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【发明授权】兼具改善耐药脑胶质瘤微环境及逆转耐药的脑靶向递药系统_中国人民解放军第四军医大学_201910594699.1 

申请/专利权人:中国人民解放军第四军医大学

申请日:2019-07-03

公开(公告)日:2020-07-21

公开(公告)号:CN110354096B

主分类号:A61K48/00(20060101)

分类号:A61K48/00(20060101);A61K9/51(20060101);A61K47/34(20170101);A61K47/24(20060101);A61K47/26(20060101);A61K31/7105(20060101);A61K31/4188(20060101);A61P35/00(20060101);C12N15/113(20100101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2020.07.21#授权;2019.11.15#实质审查的生效;2019.10.22#公开

摘要:本发明公开了一种兼具改善耐药脑胶质瘤微环境及逆转耐药的脑靶向递药系统。将小分子量的聚乙烯亚胺PEI通过二硫键枝接在聚天冬氨酸PASP侧链,合成新型阳离子聚合物PASP‑g‑PEI,用于压缩siPD‑L1。以siPD‑L1与PASP‑g‑PEI形成的复合物为核,以2‑脱氧葡萄糖Glu修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇DSPE‑PEG、胆固醇及二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE等构成的脂质薄膜为外层壳,采用薄膜分散法制备共载siPD‑L1及TMZ的核壳形脂质聚合物纳米粒TMZsiPD‑L1@GLPNPASP‑g‑PEI,通过葡萄糖转运体介导穿过血脑屏障并进入耐药脑胶质瘤细胞,在耐药脑胶质瘤细胞浆中高GSH浓度条件下迅速释放裸siPD‑L1和TMZ,沉默耐TMZ脑胶质瘤细胞中PD‑L1的表达,阻断耐TMZ脑胶质瘤内PD‑1PD‑L1通路,激活机体免疫系统对脑胶质瘤的杀伤作用,同时降低MGMT的表达,提高耐TMZ脑胶质瘤细胞对TMZ的敏感性,双重途径抑制耐药脑胶质瘤的生长。

主权项:1.一种共载siPD-L1和替莫唑胺核壳形脂质聚合物纳米粒的制备方法,其特征是将分子量为1800Da的聚乙烯亚胺通过二硫键枝接在聚天冬氨酸侧链,合成新型阳离子聚合物PASP-g-PEI,用于压缩siPD-L1;以siPD-L1与PASP-g-PEI形成的复合物为核,以2-脱氧葡萄糖修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、胆固醇及二油酰磷脂酰乙醇胺构成的脂质薄膜为外层壳,将饱和TMZ水溶液加入到脂质薄膜中,采用薄膜分散法制备共载siPD-L1及TMZ的核壳形成脂质聚合物纳米粒TMZsiPD-L1@GLPN;所述脂质聚合物纳米粒TMZsiPD-L1@GLPN通过葡萄糖转运体介导穿过血脑屏障并进入耐药脑胶质瘤细胞,在耐药脑胶质瘤细胞浆中高GSH浓度条件下迅速释放裸siPD-L1和TMZ,沉默耐TMZ脑胶质瘤细胞中PD-L1的表达,阻断耐TMZ脑胶质瘤内PD-1PD-L1通路,激活机体免疫系统对脑胶质瘤的杀伤作用,同时降低MGMT的表达,提高耐TMZ脑胶质瘤细胞对TMZ的敏感性,双重途径抑制耐药脑胶质瘤的生长;其中siPD-L1序列如SEQID:No.1所示;TMZ为替莫唑胺;MGMT为O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶;GSH为谷胱甘肽。

全文数据:兼具改善耐药脑胶质瘤微环境及逆转耐药的脑靶向递药系统技术领域本发明涉及一种新型脑靶向递药系统,该递药系统既能够沉默耐药脑胶质瘤细胞内PD-L1的表达,改善耐药脑胶质瘤免疫微环境,而且能够降低耐药脑胶质瘤细胞内MGMT的含量,逆转耐药脑胶质瘤对替莫唑胺耐药。背景技术恶性脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤。临床研究表明,在标准化治疗中给予3个疗程的替莫唑胺TMZ后,脑胶质瘤对TMZ便会产生明显的耐药,是化疗失败的主要原因。开发能够有效治疗耐TMZ脑胶质瘤的新方法是临床的迫切需求。研究显示,O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶MGMT的过表达、碱基切除修复BER和DNA错配修复MMR是脑胶质瘤对TMZ耐药的重要原因。然而,最新研究发现,脑胶质瘤对TMZ的耐药不仅与脑胶质瘤自身基因表达相关,肿瘤微环境也促进了耐药的产生。我们发现程序性死亡受体-1PD-1的配体PD-L1在耐TMZ脑胶质瘤细胞高表达。据报道,PD-L1高表达会导致PD-1PD-L1信号通路持续激活,使肿瘤细胞逃避机体免疫系统的监视和杀伤,促进肿瘤的生长,加剧了肿瘤耐药。我们发现,当采用特定序列的siRNAsiPD-L1抑制耐TMZ脑胶质瘤细胞PD-L1的表达后,耐TMZ脑胶质瘤细胞中耐药蛋白MGMT的表达会明显降低,TMZ对耐药脑胶质瘤的抑制作用明显增强。上述结果提示,通过PD-L1特异的siPD-L1沉默耐TMZ脑胶质瘤中PD-L1的表达,不仅能抑制肿瘤微环境中PD-1PD-L1通路,提高机体免疫系统对脑胶质瘤的杀伤作用,而且还能通过降低MGMT的表达提高耐TMZ脑胶质瘤细胞对TMZ的敏感性,增强TMZ对耐药脑胶质瘤细胞的毒性,双重途径抑制耐药脑胶质瘤的生长,提高对耐药脑胶质瘤的治疗效果。然而,siPD-L1在血液循环中不稳定,容易被体内的RNA酶降解,被肾脏迅速清除,加之体内诸多生物屏障如血脑屏障对siPD-L1转运的阻碍作用,极大的限制了siPD-L1在脑胶质瘤中的蓄积。如何使siPD-L1在血液循环中稳定,顺利穿过血脑屏障,并高效地进入耐TMZ脑胶质瘤细胞浆发挥基因沉默效应,是其治疗耐TMZ脑胶质瘤的关键。研究发现,2-脱氧葡萄糖能特异性地与脑毛细血管内皮细胞表面的葡萄糖转运体结合,介导纳米粒穿过血脑屏障,在脑组织内蓄积。此外,在脑胶质瘤细胞表面,葡萄糖转运体高表达,这提示2-脱氧葡萄糖修饰的纳米粒可以通过葡萄糖转运体介导,高效地进入脑胶质瘤细胞内。用于siRNA递送的阳离子聚合物载体材料主要包括聚乙烯亚胺PEI和聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM等。PEI存在大量的质子化氨基,可以通过静电作用有效压缩siRNA,但是PEI因其较高的分子量和较大的使用剂量而具有明显的毒性,降低PEI的分子量虽然能够减小PEI的毒性,但同样也降低了PEI压缩siRNA的能力。因此,如何提高基因递送效率,降低基因传递载体材料的毒性是目前siRNA递送载体材料研究的热点。纳米粒进入肿瘤细胞后,要能够在细胞浆中迅速释放出游离siRNA,才能发挥应有的基因沉默效应。研究表明,脑胶质瘤细胞浆中谷胱甘肽GSH的浓度是细胞外浓度的100~1000倍,这为环境响应肿瘤细胞浆内释药提供了新的思路。由于二硫键在低浓度的GSH环境中非常稳定,在高浓度的GSH环境中会发生断裂,因此,通过二硫键将小分子量的PEI枝接在聚天冬氨酸的侧链,既可保证基因传递载体材料对siRNA的压缩能力,而且还有望降低基因传递载体材料的体内外毒性,更重要的是这种基因传递载体材料还具有氧化还原特性,能在脑胶质瘤细胞浆中高浓度GSH环境下解聚,失去对siRNA的复合能力,迅速解离出siRNA,发挥基因沉默效应。发明内容基于以上研究背景,本发明的目的是筛选出一个能够阻断耐药脑胶质瘤微环境中PD-1PD-L1信号通路并能逆转耐药脑胶质瘤耐药特性的siPD-L1序列,并制备共载siPD-L1和TMZ的脂质聚合物纳米粒。该纳米粒能够通过脑毛细血管内皮细胞表面的葡萄糖转运体介导穿过血脑屏障并高效进入耐药脑胶质瘤细胞,释放siPD-L1和TMZ,沉默耐药脑胶质瘤细胞中PD-L1的表达,增强机体免疫系统对脑胶质瘤的杀伤作用,同时降低MGMT的表达,提高耐药脑胶质瘤对TMZ的敏感性,以双重途径抑制耐药脑胶质瘤的生长。基于以上研究背景,本发明的技术方案是:①设计合成了一个siPD-L1序列,序列号为:cd274-mus-362正义链:5′-GAAGGGAAAUGCUGCCCUUTT-3′,反义链:5′-AAGGGCAUUUCCCUUCTT-3′,该序列不仅能够沉默耐药脑胶质瘤细胞中PD-L1的表达、阻断耐药脑胶质瘤微环境中PD-1PD-L1信号通路、增强机体免疫系统对脑胶质瘤的杀伤作用,同时还能降低MGMT的表达,提高耐药脑胶质瘤对TMZ的敏感性。②构建了一种共载siPD-L1和替莫唑胺核壳形脂质聚合物纳米粒。将小分子量的聚乙烯亚胺PEI通过二硫键枝接在聚天冬氨酸PASP侧链,合成新型阳离子聚合物PASP-g-PEI,用于压缩siPD-L1。以siPD-L1与PASP-g-PEI形成的复合物为核,以2-脱氧葡萄糖Glu修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG、胆固醇及二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE等构成的脂质薄膜为外层壳,采用薄膜分散法制备共载siPD-L1及TMZ的核壳形脂质聚合物纳米粒TMZsiPD-L1@GLPNPASP-g-PEI,通过葡萄糖转运体介导穿过血脑屏障并进入耐药脑胶质瘤细胞,在耐药脑胶质瘤细胞浆中高GSH浓度条件下迅速释放裸siPD-L1和TMZ,沉默耐TMZ脑胶质瘤细胞中PD-L1的表达,阻断耐TMZ脑胶质瘤内PD-1PD-L1通路,激活机体免疫系统对脑胶质瘤的杀伤作用,同时降低MGMT的表达,提高耐TMZ脑胶质瘤细胞对TMZ的敏感性,双重途径抑制耐药脑胶质瘤的生长。本发明的创新性:①设计合成了一个siPD-L1序列,该siPD-L1不仅能够沉默耐药脑胶质瘤细胞内PD-L1的表达,阻断耐药脑胶质瘤微环境中PD-1PD-L1信号通路,而且能够降低耐药脑胶质瘤细胞内MGMT的表达,逆转耐药脑胶质瘤对TMZ的耐药。②构建了一种能够高效穿过血脑屏障,并将siPD-L1直接递送到耐药脑胶质瘤细胞浆内的脑靶向递药系统。附图说明图1是C6TR细胞及C6细胞中PD-L1的表达。n=3,**P中国人民解放军第四军医大学兼具改善耐药脑胶质瘤微环境及逆转耐药的脑靶向递药系统2SIPOSequenceListing1.0121RNA人工序列未知misc_RNA10,13,18,19y=tu或c1gaagggaaaygcygcccyytt21218RNA人工序列未知misc_RNA8,9,10,14,15y=tu或c2aagggcayyycccyyctt18

权利要求:1.一个siPD-L1序列,其特征是序列如SEQID:No.1所示。2.一种共载siPD-L1和替莫唑胺核壳形脂质聚合物纳米粒的制备方法,其特征是将小分子量的聚乙烯亚胺PEI通过二硫键枝接在聚天冬氨酸PASP侧链,合成新型阳离子聚合物PASP-g-PEI,用于压缩siPD-L1;以siPD-L1与PASP-g-PEI形成的复合物为核,以2-脱氧葡萄糖Glu修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG、胆固醇及二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE构成的脂质薄膜为外层壳,采用薄膜分散法制备共载siPD-L1及TMZ的核壳形脂质聚合物纳米粒TMZsiPD-L1@GLPNPASP-g-PEI,通过葡萄糖转运体介导穿过血脑屏障并进入耐药脑胶质瘤细胞,在耐药脑胶质瘤细胞浆中高GSH浓度条件下迅速释放裸siPD-L1和TMZ,沉默耐TMZ脑胶质瘤细胞中PD-L1的表达,阻断耐TMZ脑胶质瘤内PD-1PD-L1通路,激活机体免疫系统对脑胶质瘤的杀伤作用,同时降低MGMT的表达,提高耐TMZ脑胶质瘤细胞对TMZ的敏感性,双重途径抑制耐药脑胶质瘤的生长。3.一种共载siPD-L1和替莫唑胺核壳形脂质聚合物纳米粒在制备耐药脑胶质瘤药物中的应用。

百度查询: 中国人民解放军第四军医大学 兼具改善耐药脑胶质瘤微环境及逆转耐药的脑靶向递药系统

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