生物实验室提供）。[0033]⑵培养基：牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂1.5%〜2.0%液体培养基不含琼脂）、水lOOOmL，pH7.0〜7.2使用I.OmolL的NaOH溶液调节pH。[0034]马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15〜20g、蒸馏水1000mL，自然pH。[0035]3菌悬液的配制：从经过活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种于相应的液体培养基中，放入恒温振荡培养箱培养至对数生长期。分别吸取以上培养时间的供试菌液〇.5mL，加入无菌水倍比稀释到IO5〜106mL_1，备用。[0036]4供试药物：阳性对照:头孢拉定和山梨酸钾;样品:实施例2所得的荩草黄酮。[0037]5抑菌活性的测定：采用滤纸片法测定抑菌活性。使用打孔器，将定性滤纸制成小圆纸片D=6mm，高压灭菌后备用。无菌条件下，在已灭菌的培养皿中倾入相应菌种的培养基25.OOmL，冷却凝固后制成固体平板。将上述接种活化好的各种菌分别取适量初试菌悬液用生理盐水将其稀释成含菌量为IO6〜IO7CFUAiL的菌悬液备用其中真菌采用显微镜血球计数板计数，用接种环挑取真菌于无菌生理盐水中，调整稀释均匀后吸取一部分置于血球计数板中，使得其在显微镜下观测视野中每个中方格中孢子数为14~18个，成为106~107个mL的孢子菌悬液）。[0038]将灭完菌的干燥的滤纸片用镊子夹到配制好的溶液（用DMSO稀释配制）中浸泡30min，用无菌镊子在试管壁上弄去多余溶液，放到上述的各个含菌培养皿上，每个培养皿上放置三片滤纸片，细菌于37°C倒置培养24h，真菌于28°C倒置培养48h后观察结果。到培养时间后取出培养皿观察透明抑菌圈，采用十字交叉法用测微尺测量每个抑菌圈两个垂直方向的直径大小，取其平均值mm为测定结果，每项抑菌实验均平行重复3次。以抑菌圈直径的大小来进行抑菌活性强弱的判定，抑菌圈表现得越大，则表明其抗菌活性也就越强。[0039]6实验结果：抑菌活性测定结果如表4所示。[0040]表4荩草黄酮对各种微生物作用的抑菌圈大小mm由表4可知，实施例2所得的荩草黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、梨轮纹病原菌均具有较强的抑菌活性，且对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强。同时，荩草黄酮对灰绿青霉也有一定的抑制作用。[0041]实施例3:荩草黄酮抗氧化作用1取配制好的DPPH试剂3.9mL放于干净试管中，之后马上加入0.ImL用DMSO溶解的各种不同浓度的荩草黄酮溶液，充分摇匀后，在室温25°C左右）、避光条件下反应30min，然后再在515nm波长下测定吸光度值，得荩草黄酮样品吸光度值Al。另外取3.9mLDPPH试剂，加0.ImL溶解样品的溶剂，充分迅速摇匀后，在室温25°C左右）、避光条件下反应30min，然后再515nm波长下测定吸光度值，得A空白吸光度值A2。[0042]DPPH清除率％=[A2-A1A2]X100%⑵抑菌活性测定结果如表5所示。[0043]表5荩草黄酮对对DPPH自由基清除作用_表中y为清除率%，X为样品浓度gmL，其中IC5QygmL值越小，其清除自由基活性越强。[0044]由表5可知，实施例1所得的荩草黄酮对DPPH自由基具有一定的清除作用，从而说明荩草黄酮具有一定的抗氧化活性，但其抗氧化活性比阳性对照BHT2，6-二叔丁基对甲苯酚要弱。[0045]通过以上实例可以发现，荩草黄酮具有鲜艳的颜色，同时也具有较好的抗菌、抗氧化活性，对于荩草的研究开发具有重要的实践意义和应用前景。

权利要求：1.一种荩草黄酮提取工艺，其特征在于，所述荩草黄酮提取工艺包括以下步骤：1原料预处理：取荩草地上部分，洗净并烘干后，测定含水量，烘干并粉碎，过筛，备用；2原料中叶绿素的去除:在步骤（1所得的荩草粉末中加入与其液固比mLg为15:1的石油醚，然后通过离心去除荩草中的叶绿素成分，将荩草粉末沉淀在室温下晾干；3荩草黄酮粗提液的超声提取：向步骤2去除叶绿素的荩草粉末中加入体积分数为40〜90%的乙醇溶液超声提取荩草黄酮，乙醇溶液与荩草粉末的液固比mLg为（15〜45:1，提取温度为40〜80°C，超声波功率为100〜600W，超声提取时间为10〜50min;超声完成后将反应体系进行真空抽滤收集滤液，将滤液旋蒸浓缩后的产物进行冷冻干燥，得到荩草黄酮粗提液；4荩草黄酮粗提液的分离纯化:将步骤3制得的荩草黄酮粗提液用大孔树脂进行分离纯化，荩草黄酮纯化液经检测后再进行旋蒸浓缩和冷冻干燥，得到高纯度的荩草黄酮。2.根据权利要求1所述的一种荩草黄酮提取工艺，其特征在于，所述步骤（1中烘干温度为35°C，过筛时筛子目数为60目。3.根据权利要求1所述的一种荩草黄酮提取工艺，其特征在于，所述步骤3中乙醇溶液的体积分数为60〜80%;乙醇溶液与荩草粉末的液固比mLg为30〜40:1;超声波功率为300〜500W;超声提取时间为20〜40min。4.根据权利要求1所述的一种荩草黄酮提取工艺，其特征在于，所述步骤3中乙醇溶液的体积分数为70.2%。5.根据权利要求1所述的一种荩草黄酮提取工艺，其特征在于，所述步骤3中乙醇溶液与荩草粉末的液固比mLg为39.8:1。6.根据权利要求1所述的一种荩草黄酮提取工艺，其特征在于，所述步骤3中超声波功率为315W。7.根据权利要求1所述的一种荩草黄酮提取工艺，其特征在于，所述步骤3中超声提取时间为23min。8.权利要求1-7所述的提取工艺制得的荩草黄酮。9.权利要求8所述的荩草黄酮在制备抑菌或杀菌产品的应用。10.权利要求8所述的荩草黄酮在制备抗氧化产品的应用。

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