申请/专利权人：浙江大学

申请日：2018-09-06

公开（公告）日：2020-07-17

公开（公告）号：CN109231367B

主分类号：C02F1/46(20060101)

分类号：C02F1/46(20060101);C12Q1/6851(20180101);C02F103/32(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.17#授权;2019.02.19#实质审查的生效;2019.01.18#公开

摘要：本发明公开了一种有效降解柑橘加工废水中耐药基因的方法，包括如下步骤：采用低温等离子体处理含耐药基因的柑橘加工废水，然后检测废水中的耐药基因水平；所述低温等离子体处理的条件为：处理频率为10～14kHz,处理功率为40～60W，处理时间为4～6min,处理温度为20～30℃。本发明采用低温等离子体技术有效降解柑橘加工废水中耐药基因的含量，进一步控制耐药基因在生态环境中的传播。

主权项：1.一种有效降解柑橘加工废水中耐药基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用低温等离子体处理含耐药基因的柑橘加工废水，然后检测废水中的耐药基因水平；所述低温等离子体处理的条件为：处理频率为10～14kHz,处理功率为40～60W，处理时间为4～6min,处理温度为20～30℃；所述耐药基因为耐氨苄青霉素基因和或耐四环素基因；所述柑橘加工废水中耐氨苄青霉素基因水平为8～10log拷贝数mL，耐四环素基因水平为8～10log拷贝数mL；所述低温等离子体处理为：采用双介质阻挡放电低温等离子体装置，先将2～4mL含有耐药基因的柑橘加工废水装入石英玻璃培养皿中，上介质与液面气隙距离为1.5～2.5mm。

全文数据：一种有效降解柑橘加工废水中耐药基因的方法技术领域本发明涉及废水处理领域，具体涉及一种有效降解柑橘加工废水中耐药基因的方法。背景技术细菌耐药性对公共健康、食品安全和经济发展已造成了全球性的威胁。抗生素的滥用加速了细菌耐药基因在环境中更大范围的传播。耐药基因是可移动的基因元件，其能够通过基因水平转移原理从一个细菌中转移到另一个细菌中。一旦大量的耐药基因释放到环境中，其他细菌很有可能会获得这种耐药基因，从而导致对抗生素的耐受性。耐药基因已被认为是生态系统如城市污水、农业工业废水、饮用水等中常见的危害因子之一。传统的污水处理技术虽然能够有效地杀灭不具有耐药性的细菌，但是很难消除具有高抗性的耐药细菌，甚至有研究还表明一些技术有可能会增加其中耐药基因的水平。因此，亟需有效的废水处理技术来消除生态环境中耐药基因对人类健康的威胁。有效降解废水中的耐药基因，是增强废水的安全性的重要手段，例如，公开号为CN108148606A的中国发明专利申请文献公开了一种养殖废弃物抗生素耐药基因的控制方法，包括以下步骤：将含有抗生素耐药基因的畜禽粪便通过与生物质废弃物混合，将其含水率降低到小于40％；再将其通过螺旋输送的方式连续送入外热式热解炉内、在无氧或缺氧的气氛下进行热解处理，将粪便中的抗生素抗性基因微生物完全分解得到固体物质；所述固体物质在缺氧的气氛下无氧化随炉冷却得到生物炭。该方法是借助热解工艺的高温过程，使畜禽粪便中的抗生素耐药基因微生物在分子水平上被分解。发明内容本发明涉及一种有效降解柑橘加工废水中耐药基因的方法，采用低温等离子体技术有效降解柑橘加工废水中耐药基因的含量，进一步控制耐药基因在生态环境中的传播。一种有效降解柑橘加工废水中耐药基因的方法，包括如下步骤：采用低温等离子体处理含耐药基因的柑橘加工废水，然后检测废水中的耐药基因水平；所述低温等离子体处理的条件为：处理频率为10～14kHz，处理功率为40～60W，处理时间为4～6min，处理温度为20～30℃。本发明的降解原理是利用等离子体所产生丰富的活性粒子如活性氧活性氮、电子、正负离子等来与耐药基因进行化学反应，从而破坏耐药基因的结构，进而达到降解耐药基因的目的。优选地，所述耐药基因为耐氨苄青霉素基因和或耐四环素基因。进一步优选地，所述柑橘加工废水中耐氨苄青霉素基因水平为8～10log拷贝数mL，耐四环素基因水平为8～10log拷贝数mL。进一步地，具体浓度为耐氨苄青霉素基因水平为8.48log拷贝数mL,耐四环素基因水平为8.68log拷贝数mL。优选地，所述低温等离子体处理为：采用双介质阻挡放电低温等离子体装置，先将2～4mL含有耐药基因的柑橘加工废水装入石英玻璃培养皿中，上介质与液面气隙距离为1.5～2.5mm。进一步地，所述的低温等离子体方法中优选采用双介质阻挡放电低温等离子体CTP-2000K型装置对含有耐药基因的柑橘加工废水进行处理，具体步骤：将3mL含有耐药基因的柑橘加工废水装入直径为50mm的石英玻璃培养皿中，上介质与液面气隙距离为2mm，对含有耐药基因的柑橘加工废水进行低温等离子体处理。优选地，所述低温等离子体处理的条件为：处理频率为13～14kHz,处理功率为55～69W，处理时间为4～6min，处理温度24～26℃。进一步优选地，所述低温等离子体处理的条件为：处理频率为14kHz,处理功率为57.7W，处理时间为4～6min，处理温度5℃。在上述优选的条件下，低温等离子体技术能够有效地降解柑橘加工废水中的耐药基因。4～6min的低温等离子体处理后，耐氨苄青霉素基因水平降解了1.74～3.26log拷贝数mL，耐四环素基因水平降解了2.16～3.14log拷贝数mL，实现98.2～99.9％的降解率。优选地，耐药基因水平的检测采用荧光定量PCR。在低温等离子体技术处理后，还包括以下检测步骤：取1mL处理后的含有耐药基因的柑橘加工废水用荧光定量聚合酶链反应技术进行检测，该聚合酶链反应体系含有10μL的2×聚合酶链反应预混溶液,各1μl正向和反向引物100μM,0.3μl含有耐药基因的柑橘加工废水和7.7μl去核酸酶的纯净水，反应条件为1个循环为95℃保持2min，40个循环为95℃保持5s，60℃保持15s和72℃保持60s，最后一个循环为65to95℃的溶解曲线。上述的荧光定量聚合酶链反应得到的循环数代入标准曲线方程即可得到耐药基因含量。本发明的实验证明，本发明开发了一种有效降解柑橘加工废水中耐药基因的方法，降低了耐药基因传播的可能性，进一步优化了废水处理工艺，有利于推广低温等离子体技术的产业应用。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步说明本发明。实施例1一低温等离子体技术处理1耐药基因悬浮液将大肠杆菌菌株DH5α接种于普通肉汤培养基中，37℃摇床培养至对数生长期。采用质粒小提试剂盒提取大肠杆菌中的还有耐氨苄青霉素和耐四环素基因的质粒，将耐氨苄青霉素和耐四环素基因溶解在柑橘加工废水的浓度为8～9log拷贝数mL。2低温等离子体处理实验组：用双介质阻挡放电低温等离子体CTP-2000K型装置对含有耐药基因的柑橘加工废水进行处理，具体步骤：将3mL含有耐药基因的柑橘加工废水装入直径为50mm的石英玻璃培养皿中，上介质与液面气隙距离为2mm，低温等离子体处理频率为14kHz,处理功率为57.7W，处理时间为4min,处理温度为25℃，最后得到处理后柑橘加工废水。对照组：含有耐药基因的柑橘加工废水不进行低温等离子体处理，只在室温下放置4min。二检测耐药基因含量的测定方法取1mL处理后的含有耐药基因的柑橘加工废水用荧光定量聚合酶链反应技术进行检测，该聚合酶链反应体系含有10μL的2×聚合酶链反应预混溶液,各1μL正向和反向引物100μM,0.3μL含有耐药基因的柑橘加工废水和7.7μL去核酸酶的纯净水，反应条件为1个循环为95℃保持2min，40个循环为95℃保持5s，60℃保持15s和72℃保持60s，最后一个循环为65to95℃的溶解曲线。上述的荧光定量聚合酶链反应得到的循环数代入标准曲线方程即可得到耐药基因含量。2×聚合酶链反应预混溶液：腺嘌呤脱氧核苷dATP200μmolL，鸟嘌呤脱氧核苷dGTP200μmolL，胞嘧啶脱氧核苷dCTP200μmolL，胸腺嘧啶脱氧核苷dTTP200μmolL，氯化镁1.5mmolL，TaqDNA聚合酶2U。标准曲线方程：将不同浓度的耐药基因9、8、7、6、5、4和3log拷贝数mL进行荧光定量聚合酶链反应，所得到的反应循环数作为纵坐标，耐药基因浓度作为横坐标，用origin软件进行线性拟合，得到线性回归方程即为标准曲线方程。结果如下：对照组耐氨苄青霉素基因水平为8.48log拷贝数mL，耐四环素基因水平为8.68log拷贝数mL。实验组耐氨苄青霉素基因水平为6.74log拷贝数mL，耐四环素基因水平为6.52log拷贝数mL。因此，耐氨苄青霉素基因水平降解1.74log拷贝数mL，降解率为98.2％，耐四环素基因水平降解为2.16log拷贝数mL，降解率为99.3％。降解率％＝[c0-ctc0]×100％其中，c0为初始耐药基因浓度拷贝数mL，ct为等离子体处理了t时间的耐药基因浓度拷贝数mL。由此可见，本发明的方法能有效降解了柑橘加工废水中耐药基因的比例，增强了加工废水的安全性。实施例2一低温等离子体技术处理1耐药基因悬浮液与实施例1中的一的步骤1的方法相同。2低温等离子体处理与实施例1中的一的步骤2的方法基本相同，仅将处理时间变为6min。二检测与实施例1中的二的方法相同。结果如下：对照组耐氨苄青霉素基因水平为8.48log拷贝数mL,耐四环素基因水平为8.68log拷贝数mL。实验组耐氨苄青霉素基因水平为5.22log拷贝数mL,耐四环素基因水平为5.55log拷贝数mL。因此，耐氨苄青霉素基因水平降解3.26log拷贝数mL，降解率为99.9％，耐四环素基因水平降解为3.14log拷贝数mL，降解率为99.9％。由此可见，本发明的方法在低温等离子体处理6min时有效降低了柑橘工业废水中耐药基因的比例。本实施例同实施例1相比，降解耐药基因的效果更好。对比例1本发明的方法处理时间为4～6min，当处理时间为2min时，对照组耐氨苄青霉素基因水平为8.48log拷贝数mL，耐四环素基因水平为8.68log拷贝数mL。实验组耐氨苄青霉素基因水平为8.25log拷贝数mL,耐四环素基因水平为8.41log拷贝数mL。因此，耐氨苄青霉素基因水平降解了0.24log拷贝数mL，降解率为42％，耐四环素基因水平降解了0.27log拷贝数mL，降解率为46.8％。这个条件下低温等离子体处理后的耐药基因降解效果不理想，降解率均低于50％。以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但本发明专利的技术特征并不局限于此，任何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

权利要求：1.一种有效降解柑橘加工废水中耐药基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用低温等离子体处理含耐药基因的柑橘加工废水，然后检测废水中的耐药基因水平；所述低温等离子体处理的条件为：处理频率为10～14kHz,处理功率为40～60W，处理时间为4～6min,处理温度为20～30℃。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述耐药基因为耐氨苄青霉素基因和或耐四环素基因。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述柑橘加工废水中耐氨苄青霉素基因水平为8～10log拷贝数mL，耐四环素基因水平为8～10log拷贝数mL。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述低温等离子体处理为：采用双介质阻挡放电低温等离子体装置，先将2～4mL含有耐药基因的柑橘加工废水装入石英玻璃培养皿中，上介质与液面气隙距离为1.5～2.5mm。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，耐药基因水平的检测采用荧光定量PCR。6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述低温等离子体处理的条件为：处理频率为13～14kHz,处理功率为55～69W，处理时间为4～6min，处理温度24～26℃。7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述低温等离子体处理的条件为：处理频率为14kHz,处理功率为57.7W，处理时间为4～6min，处理温度5℃。

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